ターゲットエンリッチメントワークフローを使用した臨床サンプルからの全細菌ゲノムの生成

サマリー

ここでは、標的濃縮を使用して、臨床サンプルからの細菌性感染症の全ゲノム配列決定を可能にするプロトコルを提示します。この新しい症候群パネルベースの方法は、豊富なヒト DNA と低い細菌量という課題を克服し、 クラミジア トラコマチス、 淋菌、梅 毒トレポネーマ、 マイコプラズマ ジェニタリウムのゲノム監視を容易にします。

要約

細菌性感染症(STI)の完全なゲノムを臨床サンプルから直接取得することは、ヒトDNA、微生物叢の存在、および細菌病原体の負荷が非常に低いため、困難です。これらの種は気難しいため、培養は選択肢にないことが多く、ほとんどのサンプルは微生物を溶解する輸送培地で採取され、培養に耐えられません。これらの問題に対処するために、4つの種にわたって設計されたプローブパネルを使用して細菌性感染症の全ゲノム配列を生成し、ゲノム配列決定の前に2〜3日間のハイブリダイゼーション手順であるターゲットエンリッチメントを実行しました。私たちの最初の結果は、直接配列決定が成功しなかったサンプルを使用して優れたゲノムデータを生成しました。標的濃縮は、特に病原体負荷が高い場合に、細菌のSTIゲノムの配列決定に非常に効果的であることが証明されました(Ct < 30)。 マイコプラズマ・ジェニタリウム を含む検査サンプルは、Ct値が30を超えることが多く、ゲノム回復の成功率が低下しました。ハイブリダイゼーション温度を65°Cから62.5°Cに最適化した後、改善が観察されています。 ゲノム監視を可能にすることに加えて、完全なゲノムが利用可能になると、 淋菌に関連する後天性耐性決定因子の特定など、抗菌薬耐性に関する貴重な洞察が得られます。この方法はすでにブエノスアイレスにおけるクラ ミジア・トラコマチス 性病リンパ肉芽腫の新しい系統である ompA遺伝子型L4の同定につながり、新しいゲノムの多様性を明らかにし、性感染症の監視を改善するためのこのアプローチの可能性を浮き彫りにしています。

概要

次世代シーケンシング (NGS) 技術の出現により、細菌の全ゲノムシーケンシング (WGS) が容易になり、多くの種のヒト細菌病原体内の臨床分離株のシーケンシングが可能になりました。この技術により、前例のない規模で完全なゲノムを生成することで、数多くの比較研究が可能になりました。WGSを通じて臨床サンプルのゲノムデータにアクセスすることで、抗菌薬耐性遺伝子のタイピングと検出が可能になるため、これは臨床および公衆衛生微生物学に大きな影響を与えています。さらに、メタゲノムアプローチにより、臨床サンプルから疾患関連病原体を直接検出できます。このような情報は、患者に個別化された治療戦略の新たな機会を生み出します。さらに、WGSは、特定の病原体の循環株の進化とその伝播パターンに関する洞察を提供する強力なツールであり、公衆衛生当局が病原体の発生をよりよく理解し、対応できるようにします^1,2,3。

WGSの十分なシーケンシング品質を達成するには、通常、必要な微生物DNA量を得るために培養による細菌単離が必要です^4,5,6。これは、培養が困難な微生物、実行不可能な診断サンプル処理のために培養できない微生物、または患者の治療中に抗生物質にさらされた微生物にとって制限要因を表しています。このような培養が困難な微生物の例としては、クラミジア・トラコマチス、淋菌、梅毒トレポネーマ、マイコプラズマ・ジェニタリウム^7,8,9などの性感染症の細菌病原体が挙げられる。これらの種は、細胞内の性質、脆弱性、厳格な成長要件、複製速度の遅さなど、いくつかの要因により培養が困難です。これらの理由から、患者サンプルでよくあるように、DNA含有量が少ないにもかかわらずWGSを可能にする技術の開発と実装は、臨床現場でゲノム解析を行うために重要です。

ターゲット濃縮は、微生物DNAが不足している場合のゲノム配列決定のための最も有望な方法です¹⁰。たとえば、性感染症 (STI) を引き起こす病原体の場合、患者サンプル中に存在する DNA のごく一部のみが病原体に由来します。C.トラコマチス感染症の場合、病原体DNAは全DNAの最大0.6%を占めることがわかっていますが、値は通常はるかに低くなります¹¹。ターゲット濃縮法は、NGSの前に目的の微生物DNAを選択的に捕捉することで構成されます。これは、標的微生物DNAを補完する特別に設計されたビオチンタグ付きRNAプローブを使用して達成されます。アダプターライゲーションは、ハイブリダイゼーションの前にゲノムライブラリを生成するために実行され、その間にこれらのプローブは相補的な微生物DNAに結合します。続いて、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを使用して、ビオチンとストレプトアビジンの強力な相互作用を利用して、ビオチン標識核酸複合体を捕捉します。最後に、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、選択されたDNA断片が増幅されます。これらの主要な概念的ステップは、ターゲットエンリッチメント戦略を理解するために必要です。ただし、洗浄や品質管理などの追加の手順ステップも完全なプロトコルに含まれます^10,12。

シーケンシングプロトコルを開始する前に、入力DNAの量を評価し、ワークフロー全体の条件でその完全性が維持されていることを確認することが重要です。メーカーの推奨によると、標準プロトコルでは、約1.4〜28.6 ng / μLの濃度範囲に相当する7 μLの容量で10〜200 ngのDNAが必要です。DNA濃度が低い場合は、必要なインプット量を維持しながら0.6〜11.8 ng / μLの濃度を可能にする17 μLを使用したプロトコルの修正バージョンが推奨されます¹²。臨床検体から得られる濃度が低いことが多いため、17 μLプロトコルバリアントを日常的に実施しました。ハイブリダイゼーションとシーケンシングのパフォーマンスはDNAの品質に関連しており、核酸の完全性を維持するための適切なサンプル保管および輸送条件の重要性を強調しています。したがって、収集培地の安定化、迅速な処理、コールドチェーン条件の維持、凍結融解サイクルの最小化などの適切な取り扱い方法は、DNA 品質を最適化するための重要な手段です。必要なDNA濃度と同様に、DNAフラグメントの長さは完全性の指標です。より長いフラグメントを取得し、シーケンシング結果を最適化するために、サンプルの取り扱いおよび保管中のDNA分解を最小限に抑えることをお勧めします。これは、収集方法、培地、取り扱いにばらつきが一般的である臨床現場に特に関係します。このプロトコルを、代表的な結果に詳述されているように、平均フラグメント長が1kbまでの2-SP培地とNAAT輸送培地の両方から抽出されたDNAに適用することに成功しました。最後に、シーケンシングの成功は、平均リード深度が^10x10を超える95%以上のゲノムカバレッジを達成することと定義されました。

現在までに、標的濃縮は、性感染症を引き起こす病原体、ノロウイルス、家畜ウイルス、植物病原体など、幅広い微生物やウイルスにさまざまな研究グループによって適用されてきました 10,13,14,15,16。しかし、これまでのところ、プローブ設計は一般に、複数の症候群に関連した病原体の完全なゲノムを標的とするパネルではなく、単一の病原体に限定されてきました。理想的な標的は、実際にC.trachomatis、T.pallidum、およびM.genitaliumを含む、小さく保存されたゲノムを持つ生物です。淋菌はより多様なゲノムとより大きな汎ゲノムを持っていますが、それをカバーするプローブは、他の3つの細菌との設計で合理化することができます。これらの細菌間で%G+Cにいくらかの相違があり、他の細菌は症候群に関連している可能性があるため、条件を最適化する必要がある可能性があります。

このプロトコルの目標は、臨床サンプルから直接完全なゲノムを取得して、系統発生的および疫学的分析を可能にすることです。C. trachomatis、N. 淋病、T. pallidum、M. genitalium に合わせたプローブ パネルを使用して、泌尿生殖器および肛門直腸スワブなどの臨床サンプルから抽出された DNA を使用して完全なゲノムを回収する、新規で効果的な戦略を実証します。このアプローチは成功していることが示されており、ブエノスアイレスでの性病リンパ肉芽腫(LGV)の発生の特徴付けに適用され、C.トラコマチスLGVの新しい系統の記述を可能にしました^10,13。

C . trachomatis、淋菌、梅毒菌 、および/または M. genitalium と診断された患者の臨床サンプルから直接完全なゲノムを取得するために採用される、次世代シーケンシング (NGS) のためのキャプチャ後プーリングを備えた市販の DNA キャプチャー法の使用を含む、ターゲット濃縮手順について説明します感染 症。最適な成功を得るには、Ct 値が高いほど病原体負荷が低く、完全なゲノムが得られる可能性が低いため、Ct 値が 30 未満のサンプルを選択することをお勧めします。この方法のDNA抽出物は、さまざまなサンプルタイプおよび収集培地の臨床サンプルから得ることができます。DNA抽出手順は、ヒトスワブサンプルから病原体またはウイルスDNAを分離するために設計されたキットを使用して、手動または自動システムを使用して実行できます( 材料表を参照)。

ターゲット濃縮手順で使用されたプローブセット( 材料表を参照)は 、C. trachomatis、N. 淋病、T. pallidum、 および M. genitaliumのゲノム多様性を捕捉するように特別に設計されました。カスタムプローブは、種ごとに複数の完全なゲノムを使用して生成され、既知の汎ゲノム¹⁰のカバレッジが最適化されました。設計基準には、リファレンス配列に対する90%の最小配列相同性と、ターゲットキャプチャ効率を高めるための1x〜2xのタイリング頻度が含まれていました。費用対効果を最適化するために、プローブ設計に使用されたアルゴリズムは、包括的なゲノム表現を維持しながらプローブの数を最小限に抑えました。最終的なプローブセットは 、C. trachomatis、N. 淋菌、M. genitalium、および T. pallidum を標的とするマルチプレックス デザイン用の 242,000 プローブで構成されていました。ターゲットエンリッチメントプロトコル全体は、2〜3日で実行できます。停止ポイントの明確な表示は、2 日間と 3 日間の両方のワークフロー オプションで提供されます。

倫理声明
この研究は、以前に公開されたプロトコル^10,13 に基づいて方法論的改善を提案しています。説明されている手順には、匿名化されたサンプルのみが含まれており、患者データは含まれていません。したがって、方法論的側面については、特定の倫理的承認は必要ありませんでした。代表的な結果は、以前に研究されたサンプルの 2 セットから得られました: 承認されたプロトコル Detección de C. trachomatis en pacientes con rectitis infecciosa: prevalencia y tipificación (Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires、承認番号 201723)、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得て。匿名化されたフィンランドのサンプルは、特定の倫理的承認を必要としませんでした。結果のシーケンスデータをデータベースに送信する前に、ヒューマンリードを削除する必要があります。

プロトコル

注:作業スペースは、汚染を防ぐために、PCR前ゾーン(アンプリコンフリーワークスペース)とPCR後ゾーン(アンプリコン処理ワークスペース)に分割する必要があります。特に明記されていない限り、すべてのステップは、2 つの制御されたワークスペースのいずれかで実行する必要があります。すべてのマスターミックスとPCR反応ミックスは、アンプリコンフリーのワークスペースで調製する必要がありますが、増幅されたDNAを含むすべての後続のステップは、アンプリコン処理のワークスペースで実施する必要があります。このプロトコルのすべての量は、8つのサンプルを処理するために計算されます。

1. DNA断片化

1. 高感度で正確な蛍光ベースの方法(二本鎖DNA[dsDNA]アッセイ、1 μLのサンプルを使用し、検出範囲は最大120 ng/μL、 材料表を参照)を使用して、標的病原体DNA(DNA)を含む臨床サンプルからのDNA抽出物のDNA濃度を測定します。この定量法は、DNA濃度が測定されるたびに、プロトコル全体で一貫して使用されます。
2. ヌクレアーゼフリーの水を使用して各DNAサンプルを10〜200 ngの濃度に希釈し、各PCRチューブストリップの最終容量を17 μLにします。最適なシーケンシング結果を得るには、推奨範囲内で可能な限り多くのインプットDNAを使用します。
   注:総DNA濃度が17 μLで推奨される最小値である10 ngを下回っている場合は、メーカーが提案するように、バックグラウンドDNA(ヒトゲノムDNAなど)の補給を使用して、入力要件を満たすことができます。これは、ライブラリ調製反応を安定化し、低インプット臨床サンプルのシーケンシング性能を向上させるのに役立ちます。
3. フラグメンテーションバッファー(5x)を解凍し、ボルテックスし、氷の上に置きます。
4. 表1に従ってサーマルサイクラーをプログラムします。プログラムを開始し、すぐに一時停止します。
   注:37°Cインキュベーションステップの期間は、初期DNAフラグメントサイズと目的のNGSリード長によって異なる場合があります。高品質のDNAサンプルの場合、2 100xリードに適した150〜200 bpのフラグメントを得るには15分のインキュベーション時間、2 150xリードに適した180〜250 bpのフラグメントを得るには10分のインキュベーション時間が推奨されます。
5. フラグメンテーションマスターミックスに必要なバイアルを-20°Cの保管場所から取り出します。 表2に基づいてマスターミックスを調製します。チューブとボルテックスを高速で5〜10秒間密閉します。短時間回転させて泡を取り除き、マスターミックスを氷の上に保ちます。
6. 17 μLのインプットDNAを含む各ウェルに3 μLのフラグメンテーションマスターミックスを加えます。上下に20回ピペッティングして混合し、PCRチューブストリップを密封し、高速で5〜10秒間ボルテックスし、短時間回転させます。
7. PCRチューブストリップをサーマルサイクラーに入れ( 材料表を参照)、ステップ1の冒頭で 表1に示すプログラムを再開します。
8. 4°Cのホールドステップに達したら、PCRチューブストリップをサーマルサイクラーから取り外し、30 μLのヌクレアーゼフリー水を加えます。PCRチューブストリップを氷の上に置きます。

表 1:酵素的フラグメンテーションのためのサーマルサイクラープログラム。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表 2:フラグメンテーションマスターミックスの調製この 表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

2. ライブラリーの準備

1. ライゲーションマスターミックスの調製
   注:ライゲーションマスターミックスは、室温に平衡化するのに30〜45分かかるため、この時点で調製する必要があります。
   1. -20°Cの保管からライゲーションバッファーを取り出し、氷上で解凍します。-20°Cの保管庫からT4 DNAリガーゼを取り出し、バイアルを反転させて混合し、氷上に置いておく。
   2. 表3に従ってライゲーションマスターミックスを調製します。チューブとボルテックスを高速で10〜20秒間密閉し、短時間回転させ、使用前に室温で30〜45分間保持します。
2. エンド修復とdAテールフラグメント
   1. 表4に従ってサーマルサイクラーをプログラムします。
   2. -20°Cの保管からエンドリペアテーリングバッファーを取り出し、氷上で解凍します。解凍したら、高速で渦を巻き、短時間回転します。エンドリペアを回収します-テーリング酵素ミックス、バイアルを反転させて混合し、氷の上に置いてください。
   3. 表5に従ってエンドリペア/dAテーリングマスターミックスを調製します( 材料表を参照)。チューブとボルテックスを高速で10〜20秒間しっかりと密閉して混合し、短時間回転させ、氷の上で保持します。
   4. 20 μLの末端修復/dAテーリングマスターミックスを、50 μLのDNAフラグメントを含む各ウェルにピペットで移動します(ステップ1.1〜1.8から)。PCRチューブストリップを密封し、5〜10秒間高速でボルテックスして完全に混合します。PCRチューブストリップを短時間回転させ、サーモサイクラーに入れます。 表4のプログラムを再開します。
3. MBCタグ付きアダプターのライゲーション
   1. 表4のプログラムが最終ステップを完了したら、PCRチューブストリップを氷の上に置きます。表6のパラメータに従ってサーマルサイクラーをセットアップします。プログラムを起動し、すぐに一時停止します。
   2. ステップ2.1で調製した各サンプルに25 μLの室温ライゲーションマスターミックスを加えます。PCRチューブストリップを密封し、5〜10秒間ボルテックスし、短時間回転させます。
   3. MBCタグ付きライブラリー用のアダプターオリゴミックス( 材料 表を参照)を-20°Cの保存から取り出し、氷上で解凍します。解凍したら、5〜10秒間高速で渦を巻きます。短く回転させて氷の上に置きます。
   4. MBCタグ付きライブラリー用のアダプターオリゴミックスを各サンプルに5 μL添加します。PCRチューブストリップをシールし、高速で5〜10秒間ボルテックスし、短時間回転させます。すぐにPCRチューブストリップをサーマルサイクラーに入れ、 表6に指定されているようにプログラムの実行を続行します。
4. 結紮のクリーンアップ
   1. 磁気ビーズを使用してDNA精製を行います。4°Cの保管場所からビーズを取り出し、使用前に室温に到達させます。
   2. ヌクレアーゼフリーの水を使用して4 mLの70%エタノールを調製します。室温で保管してください。
      注: 最適なパフォーマンスを確保するために、クリーンアップ手順で使用する 70% エタノール溶液を新たに調製することを強くお勧めします。70%エタノールの調製には、使用直前にヌクレアーゼフリーの水を使用してください。
   3. 混合物が均一になり、色が一貫するまで磁気ビーズ懸濁液を完全に渦にします。
   4. 表6のプログラムが4°Cホールドステップに達したら、PCRチューブストリップをサーマルサイクラーから室温に移します。各ウェルに80 μLのビーズ懸濁液を加えます。PCRチューブストリップを密封し、5〜10秒間ボルテックスし、短時間回転させます。
   5. ビーズ懸濁液を室温で5分間インキュベートします。PCRチューブストリップを磁気スタンドに移し( 材料表を参照)、溶液が透明になるまで5〜10分待ちます。
   6. PCRチューブストリップを磁気スタンドに保持しながら、ビーズとの接触を避けながら、クリアした溶液を各ウェルから慎重に取り出して廃棄します。
   7. PCRチューブストリップを磁気スタンドに取り付けて、次の方法で70%エタノールで2回洗浄します:各サンプルに200 μLの70%エタノールを加えます。1分間待ってから、70%エタノールを取り除きます。溶液を取り除くときはビーズに触れないようにしてください。
   8. 2回目の洗浄後、PCRチューブストリップを密封し、サンプルを短時間回転させて残留エタノールを収集します。PCRチューブストリップを磁気スタンドに30秒間置きます。
   9. ビーズに触れないようにしながら、収集したエタノールを取り除きます。残留エタノールを除去するには、PCRチューブストリップを磁気スタンドから取り外し、密封を解除して(理想的にはフード内に)最大5分間保持します。ビーズが完全に乾燥しているが、外観にひびが入っていないことを確認してください。これにより、溶出プロセスの効率が低下します。
   10. 各サンプルウェルに35 μLのヌクレアーゼフリー水を加えてDNAを溶出します。ピペッティングを上下に10〜15回完全に混合し、チューブを密閉し、5〜10秒間ボルテックスします。目に見える塊がないことを確認します。ある場合は、溶解するまで渦を巻きます。
   11. サンプルを室温で5分間インキュベートします。PCRチューブストリップを磁気スタンドに置き、溶液が透明になるまで約5分間待ちます。
   12. クリアした上清(~34 μL)を各ウェルから慎重に除去し、新鮮なPCRチューブストリップ内の対応するウェルに移します。サンプルを氷の上に置き、ビーズを捨てます。
       注: 3 日間のプロトコルの場合、これは 1 日目の終了を示します。サンプルを4°Cで一晩保存します。
5. 増幅とデュアルインデックス
   注:シーケンシング中に適切な識別を確実にするために、各サンプルに適切なインデックスプライマーペアを選択してください。各インデックス配列は、プレキャプチャライブラリーの増幅に使用されるプライマー内に組み込まれた8 bpタグで構成されています。
   1. dNTP(5x)を含む高忠実度DNAポリメラーゼバッファーを-20°Cの保存から取り出し、氷上で解凍します。選択したインデックス付きシーケンシングプライマーを-20°Cの保管場所から取り出し、氷上に保管します。
      注: シーケンスプロセス全体を通じて正確な識別とトレーサビリティを実現するために、各サンプルに割り当てられた特定のバーコードを必ず記録してください。
   2. 表7に従ってサーマルサイクラーをプログラムします。プログラムを開始し、すぐに一時停止します。
      注:メーカーは、入力DNAの質と量に応じて、8〜14回のプレキャプチャPCRサイクルを実行することを推奨しています。このプロトコルでは、メーカーの推奨に従って11サイクルが実装され、高品質のシーケンスデータ^10,12が得られました。
   3. PCR増幅用の高忠実度融合酵素を-20°C保存から回収します。過度の撹拌を避けながら酵素を上下にピペットで移動して混合し、忠実度の高いDNAポリメラーゼバッファーをボルテックスして均質性を確保します。プレキャプチャPCR反応ミックスを調製します( 表8を参照)。最終的なミックスを渦に巻き込み、一瞬スピンダウンし、氷の上に置いたままにします。
   4. 11 μLのプレキャプチャPCR反応ミックス( 表8に記載されているように調製)を、精製されたDNAライブラリを含む各サンプルウェルに分注します。選択したインデックスプライマーペアを各反応に5 μL加えます。PCRチューブストリップを5秒間密封し、ボルテックスしてから、すばやくスピンダウンします。
   5. 表 7 に指定されているように、サーマルサイクラープログラムを再開します。温度が98°Cに達したら、PCRチューブストリップをサーマルサイクラーに入れ、蓋をしっかりと閉めます。
6. 図書館のクリーンアップ
   1. 使用前に、磁気ビーズを少なくとも30分間室温に平衡化させてください。ヌクレアーゼフリーの水を使用して4 mLの70%エタノールを調製します。室温で保管してください。
   2. 混合物が均一になり、色が一貫するまで磁気ビーズ懸濁液を完全に渦にします。
   3. 表7のプログラムが4°Cホールドステップに達したら、PCRチューブストリップをサーマルサイクラーから室温に移します。各サンプルに50 μLのビーズ懸濁液を加えます。PCRチューブストリップを密封し、5〜10秒間ボルテックスし、短時間回転させます(磁気ビーズをペレット化せずに)。
   4. ビーズ懸濁液を室温で5分間インキュベートします。PCRチューブストリップを磁気スタンドに移し、溶液が透明になるまで5〜10分待ちます。
   5. PCRチューブストリップを磁気スタンドに保持したまま、各ウェルから透明な溶液を慎重に取り外して廃棄します。溶液を取り除くときはビーズに触れないようにしてください。
   6. PCRチューブストリップを磁気スタンドに装着し、以下の方法で70%エタノールで2回洗浄します。各サンプルに200 μLの70%エタノールを加えます。1分間待ってから、70%エタノールを取り除きます。溶液を取り除くときはビーズに触れないようにしてください。
   7. 2回目の洗浄後、PCRチューブストリップを密封し、短時間回転させて残留エタノールを収集します。PCRチューブストリップを磁気スタンドに30秒間置きます。ビーズに触れないようにしながら、残留エタノールを取り除きます。
   8. 残留エタノールを除去するには、PCRチューブストリップを磁気スタンドから取り外し、密封を解除して(理想的にはフード内に)最大5分間保持します。ビーズが完全に乾燥しているが、溶出プロセスの効率が低下するため、外観にひびが入っていないことを確認してください。
   9. 各サンプルチューブに15 μLのヌクレアーゼフリー水を加えて、ライブラリDNAを溶出します。ピペッティングを上下に10〜15回して完全に混合し、PCRチューブストリップを密封し、5〜10秒間ボルテックスします。目に見える塊がないことを確認します。ある場合は、溶解するまで渦を巻きます。
   10. サンプルを室温で5分間インキュベートします。PCRチューブストリップを磁気スタンドに置き、溶液が透明になるまで約5分間待ちます。
   11. クリアした上清(~15 μL)を各ウェルから慎重に除去し、新鮮なPCRチューブストリップ内の対応するウェルに移します。サンプルを氷の上に置き、ビーズを捨てます。
7. 品質管理
   1. 精製されたライブラリーDNAのDNA濃度を測定します。感度が高いため、蛍光ベースの方法を使用して 1 μL の DNA を定量します。

表 3:ライゲーションマスターミックスの調製。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表 4:エンドリペア/dAテーリング用のサーマルサイクラープログラム。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表 5:エンドリペア/dAテーリングマスターミックスの調製。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表 6 結紮用のサーマルサイクラープログラム。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表 7:プレキャプチャPCRサーマルサイクラープログラム。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表 8:プレキャプチャPCR反応混合物の調製。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

3. サンプルハイブリダイゼーション/キャプチャー

1. プローブするハイブリダイゼーションライブラリ
   1. 表9に従ってサーマルサイクラーをプログラムします。プログラムを開始し、すぐに一時停止します。
      注:メーカーは65°Cのハイブリダイゼーション温度を推奨しています。 この温度を62.5°Cに下げ、結果を改善しました。
   2. -20°Cの保管からハイブリダイゼーションバッファーを取り出し、氷上で解凍し、使用するまで室温で保管します。RNase遮断薬とオリゴヌクレオチド遮断薬混合物の両方を-20°Cの保管から取り出し、氷上で解凍します。これらのバイアルは、使用するまで氷の上に保管してください。
   3. ステップ2.7で測定したDNA濃度に基づいて、各サンプルに500〜1000 ngのDNAライブラリーを含むために必要な量を計算します。計算された容量を新しいPCRチューブストリップに移し、ヌクレアーゼフリーの水で総容量を12 μLに調整します。
   4. オリゴヌクレオチドブロッカー混合物をボルテックスし、素早く回転させます。各サンプルチューブに5 μLを加えます。PCRチューブストリップを密封し、サーマルサイクラーに移します。 表9 で説明するサーマルサイクルプログラムを再開し、サーマルサイクラーのサンプルウェルに直接試薬を追加する必要があるステップ3まで実行します。
   5. 表10に従って25%RNaseブロック溶液を調製します。チューブとボルテックスを高速で10〜20秒間密閉し、短時間回転させ、使用するまで氷の上に置いてください。
      注:プローブを含む溶液を室温に長時間さらさないでください。準備工程中のみ室温に保管してください。
   6. プローブバイアルを-80°Cの保管場所から取り出し、使用しない間はバイアルを冷却ラックに保管してください。解凍のために氷に移します。プローブは提供されているとおりに使用することをお勧めしますが、テストした場合は希釈できます^10,13。
   7. 表11にリストされているすべての試薬が室温に達したら、結合してプローブハイブリダイゼーションミックスを調製します。高速で5秒間ボルテックスして溶液を混合し、短時間スピンダウンし、すぐに次のステップに進みます。
   8. サーマルサイクラーが 表9に記載されているプログラムのステップ3に達したら、13 μLの室温プローブハイブリダイゼーションミックスを各サンプルウェルに加え、プロセス全体を通してチューブをサーマルサイクラー内に保持します。ピペッティングを上下に8倍から10回ゆっくりと調和させて、完全に混合します。
   9. PCRチューブストリップをしっかりと密閉し、短時間ボルテックスして、チューブを回転させます。気泡がないことを確認してから、すぐにストリップチューブをサーマルサイクラーに戻します。チューブが適切に密閉されていることを再確認してください。
   10. 調製したライブラリDNAサンプルとプローブのハイブリダイゼーションを実行するために、サーマルサイクルプログラムを再開します。ハイブリダイゼーションは一夜にして進行
       注: 2 日間のプロトコルの場合、これは 1 日目の終了を示します。3 日間のプロトコルの場合、これは 2 日目の終了を示します。
2. ストレプトアビジンビーズの調製
   1. ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズ(ストレプトアビジンビーズ)を4°Cの保管から取り出します。バイアルを完全にボルテックスして、ビーズが完全に再懸濁されていることを確認します。懸濁液は均質でなければなりません。
   2. ハイブリダイゼーションサンプルごとに、完全に再懸濁したビーズ50 μLを新しいPCRチューブストリップの個々のチューブに移します。
   3. ストレプトアビジンビーズを次の方法で洗浄します:各チューブに200 μLの結合バッファーを加え、上下にピペッティングして混合します。チューブを密閉し、高速で5〜10秒間渦巻き、短時間回転させます。PCRチューブストリップを磁気スタンドに入れます。溶液を5分間透明にしてから、慎重に上清を取り除いて廃棄します。手順を2回繰り返し、合計3回の洗浄を完了します。
   4. ビーズを200 μLの結合バッファーに再懸濁します。
3. ハイブリダイズライブラリのキャプチャ
   1. 表9に示すハイブリダイゼーション熱サイクルプログラムが最終ステップを完了したら、PCRチューブストリップを室温に移します。
   2. 各チューブから全容量(~30 μL)を、200 μLの予め洗浄されたストレプトアビジンビーズを含む対応するチューブに移します。上下に5x〜8回ピペッティングして完全に混合し、ストリップチューブをしっかりと密閉します。
   3. ストリップチューブを96ウェルプレートミキサーに置き、室温で1800rpmで30分間激しく混合します。ウェル内で液体が適切に混合されていることを確認してください。
      注:96ウェルプレートミキサーが利用できない場合、またはサンプルが効果的に混合されていない場合は、ストリップチューブをミキサーの上面に水平に固定するか、温度制御シェーカー(加熱オプションオフ)を使用してサンプルを完全に撹拌するなどの代替方法を検討してください。
   4. このインキュベーション時間の間に、各サンプルに対して200 μLの高温洗浄バッファーを6アリコート調製します(つまり、この場合は、それぞれ200 μLの6 x 8ストリップチューブ)。チューブを密封し、必要になるまで70°Cに保持したサーマルサイクラーでインキュベートします。
   5. 30分間のキャプチャーインキュベーションが完了したら、PCRチューブストリップを短時間回転させて液体を回収します。PCRチューブストリップを磁気スタンドに置き、ビーズを収集します。溶液が透明になるまで待ってから(約2分)、ビーズに触れないようにしながら、慎重に上清を取り除いて廃棄します。
   6. PCRチューブストリップを磁気スタンドから取り外した後、200 μLの室温洗浄バッファーを追加します。ストレプトアビジンビーズが完全に再懸濁するまで上下にピペットで移動します(15x-20x)。
   7. PCRチューブストリップを磁気スタンドに置き、懸濁液がクリアするまで待ちます(約1分)。次に、上清を取り除いて廃棄します。
      注:捕捉特異性を確保するには、以下に説明する洗浄手順全体を通してビーズ懸濁液を70°Cに維持することが重要です。したがって、使用前に高温洗浄バッファーが70°Cに予熱されていることを確認してください。
   8. 以下に説明するように、ストレプトアビジンビーズを分注し、70°Cの高温洗浄バッファーに予熱して6回洗浄します。
      1. ビーズが入っているPCRストリップチューブを磁気スタンドから取り出します。ビーズを含む各チューブに200 μLの70°C予熱高温洗浄バッファーを加えます。ビーズが完全に再懸濁されるまで上下にピペットを移動します(15x-20x)。PCRチューブストリップを慎重に密封し、高速で8秒間ボルテックスし、ビーズをペレット化せずにすばやく回転させます。
      2. 再懸濁したビーズを含むサンプルストリップチューブをサーマルサイクラーブロックに70°Cで5分間置きます。ストリップチューブをサーマルサイクラーから室温の磁気スタンドに移します。
      3. 溶液がクリアされるまで1分間待ちます。次に、上清を取り除いて廃棄します。5回繰り返して合計6回洗浄します。
   9. すべての洗浄バッファーが完全に除去されたことを確認し、各サンプルチューブに25 μLのヌクレアーゼフリー水を加えます。気泡の形成を避けるように、上下に8回ピペッティングしてビーズをゆっくりと再懸濁します。
   10. 以下に説明するPCR反応で使用する準備が整うまで、サンプルを含むPCRストリップを氷上に置いてください。
4. 増幅リッチライブラリー
   1. 表12に従ってサーマルサイクラーをプログラムします。プログラムを開始し、すぐに一時停止します。
      注:メーカーは、プローブ設計のサイズに応じて、キャプチャ後のPCRサイクルを10〜16回実行することを推奨しています。このプロトコルでは、22サイクルが実装され、病原体ゲノムの回復が成功しました^10,12。
   2. dNTPを含む忠実度の高いDNAポリメラーゼバッファー(5x)とキャプチャ後のプライマーミックス( 材料表を参照)の両方を-20°Cの保存から回収し、解凍し、氷上に保管します。高速でボルテックスし、使用前に素早くスピンダウンします。
   3. PCR増幅用の忠実度の高い融合酵素( 材料 表を参照)を-20°Cの保管場所から取り出します。酵素溶液を適切に混合するには、過度の攪拌を避けるために液体を上下にピペットで移動します。次に、 表13に従ってすべての試薬を組み合わせて、キャプチャ後のPCR反応ミックスを調製します。最終的なミックスを渦に巻き込み、一瞬スピンダウンし、氷の上に置いたままにします。
   4. キャプチャ後のPCR反応混合物25 μLを各サンプルチューブに加えます(それぞれ25 μLのビーズ結合ターゲット濃縮DNAを含む)。ビーズ懸濁液が均一になるまで反応を上下にピペットで混合します。PCRチューブストリップをしっかりと密封します。この段階では、PCRチューブストリップをスピンダウンしないでください。
   5. PCRチューブストリップをサーマルサイクラーに入れ、 表12に指定されているようにサーマルサイクラープログラムを再開します。プログラムが最終ステップに達したら、PCRチューブストリップを短時間回転させます。PCRチューブストリップを磁気スタンドに置き、溶液が透明になるまで約2分間待ちます。
   6. 約50 μLの上清を各PCRチューブストリップから新しいPCRチューブストリップの対応するウェルに移します。ストレプトアビジンビーズを含むストリップチューブは廃棄できます。
5. 最終ライブラリのクリーンアップ
   1. 使用前に、磁気ビーズを少なくとも30分間室温に平衡化させてください。ヌクレアーゼフリーの水を使用して4 mLの70%エタノールを調製します。室温で保管してください。
   2. 混合物が均一になり、色が一貫するまで磁気ビーズ懸濁液を完全に渦にします。
   3. 各サンプルチューブに50 μLのビーズ懸濁液を加えます。チューブを密封し、5〜10秒間ボルテックスし、短時間回転させます(磁気ビーズをペレット化せずに)。
   4. ビーズ懸濁液を室温で5分間インキュベートします。PCRチューブストリップを磁気スタンドに移し、溶液が透明になるまで5〜10分待ちます。
   5. PCRチューブストリップを磁気スタンドに保持したまま、各ウェルから透明な溶液を慎重に取り外して廃棄します。溶液を取り除くときはビーズに触れないようにしてください。
      1. PCRチューブストリップを磁気スタンドに取り付けて、次の方法で70%エタノールで2回洗浄します:各サンプルに200 μLの70%エタノールを加えます。乱れたビーズが沈殿し、70%エタノールを除去するまで1分間待ちます。溶液を取り除くときはビーズに触れないようにしてください。
   6. 2回目の洗浄後、チューブを密封し、PCRチューブストリップを短時間回転させて残留エタノールを収集します。PCRチューブストリップを磁気スタンドに30秒間置きます。
   7. 残留エタノールを除去するには、PCRチューブストリップを磁気スタンドから取り外し、最大5分間(理想的にはフード内)密封しないままにします。ビーズが完全に乾燥しているが、外観にひびが入っていないことを確認すると、溶出プロセスの効率が低下します。
   8. 各サンプルチューブに25 μLのヌクレアーゼフリー水を加えて、ライブラリDNAを溶出します。ピペッティングを上下に10〜15回して完全に混合し、PCRチューブストリップを密封し、5〜10秒間ボルテックスします。目に見える塊がないことを確認します。
   9. サンプルを室温で5分間インキュベートします。PCRチューブストリップを磁気スタンドに置き、溶液が透明になるまで約5分間待ちます。
   10. 各ウェルから透明化した上清(約25 μL)を慎重に除去し、新鮮なPCRチューブストリップ内の対応するウェルに移します。サンプルを氷の上に置き、ビーズを捨てます。
6. 品質管理
   1. 精製されたライブラリーDNAのDNA濃度を測定します。感度を向上させるには、蛍光ベースの方法を使用して 1 μL の DNA を定量します。
7. 次世代シーケンシング
   注:使用するプラットフォームの容量とサンプルあたりに必要なシーケンシングデータの量に応じて、複数のバッチからのインデックス付きライブラリを1回のシーケンシング実行で多重化できます。
   1. サンプルをプールする前に、各サンプルのDNA濃度を5 ng/μLに調整します。バランスの取れた表現を維持するために、ライブラリを等モル量でプールします。
   2. たとえば、150 bpのペアエンドリード構成を備えたハイスループットショートリードシーケンシングシステムを使用して、調製されたライブラリをシーケンスします( 材料表を参照)。

表 9:ハイブリダイゼーションのためのサーマルサイクラープログラム。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表10:RNaseブロック溶液の調製。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表 11:プローブハイブリダイゼーションミックスの調製。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表 12:キャプチャ後のPCRサーマルサイクラープログラム。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表13:キャプチャー後のPCR反応ミックスの調製。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

結果

アルゼンチンのブエノスアイレスで発生したC.トラコマチスLGVのアウトブレイクに関する研究では、サンプルにいくつかの新しい特徴、すなわち、ompA遺伝子型L1と比較したompA遺伝子の10のヌクレオチド置換、および異常な多遺伝子座配列タイピング(MLST)配列タイプ2タイプ^17、18、19が示されました。私たちは、これらの臨床サンプルからゲノムを調査し、それらをグローバル データのコンテキスト内に配置することを目的としました。これを達成するために、細菌量が少なく、ヒトおよび微生物のDNAが豊富であることによってもたらされる課題を克服するために、臨床サンプルからの細菌性感染症のWGSのターゲットエンリッチメントアプローチと直接メタゲノム配列決定の性能を比較しました。

使用されたDNAは、2017年から2023年の間にアルゼンチンのブエノスアイレスで採取された直腸スワブサンプルから、2%子牛胎児血清(FCS)と抗生物質(ゲンタマイシン25μg/mL、バンコマイシン0.5mg/mL、アムホテリシンB 2.5μg/mL)を添加した2-SP培地(スクロースリン酸培地)に入れ、-80°Cで保存するか、尿道、肛門直腸、 チューリッヒ大学病院 (USZ) で NAAT (核酸増幅検査) バッファーで採取された咽頭スワブ。ブエノスアイレスのサンプルからのDNAはシリカベースの手動抽出キットを使用して抽出され、USZサンプルからのDNAは自動磁気ビーズベースのシステムを使用して抽出されました。

この研究に含まれるすべての臨床サンプルは、社内で開発されたマルチプレックスリアルタイム PCR アッセイ (材料表を参照) によって陽性であることが確認され、qPCR サイクル閾値 (Ct) 値は次のようになります: C. trachomatis: 17-34、淋菌: 24-31、T. pallidum: 27-36、および M. genitalium: 30-37。DNA濃度は、臨床サンプルの入力物質を特徴付けるために、シーケンシングの前に高感度蛍光アッセイを使用して定量されました( 材料表を参照)。

直接メタゲノム配列決定と標的濃縮を比較するために、32のサンプルを使用し、そのうち29サンプルが C.trachomatis、9件が 淋菌、5件が T.pallidum、3件がM .ジェニタリウムで陽性でした。直接メタゲノム配列決定では完全なゲノムは得られず、実際、陰性サンプルで見られるベースラインを超える目標データをほとんど達成しませんでした。65°Cでのハイブリダイゼーションによるターゲット濃縮は、各病原体に対してはるかに優れた結果をもたらし、多くの場合、この方法から成功したゲノムが得られました (図1)。

ターゲットエンリッチメントに最適なサンプル選択を評価するために、オンターゲットリードの割合(%OTR)で測定される診断用qPCR Ct値とゲノム回収効率との関係を評価しました。この指標は、標的生物のゲノムにマッピングされるシーケンシングリードの割合を反映しており、濃縮性能を評価するために一般的に使用されます。病原体負荷とシーケンシングの成功との間に有意な相関関係が見られました C. trachomatis、成功のCtカットオフはCt30付近でした。他の標的病原体に関するデータは限られていましたが、同様の傾向が観察され、ゲノム配列決定の成功は主に病原体負荷がCt30未満のサンプルで発生しました (図2)。

ハイブリダイゼーション温度65°Cでのこの実験では、Ct値が30未満のサンプルに基づいて、C .トラコマチス、 淋菌、およびT .パリダムに対して75%〜80%のターゲット濃縮でゲノム配列決定の成功率が得られました。3つの M.ジェニタリウム 陽性サンプルは30〜37のCt値を持ち、より低いゲノムカバレッジと平均読み取り深度を達成しました。これらの結果を改善するために、 M. genitalium ゲノムの%G+C含有量が低いため、ハイブリダイゼーションを改善するハイブリダイゼーション温度を下げる実験を行いました。現在推奨されている62.5°Cの温度など、より低いハイブリダイゼーション温度を使用すると、他のゲノムの回収率を損なうことなく、 M. genitalium ゲノムの回収率を向上させることができます (図3)。 これらの結果は、ターゲットエンリッチメントが臨床サンプルから貴重なゲノム情報を取得するための効果的なアプローチであり、パネルベースのデザイン全体でも幅広いゲノムに適応できることを示しています。

成功裏に濃縮された C. trachomatis ゲノムの系統発生分析は、ブエノスアイレスからのサンプルの大部分が ompA 遺伝子型 L2b クレード内に集まっていることを示し、世界循環による系統の成功を示唆しました。この分析により、アルゼンチンにはLGVを引き起こす新しい明確な系統が存在することも明らかになりました。このクレードからのサンプルは、他のLGV系統と約600SNPが異なり、この系統はompA遺伝子型L4として提案されています(図4)。図1、図2、および図4で使用したサンプルの詳細な説明を補足表1に示します。

これらの発見は、病原体の多様性の研究における標的濃縮の価値を強調し、臨床サンプルからのゲノム配列決定の高度な成功を実証しています。

図1:直接メタゲノムシーケンシングと比較したターゲットエンリッチメントを使用したゲノムのエンリッチメント。 オンターゲットリードの割合(%OTR)は、標的生物のゲノムにマッピングされたシーケンシングリードの割合として定義され、ターゲットエンリッチメントによって達成される濃縮の程度を示します。線はすべてのデータポイントの中央値を表し、ボックスは50%の四分位範囲(IQR)を示します。データポイントの色はサンプルソースに対応しており、アルゼンチンの場合は淡い青、スイスの場合は赤です。ゲノム配列決定の成功は、カバレッジ>95%および平均リード深度>10として定義され、大きなポイントで表され、失敗は小さなポイントで示されます。Y 軸のスケールが異なることに注意してください。略語:CT = C.trachomatis、NG = N.淋病、TP = T.pallidum、 MG = M.ジェニタリウム。この数値は¹⁰から修正されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ターゲット濃縮からの%OTRと診断用qPCR Ct値との相関。 データポイントの色はサンプルソースを表しており、アルゼンチンの場合は淡い青、スイスの場合は赤です。ゲノム配列決定の成功は、カバレッジ>95%と平均リード深度>10として定義され、大きなポイントで示され、失敗は小さなポイントで表されます。Y 軸のスケールが異なることに注意してください。略語:CT = C.trachomatis、NG = N.淋病、TP = T.pallidum、 MG = M.ジェニタリウム。この数値は¹⁰から修正されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:10サンプルのすべてのSTI細菌病原体にわたる完全なゲノムの回復に対するハイブリダイゼーション温度の影響。 臨床サンプル中のヒトDNAに、既知の濃度の標的細菌DNAを別々に(単一)スパイクし、また複数の感染を伴うサンプルを表す(プール)ためにすべてをスパイクしました。5つの病原体/組み合わせをそれぞれ使用した2つの実験が実施されました:0.01%と0.03%で、サンプル中の全DNAに対する各微生物からのDNAのおおよそのパーセンテージを表しました(残りのDNAはヒトDNAに対応します)。 M.ジェニタリウム の回収率は低温で改善される。 C.トラコマチス DNAは低濃度でスパイクされました。さらなる実験は、温度が回復に影響を与えなかったことを示しています C .トラコマチス ゲノム(データは示されていません)。略語:CT = C.trachomatis、MG = M.ジェニタリウム、NG = 淋菌、TP = T.pallidum。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:アルゼンチン産LGV株の組換え調整系統発生。 分析には、公開されたデータを含む利用可能なすべてのLGVゲノムが含まれます。系統発生の右側に表示されるメタデータには、重複した患者サンプル、集団構造のベイズ分析(BAPS;クラスター=クレード、多系統BAPSクラスター6は集団の遺伝的多様性を表します)、ゲノム配列決定法(この研究からのデータ)、 ompA 遺伝子型、国、および年、左上のキーに示されています。欠落しているデータは白で表示されます。この研究のゲノム名は、アルゼンチンの場合は水色、フィンランドの場合は濃い青で強調表示されています(ターゲット濃縮では得られません)。これらの色は、この研究で生成されたゲノムを区別するためにのみ使用されます。1000 個の超高速ブートストラップのブートストラップ値は、メジャーブランチにパーセンテージとして表示されます。この数値は¹³から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足表 1: 研究で使用された材料、試薬、機器、および機器の説明。 この表には、DNA抽出、ライブラリー調製、ターゲット濃縮、およびシーケンシングに使用される成分の商品名、製造元、およびカタログ番号に関する詳細情報が含まれています。また、社内のqPCRアッセイや一般的な分子生物学の手順に使用されるアイテムも含まれています。アスタリスク (*) の付いた項目には、同等の代替手段を使用できます。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

臨床サンプルから完全な細菌ゲノムデータを生成することは特に困難です。しかし、循環クローンに関する情報を取得し、特に気難しい培養が困難な細菌における抗菌薬耐性プロファイルを調査するには、このデータが必要です。オックスフォード・ナノポア・テクノロジーズによるディープシーケンシングや適応シーケンシングなどの代替方法では、全ゲノム配列解析に十分なデータを取得できません。STIサンプルなどの場合、ターゲットエンリッチメントは全ゲノムにアクセスするための最適な手法であり、この方法は細菌性STI病原体のパネル全体で使用できます。これは安価な手順ではありませんが、それが提供できる結果は他の方法では得られません¹⁰.

診断や研究における関連性のある重要な質問に答えるために、理想的には適切なサンプルを慎重に選択する必要があります。収集に使用される培地は必ずしも重要な役割を果たすわけではなく、2-SP培地とNAAT培地の両方から成功した配列が得られます。DNAの完全性を維持することを目的として、サンプルの保管は重要です。最も重要な要因は診断負荷であり、Ct30 未満のおおよその Ct 値を目指していることがわかりました。Ct値が30を超えるサンプルの場合、フルゲノムシーケンシングが成功する可能性は低いですが、場合によっては部分的なデータから関連情報が得られる場合があります。

この手順は簡単ではなく、PCR サイクル、ハイブリダイゼーション、多くのビーズ洗浄など、多くのステップが含まれます。最適な結果を得るには、手順に細心の注意を払う必要があります。プロトコルの重要なステップ(DNA断片化、キャプチャプローブによるハイブリダイゼーション、洗浄による磁気ビーズベースのキャプチャ)には、慎重な実行と適切な取り扱いが必要です。このプロトコルは、研究者や技術者が数回試行することで学習できます。最初のラウンドでは、学習中に 3 日間のプロトコルが有利になる可能性があります。より経験豊富なユーザーの場合、2日間のプロトコルは結果をスピードアップできます。試薬は高価であるため、プローブなどの高価なコンポーネントを使用せずにテスト実行を実行する価値があります。代替餌セットの場合、ハイブリダイゼーション温度を調整できるため、濃縮の感度や特異性が向上する可能性があります。十分なデータが生成され、かなりの割合のPCR重複が観察された場合、キャプチャ前およびキャプチャ後のPCRサイクルの数も調整できます。

これらの実験から得られたデータは、MLSTやその他の関連ターゲットを抽出して、タイピングに使用できます。さらに、疫学的文脈で、世界的または局所的に、関連するゲノムと比較して、現代の洞察を得ることができます。ゲノム全体の組換えと可動要素分析も、時間の経過とともに選択圧下での変化、および同時感染の可能性を推測します。十分なデータと関連するメタデータがあれば、時間的な計算を行い、特定の特性や系統の祖先、および可能な伝播経路やメカニズムを推測することができます。病原体の重要なグループに関する知識におけるこれらすべての進歩は、公衆衛生戦略に情報を提供することができます。私たちのプロトコルと代表的な結果は、細菌性感染症サンプルに効果的であり、他のサンプルタイプに拡張できる症候群パネルターゲットプローブセットの使用を示しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
8チャンネルピペット0.5-10&マイクロ;L	エッペンドルフ	3125000010	エッペンドルフリサーチ プラス、8チャンネル、0.5-10&マイクロ。L、ミディアムグレー、可変ボリューム。
8チャンネルピペット10-100&マイクロ;L	エッペンドルフ	3125000036	エッペンドルフリサーチ プラス、8チャンネル、10-100&マイクロ。L、黄色、可変容量。
MBC タグ付きライブラリのアダプター オリゴ ミックス	アジレントテクノロジーズ	5500-0147	SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR)の一部です。
ウイルス・病原体DNA抽出キットを用いた自動核酸抽出システム	キアゲン	937036(キット)/9001297(楽器)	QIAsymphony SP/AS装置は、自動DNA抽出のためにQIAamp DSPウイルス/病原体キットとともに使用されます。
バインディングバッファー	アジレントテクノロジーズ	5190-9687	SureSelect ターゲット エンリッチメント キット ILM Hyb モジュール ボックス 1 (PCR 後) の一部。
DNA抽出キットと自動装置	ザイモリサーチ株式会社	D3024/D3025	臨床検体からの全DNA抽出に使用されるQuick-DNA Miniprep Kit。手動または自動のワークフローに対応。
エンドリペア - テーリング酵素ミックス	アジレントテクノロジーズ	5500-0147	SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR)の一部です。
エンドリペアテーリングバッファー	アジレントテクノロジーズ	5500-0147	SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR)の一部です。
エタノール	VWRケミカルズBDH	20816.298	エタノール無水≥99.5%ユーロ、USP
高感度dsDNAアッセイ/蛍光ベースのDNA定量法付き蛍光光度計	サーモフィッシャーサイエンティフィック(Invitrogen)	Q33238、Q33231	Qubit 4蛍光光度計、1X dsDNA高感度(HS)アッセイキット付き。
フラグメンテーションバッファ	アジレントテクノロジーズ	5191-4080	「5X Fragmentation Buffer」という名前のSureSelect Enzymetic Fragmentation Kitの一部。
フラグメンテーション酵素	アジレントテクノロジーズ	5191-4080	SureSelect酵素フラグメンテーションキットの一部。
高忠実度DNAポリメラーゼバッファー	アジレントテクノロジーズ	5500-0147	「Herculase II Buffer」という名前の SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR) の一部。
dNTPを含む高忠実度DNAポリメラーゼバッファー(5X)	アジレントテクノロジーズ	5190-9687	「Herculase II Buffer」という名前のSureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1(Post PCR)の一部。
PCR増幅のための高忠実度融合酵素	アジレントテクノロジーズ	5191-5688	「Herculase II」という名前のSureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1(Post PCR)の一部。
高温洗浄バッファー	アジレントテクノロジーズ	5190-9687	「洗浄バッファー 2」という名前の SureSelect ターゲット濃縮キット ILM Hyb モジュール ボックス 1 (ポスト PCR) の一部。
ハイブリダイゼーションバッファー	アジレントテクノロジーズ	5500-0147	SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR)の一部です。
インデックスシーケンシングプライマー	アジレントテクノロジーズ	5500-0147	ILM(Pre PCR)用のSureSelect XT HS2インデックスプライマーペア1〜96の一部。
社内マルチプレックスリアルタイムPCRアッセイ	ティブ・モルビオール	該当なし	STI検出用のLightmixキットをベースにした自社開発および認定アッセイ
ライゲーションバッファー	アジレントテクノロジーズ	5500-0147	SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR)の一部です。
クリーンアップ用磁気ビーズ	アジレントテクノロジーズ	5191-5740	SureSelect DNA AMPure XPビーズ。
磁気スタンド	パーマージェン実験器具	MSRLV08	0.2mL PCR 8 ストリップ磁気セパレーター 5 & マイクロ;L ~0.2mLの容量。
次世代シーケンシング(NGS):ハイスループットショートリードシーケンシングシステム	イルミナ株式会社	該当なし	ペアエンド150 bpシーケンシング(PE150)は、Illumina NextSeq1000およびMiSeqプラットフォームで実行されました。
ヌクレアーゼフリー水	バイオコンセプト	3-07F04-H	分子生物学用水、DNA/DNAse/RNaseフリー、無菌、PCR阻害剤フリー。
オリゴヌクレオチドブロッカーミックス	アジレントテクノロジーズ	5500-0147	SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR)の一部です。
PCRチューブストリップ	AVANTOR は VWR  によって提供されました。	732-3608	フラットキャップが取り付けられたPCRチューブストリップ。
ポストキャプチャプライマーミックス	アジレントテクノロジーズ	5190-9687	SureSelect ターゲット エンリッチメント キット ILM Hyb モジュール ボックス 1 (PCR 後) の一部。
RNAプローブ	アジレントテクノロジーズ	5191-6916	SureSelect Custom Tier4 6Mb-11.9Mbプローブ(例:Design ID S3465164)。
RNaseブロッカー	アジレントテクノロジーズ	5500-0147	SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR)の一部です。
室温洗浄バッファー	アジレントテクノロジーズ	5190-9687	SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) は「洗浄バッファー 1」という名前です。
ストレプトアビジンビーズ	アジレントテクノロジーズ	5191-5742	SureSelect ストレプトアビジンビーズ。
T4 DNAリガーゼ	アジレントテクノロジーズ	5500-0147	SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR)の一部。
ターゲット濃縮法/DNA捕捉法	アジレントテクノロジーズ	G9983-90000	SureSelect XT HS2 DNA Kitは、ライブラリ調製、Fast-Hybターゲットエンリッチメント、およびキャプチャ後のプーリングワークフローを備えています。プロトコル バージョン F0、2023 年 5 月。イルミナプラットフォームNGS用
C. trachomatis、N. 淋病、T. pallidum、およびM. genitalium	アジレントテクノロジーズ / エンリッチング微生物学研究所(IMM、UZH)	デザイン ID S3465164	4つのSTI病原体をマルチプレックスキャプチャするためのカスタム設計のプローブセット(~242,000プローブ)。多重参照ゲノムに基づく設計
サーマルサイクラー	サーモフィッシャー	4375305	Veriti 96ウェルサーマルサイクラー。