本研究では、マウスモデルにおける発光性大腸がん細胞の in vivo 皮下誘導と、その後のイメージングシステムを用いた発光測定に着目した研究を行っています。この手順は、リアルタイムのモニタリングと治療評価のための再現性のある腫瘍増殖モデルを確立することを目的としています。
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方法論記事
抗腫瘍効果を評価するためのアチミックヌードマウスにおけるヒト結腸直腸癌細胞の皮下注射
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
結腸直腸がん(CRC)は、世界中のがん関連死の主要な原因の1つであり、潜在的な治療法を評価するための改善された前臨床モデルが緊急に必要であることを強調しています。動物モデルは、腫瘍生物学を解明し、新しい治療介入を評価するために不可欠です。マウスモデルは、遺伝子操作性、迅速な繁殖、費用対効果、免疫適格株と免疫不全株の利用可能性など、既存のモデルに比べて主要な利点を提供し、ヒトのがんの正確なモデリングを可能にします。
このプロトコルは、免疫不全マウスモデルにおける生物発光性結腸直腸癌細胞株HCT-116の皮下誘導に焦点を当て、続いてIVISシステムとキャリパーを使用した非侵襲的生物発光イメージングにより腫瘍の進行と成長を監視します。発光細胞を使用することで、腫瘍の発生と治療介入への反応を追跡するためのリアルタイムで定量化可能なアプローチが可能になり、侵襲的な処置の必要性を減らすことができます。腫瘍細胞の移植にはマウスのコホート(n = 12)が必要であり、発光強度を測定して治療試験の標準化されたモデルを確立します。腫瘍の体積は通常、長さと幅の測定値または幅のみを使用して計算されます。
現在の方法論は、°のばらつきを最小限に抑えながら一貫した腫瘍形成を確保し、最終的に前臨床評価の信頼性を高めます。この研究の結果は、薬物試験のための腫瘍モデルの改良と、臨床応用における前臨床研究のトランスレーショナルポテンシャルの向上に貢献します。この研究は、高度なイメージング技術と再現性のある実験デザインを採用することにより、結腸直腸癌治療のための 生体内 薬物評価の精度と効率を向上させることを目的としています。
概要
結腸直腸癌(CRC)は、世界的に主要な健康負担であり、最も一般的で致命的な悪性腫瘍にランクされています1。従来の in vitro アッセイでは、生体内の腫瘍増殖と薬物反応の複雑さを完全に捉えることができないため、新しい治療アプローチを評価するためには、信頼性の高い前臨床モデルの開発が不可欠です。 In vivo モデル、特にマウスモデルは、腫瘍生物学に関する貴重な洞察を提供するために使用されており、研究者は制御された環境での潜在的な治療の有効性を評価することができます。
マウスモデルでの発光CRC細胞の使用は、前臨床研究の大きな進歩を表しており、腫瘍の進行のリアルタイムの非侵襲的モニタリングを可能にしました2。この研究は、腫瘍の成長を動的に追跡するための皮下腫瘍導入とIVISイメージングのための標準化されたプロトコルを確立することを目的としています。皮下注射モデルは、その技術的な単純さ、再現性、および縦方向の腫瘍モニタリングの容易さのために選択されました。 生物発光イメージングを活用することで、研究者は複数の時点で動物を安楽死させることなく、腫瘍の発生と治療反応に関する正確で定量化可能なデータを取得できます3。
IVISイメージングシステムは、腫瘍量を高い感度と特異性で評価するための強力なツールであり、 in vivo 研究の再現性と精度を向上させます。この研究は、将来の治療評価の基盤として機能し、結腸直腸癌治療の前臨床薬物試験に標準化された効率的なアプローチを提供します。この研究は、腫瘍導入法を洗練させ、高度なイメージング技術を実装することにより、腫瘍学における前臨床応用と臨床応用のギャップを埋めることに貢献しています4。
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プロトコル
動物は、 Instituto Murciano de Investigación Biosanitaria (IMIB、Murcia)倫理委員会(No A13240502)によって確立されたガイドラインに従って、特定の病原体のない条件下で維持されました。検査は、R.D.1201/2005に準拠して、資格のある担当者によって毎週実施されました。
1. 動物たち
注:すべての動物は、注射する前に安全かつ安全に拘束する必要があります。免疫不全マウス(Crl:NU(NCr)-Foxn1nuなどのヌード体外壁マウス)を使用する場合、無菌性を維持することが不可欠です。現在の研究では、実験の開始時に生後5週間(女性で20〜22 g、男性で22〜26 g)の12匹の無体神経ヌードマウスを利用しました(50%が男性)。すべての麻酔と実験手順は、施設倫理委員会(議定書番号A13240502)の承認を得て、スペインの法律(R.D.1201/2005)に準拠して、センターの Guía de Ética y Buena Práctica en Investigación で実施されました。
- アッセイを開始する前に、4週齢のマウスを約1週間動物センターに順応させます。その後、以下の手順で行ってください。
2. D-ルシフェリンストックの調製
- バイオセーフティキャビネット内の円錐管に予熱したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)にD-ルシフェリンカリウム塩生物発光基質の15 mg/mLの作業溶液を調製します。チューブを数回反転させて、溶液を均一化します。
- 溶液を0.2μmシリンジフィルターに通して滅菌します。
- 滅菌した溶液を1 mLの不透明なマイクロチューブに分注し、-20°Cで保存します。
注:ルシフェリンは光に敏感です。
3. 細胞外マトリックスの調製
- フェノールレッドを含まない市販の細胞外マトリックス(ECM)ヒドロゲルを、2°Cから8°Cの冷蔵庫内の氷上で一晩解凍します5。
- 注射当日は、ECMを氷上に保管し、予冷したP1000マイクロピペットを使用して、200μLのECMを滅菌チューブに分注します。
注:広口径マイクロチューブの使用をお勧めします。温度変化を最小限に抑え、凍結融解サイクルの繰り返しを避けます。 - ECMの急激な温度変化を防ぐために、注射を準備する前にシリンジと針を氷上で予冷します。
4. 細胞の剥離とカウント
- HCT-116生物発光細胞(ATCC細胞株CCL-247-LUC2)を腫瘍導入の数日前にT75フラスコにプレートして、十分な細胞数を確保します。細胞培養を37°C、5%CO2に維持し、必要に応じて培地を交換します6。
- 実験当日は、接着細胞を乱さないように培地を慎重に吸引してください。
- 細胞を滅菌PBS(水浴中で30°Cに予熱)で洗浄し、残留血清を除去します。
- 温かいトリプシン-EDTA(0.05%)のフラスコあたり2 mLを加え、37°Cで4〜5分間インキュベートします。倒立顕微鏡下で細胞の剥離をモニターします。細胞が付着したままの場合は、フラスコの側面を軽くたたいて取り外しを助けます。
- ウシ胎児血清(FBS)を含む10 mLの全増殖培地を添加して、トリプシンを中和します。
- 10 mLの血清ピペットを使用して、細胞を15 mLのコニカルチューブに移します。フラスコを2 mLの新鮮な培地で洗い流し、残りの細胞を回収し、洗浄液を15 mLチューブに加えます。
- 細胞懸濁液を200 × g で室温で5分間遠心分離します。細胞ペレットを乱さずに上清を慎重に吸引します。
- 細胞ペレットを3 mLの播種培地に穏やかに再懸濁して、均一な懸濁液にします。
- ノイバウアーチャンバーまたは自動セルカウンターで細胞をカウントします。10 μLの細胞懸濁液と10 μLのトリパンブルーを混合して細胞生存率を測定し、倒立顕微鏡下で生存細胞をカウントします。
注:研究に十分な数の細胞を準備します:マウスあたり少なくとも3×106 の生存細胞。 - 細胞を滅菌PBS(水浴中で30°Cに予熱)に再懸濁し、生細胞の濃度をPBSで最終濃度2×107 細胞/mLに変更します。200μLのアリコートを調製します。
5.機器アイテムを設置し、動物に麻酔をかけます。
- イメージングの少なくとも4時間前にイメージングシステムの電源を入れます。
注意: システムの指示に従って、信号対雑音比に応じた光の強度とカメラの露光時間の設定の調整など、初期化手順を許可します。この設定は、実験条件に基づいて手動で設定する必要があります。 - 動物の体重を量り、投与する必要があるD-ルシフェリンの量を計算します(動物の20 gあたり200 μLの15 mg / mL溶液)。
- イメージングチャンバーとキャビネットを清掃して消毒します。
- 麻酔のために各マウスを特定し、安全に拘束します。
注:皮下注射中に誤って針を刺さないように手を保護するために、2組の手袋を着用してください。 - 1.8-2.0 L / minの流量で酸素中の2%イソフルランでマウスを麻酔します。吸引ポンプと麻酔ポンプを同時にオンにします。
6.注射用細胞の調製
- バイオセーフティキャビネット内のクライオバイアルで、200 μL の 2 ×10 7 生物発光 CRC 細胞/mL と 200 μL の ECM を混合します。P1000ピペットで優しくピペットを動かし、気泡の形成や解離を防ぎます。
- 400 μLの混合物を1 mLシリンジに移し、気泡を取り除き、すぐに注入に進みます。
- 針の無菌性を常に維持しながら、針のキャップを安全に外してください。
注:汚染を最小限に抑えるために、動物ごとに個別の針を使用することをお勧めします。マウスごとに新しい針を使用し、マウスのクロス感染を防ぎます。 - 25Gの針を取り付け、シリンジの内容物を200μLに調整して、気泡を取り除きます。
注:注射は通常200μLで行われ、注射ごとに2個×10個の6 個の細胞が得られます。 - 動物が拘束されている間、キャップまたは針を扱わずに、針を緩くキャップに戻します。
7. 腫瘍の皮下導入
- 麻酔をかけたら、マウスをチャンバーから取り出し、動物の鼻を同じ麻酔薬を供給する出口に入れます。
注:私たちの場合、ノズルは手袋を使用して作られました。 - 動物を平らな面の右側に置きます。利き手ではない方の手の指先を使って、左下の象限で動物の皮膚をそっとつまんで持ち上げます。
- 注入する前に、まず吸引して針が適切に配置されていることを確認してください。利き手で針を斜めに、持ち上げた皮膚に3分の2を体と平行に挿入し、指を刺したりダブルグローブに穴を開けたりしないように細心の注意を払います。
注意: 適切な配置により、針のハブに負圧が発生し、吸引がなくなるはずです。 - シリンジの内容物(200μL)を、持ち上げた皮膚の2本の指の間に直接注入します。針をゆっくりと引き抜く前に、少し保持してください。皮下注射後は針を取り外し、シャープス容器に安全に廃棄します。.
8. D-ルシフェリンの腹腔内注射
- 動物を麻酔室に戻す前に、30 Gインスリン注射器(動物20 gあたり200 μL)に15 mg / mLのストック溶液を使用して、体重150 mg / kgの濃度でD-ルシフェリン腹腔内(IP)を投与します。.
注:最大0.5mLの注射は忍容性が良好です。. - 手動で拘束し、背側横臥(腹部を上にして)、動物の頭蓋(頭)の端を下に向けて拘束します。腸の内容物が下に移動するのを待ちます。
- 針の斜め側を上にして、15〜20°の角度で少し傾けたまま、針を腹腔に押し込み、針の先端が動物の左下腹部の腹部の腹壁をちょうど貫通するようにします。
- D-ルシフェリンを腹腔内にゆっくりと注入し、針を取り外して安全に廃棄します。.
- マウスを麻酔チャンバーに入れ、約5分間安定させます。15分後、 in vivo イメージングに進みます。
注:新しい動物モデルごとにD-ルシフェリン動態曲線を作成して、ピーク信号時間を決定します。私たちの場合、発光は in vivo イメージングで約15分でピークに達しました。
9. in vivo イメージング解析
- 完全に麻酔をかけた動物をイメージングシステムのチャンバーの右側に置きます。動物がカメラと光源に適切に位置合わせされ、腫瘍領域を捉えていることを確認します。
- リンクされたソフトウェアを開きます。動物の位置を確認するために、視覚 または写真イメージングモード を選択します。データを保存し、フォルダの名前を変更します。
- 生物発光イメージングモードを選択し、自動に設定します。生物発光画像をキャプチャし、コンピューター画面上の腫瘍光を監視します。
- イメージングが完了したら、動物をケージに戻し、合併症がないか観察します。
- 後処理を行い、まず生物発光光をスケーリングして、すべてのマウス腫瘍が同じスケール(通常は1e6 から1e8の間)を示すようにします。
- 腫瘍の周囲に関心領域(ROI)を設定して分析し、それをコピーしてさらに分析します。ROIの光を測定し、これらの結果をエクスポートしてさらに分析します。以前に作成してコピーした同じサイズのROIを、後続の腫瘍に貼り付けます。
- 製造元の指示に従ってシステムをシャットダウンし、イメージングチャンバーを清掃します。抽出ポンプと麻酔ポンプをオフにし、酸素の流れも止めます。
10. 腫瘍体積測定
- 腫瘍測定のためにイソフルランで動物に麻酔をかけます。動物を安定した位置に置き、頭を覆います。動物をすばやく固定します。
- 腫瘍の長さ、幅、深さを、校正済みのデジタルキャリパーで測定します。
注:動物は麻酔室から取り出してから約1分後に目覚め始めるため、測定を迅速に行ってください。 - 測定を繰り返し、平均を計算します。
- 球状または楕円形の腫瘍の式に従って体積を計算します。
球状腫瘍の場合 7
(1)
楕円様腫瘍の場合 8
(2)
注:測定バイアスを最小限に抑えるために、研究内のすべての腫瘍測定は同じオペレーターによって行われるべきです。さらに、腫瘍導入の日には、腫瘍の塊がまだ完全に固まっていないため、正確な測定が困難な場合が多いことに注意する必要があります。
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結果
このプロトコルは、免疫不全マウスモデルへのヒト細胞の導入を可能にし、これらの腫瘍細胞のin vivoでの増殖を可能にし、 これは常にin vitroよりも生理学的に関連性があります。実験条件が可能な限り再現性があること、腫瘍に同数の生存細胞が含まれていること、および腫瘍が同等で一貫してアクセス可能な場所に移植されていることを確認することが重要です。
生体内発光HCT−116細胞株の感度をin vivoで試験するために、2細胞×106細胞をヌードマウス(n=12)に皮下注射した。最適化されたプロトコルにより、放出される光と腫瘍体積(P > 0.05)の両方において、生存細胞数の均質な注入が容易になります(図1および図2)。生物発光イメージングは、均一なシグナル(図1B
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ディスカッション
胸部ヌードマウスモデルにおける発光性結腸直腸癌細胞の皮下誘導のためのプロトコルは、腫瘍形成とリアルタイムモニタリングのための標準化された再現性のあるアプローチを示しています。まず、このような研究は通常28日間にわたって行われ、発光測定は腫瘍導入の日に行われ、その後は毎週行われることに注意することが重要です。逆に、腫瘍体積のキャリパー測定は、細胞懸濁液がまだカプセル化されていないため、初日には行われません。腫瘍の測定は最初の週から始まり、その後は毎週行われます。腫瘍の成長は、皮下注射の日から腫瘍が約300mm³に達するまで、以前の研究で説明されている式を使用して計算されたように、キャリパー測定を使用して監視されました9。
この方法の最も重要なステップの1つは、ECMでの腫瘍細胞懸濁液の調製であり、細胞の生存率と増殖をサポートするECMのような環境を提供することで腫瘍の取り込み率を向上させます。さらに、発光細胞を注射前に適切に培養し、継代させることは、細胞の生存率を維持し...
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開示事項
著者たちは、この研究で報告された研究に影響を与える可能性のある既知の競合する金銭的利益や個人的な関係がないことを宣言します。
謝辞
ACSとCNNは、「Health Sciences PhD Program, Universidad Católica de Murcia (UCAM), Campus de los Jerónimos nº 135, Guadalupe 30107, Murcia, Spain」に所属しており、UCAMから博士号を取得しています。著者らは、前臨床アッセイが実施されたIMIB(Instituto Murciano de Investigación Biosanitaria、Murcia)の動物施設プラットフォームに感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1mL不透明マイクロチューブチューブ | エッペンドルフ | 30125215 | D-ルシフェリン貯蔵 |
| 15 mL円錐形チューブ | ファルコン、サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 11507411 | 細胞培養材料 |
| アドバンスド・ダルベッコ改良型イーグル中型(DMEM) | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 1152046 | 細胞培養試薬 |
| アシミック・ヌード・マウス | チャールズ川 | Crl:NU(NCr)-Foxn1nu | 免疫不全のヌードマウス |
| 発光ヒト大腸がん細胞 HCT116 | ATCC | CCL-247-LUC2 | HCT 116-Luc2は生体内生物発光に理想的です |
| D-ルシフェリン・ピアース | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 15215733 | 生物発光測定のために |
| 細胞外マトリックス(ECM) | コーニング | 356231 | 細胞侵入用のマトリジェルマトリックス |
| 胎児用牛血清 | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 10500064 | 細胞培養試薬 |
| フィルターピペットの先端 | フィンティップ、サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 94056710 | 気泡の発生を防ぐために |
| インスリン注射器 25 G 1 mL | イベロメド | JERINRAYS29 | 細胞株のHCT-116移植のために |
| インスリン注射器 30 G 0.5 mL | DH マテリアル・メディコ | 9.41652E+15 | D-ルシフェリン投与の場合 |
| IVIS画像システムとLiving Imageソフトウェア | パーキンエルマー/リヴヴィティ | 128201 | 生物発光および蛍光イメージングスキャナー |
| 針ステリカンヘパリン | VWR | 612-0153 10 | D-ルシフェリン投与およびHCT-116の移植 |
| リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS) | VWR | 392-0042P | HCT-116の剥離および移植のための細胞懸濁液 |
| トリプシン-EDTA | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 11590626 | 細胞培養試薬 |
| T-75フラスコ、TC処理済み | スターラブ | CC7682-41 | 細胞培養材料 |
参考文献
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再版と許可
