方法論記事

成熟種子からの絶滅危惧種薬用蘭 Hemipilia cucullata の非共生発芽と葉外植片に基づく再生

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DOI：

10.3791/68541

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2025年9月19日

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1Zhejiang Province Key Laboratory of Plant Secondary Metabolism and Regulation, College of Life Sciences and Medicine, Zhejiang Sci-Tech University, 2Laboratory of Systematic & Evolutionary Botany and Biodiversity, College of Life Sciences, Zhejiang University

この記事について

サマリー

ここでは、 Hemipilia cucullataの非共生種子発芽、苗の発育、およびシュート伸長を最適化するためのプロトコルを提示します。このプロトコルはまた、無菌の葉の外植片からの原球茎様体の誘導を可能にし、この絶滅の危機に瀕している薬用蘭の保存と持続可能な使用のための効率的な in vitro 繁殖を促進します。

要約

Hemipilia cucullata (蘭科) は、その薬効と観賞用の魅力で広く評価されている陸生蘭ですが、生息地の劣化、種子の生存率の低さ、受粉の成功の制限により、野生個体群は絶滅の危機に瀕しています。その保存と持続可能な利用をサポートするために、この研究は、成熟した種子の共生発芽、原球茎の発達、新芽の伸長、および無菌葉外植片からの原球茎様体(PLB)誘導のための最適化されたプロトコルを開発しました。0.5 mg/L NAAを添加した1/2 MS液体培地で培養した種子は、72 ± 6%の発芽率を示し、対照(46%)および固体培地(31%)よりも有意に高く、液体培養では発芽が約21日早く開始されました。プロトコルムは、0.5 mg/L BA、0.2 mg/L NAA、および 100 mL/L のココナッツウォーターを含む B5 培地で継代培養され、効率的な増殖につながりました。5〜6週間後、小株をシュート伸長培地(0.5 mg/L BAおよび1 mg/L NAAを添加したB5)に移し、そこで堅牢なシュート伸長と健康な葉の形成を示しました。PLB誘導では、BA(3 mg/L)およびNAA(0.2 mg/L)を含むMS培地で最高の誘導率(44.3 ± 5.1%)を達成しました。この包括的で再現性のあるプロトコルは、 H. cucullata の大規模な繁殖と生息域外保全のための効果的なプラットフォームとなり、この絶滅危惧種の蘭の回復努力に貴重なサポートを提供します。

概要

Hemipilia cucullata (L.) Y.Tang, H.Peng &; T.Yukawa、通称 cucullate neottianthe 蘭は、温帯ユーラシア大陸原産の野生陸生蘭で、ポーランドから日本に広く分布しています1.当初はネオティアンテ属に分類されていましたが、この種は最近、分子的証拠2に基づいてヘミピリア属、セクションネオティアンテに再割り当てされました。植物は地下の塊茎から成長し、高さ30cmに達し、片側の穂状に配置されたピンクがかったまたは紫がかった赤の花を出します。その花のエレガントな形と魅力的な色により、それは重要な観賞的価値を持っています。さらに、植物全体は複数の国で薬草として認識されており、心臓病の治療、血液循環の促進、あざの緩和、骨折治癒の促進など、さまざまな治療目的に広く利用されています 3,4。最近の植物化学的研究により、シアニジン 3-オキサリルグルコシド、クリサンテミン、シアニンなど、この種に含まれるいくつかのアントシアニンが同定されており、これらは抗酸化作用と血管保護作用を持ち、その薬効に寄与する可能性があります 5,6。

現在、H. cucullataの野生個体群は、生息地の喪失と環境撹乱による脅威に直面しており、深刻な個体数減少につながり、一部の地域では種を絶滅に近づけています3,7,8。しかし、この種の保全は、自然繁殖が困難であるため、特に困難です。野生では、H. cucullata はクローンと有性の両方で繁殖しますが、どちらのモードも非効率的です。自然なクローン繁殖は遅く、まれですが、有性生殖は受粉の成功率が低く、種子の生存率が低いため制限されます9,10。さらに、現地調査により、特に人為的または発熱性ストレス条件下では、幼体が不足し、自然な採用が制限されているなど、著しく不均衡な年齢構造が明らかになりました7,8,11。H. cucullata の種子は、多くの蘭と同様に、微小で胚乳がなく、発芽には特定の真菌パートナーを必要とするため、自然再生がさらに複雑になります。その結果、地理的に分布が広いにもかかわらず、野生個体群の個体群規模と年齢構造は減少しており、局所的な絶滅のリスクは高まっています7。したがって、人工的な急速増殖のための効率的な方法の確立は、生殖質資源の保全とこの蘭種の持続可能な利用の両方にとって不可欠です。

利用可能な繁殖技術の中で、蘭の菌根菌との関連に依存する共生発芽は、自然のプロセスを厳密にシミュレートできますが、種特異的な真菌パートナーに依存するため、標準化が困難であることがよくあります12,13,14。対照的に、非共生発芽は、蘭組織培養システムで広く使用されている、より単純で再現性のある代替手段を提供します15。Bletilla、Dendrobium、Cypripedium16、17、18、19などのいくつかの薬用蘭に対して、非共生発芽および急速増殖プロトコルが開発されていますが、H. cucullataの培地および組織培養条件の種特異的な最適化は依然として必要です。

この研究では、中国東部(北緯30度20分、東経119度22分)の天目山で野生個体の手動他家受粉(図1A)によって得られたH.キュクラタの成熟した種子を使用して、非共生種子の発芽、苗の発育、および新芽の伸長のための効果的なプロトコルを確立および最適化しました。また、PLB誘導による葉外植片からの再生システムを開発し、絶滅危惧種の薬用蘭の保全・栽培に貢献しました。

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プロトコル

注: 実験を開始する前に、手袋、白衣、安全ゴーグルなどの個人用保護具を着用してください。無菌性のために層流フードの下ですべての手順を実行します。エタノールと次亜塩素酸ナトリウムは慎重に取り扱い、実験室の安全規則に従って廃棄物を処理してください。

1. カプセル滅菌と種子抽出

  1. カプセルをビーカーに入れます。洗剤を1〜2滴加え、水道水でよくすすぎ、表面の汚染物質を取り除きます。
  2. カプセルを流水で5分間洗浄します。無菌吸収紙で表面の水分を吸収します。
  3. カプセルを滅菌作業台に移し、さらに消毒します。
  4. カプセルを75%(v / v)エタノールに30秒間浸します。
  5. カプセルを50 mLの20%(v / v)次亜塩素酸ナトリウム溶液(~5%の利用可能な塩素を含む市販の漂白剤から希釈)に浸し、2滴の原作の家庭用食器用洗剤を10〜12分間加えて滅菌します。
  6. カプセルを滅菌蒸留水で5回すすぎ、残留消毒剤を取り除きます。
  7. 滅菌メスを使用して、カプセルの頂点と基部(小茎端)の両方から約1 mmを取り除きます。
  8. カプセルの上端に小さな切開を入れて種子を露出させます。種子抽出のためにカプセルを滅菌ペトリ皿に入れます。

2. 培地の調製

  1. 1/2 MS液体培地の調製:標準MS培地の半分の主要栄養素濃度を使用し、MS培地と同様に他のすべての成分を保持し、20 g / Lのスクロースとα-ナフタレン酢酸(NAA、0.5 mg / L)を加え、pHを5.8に調整します。
  2. 沸騰後、すぐに培地を500 mLの培養ボトルに分注します(ボトルの数は、希望する増殖スケールに応じて調整できます)。
  3. 分注した培地をオートクレーブに入れ、121°Cで15分間滅菌します。滅菌後、培地をオートクレーブから取り出し、室温まで冷ましてから使用する。

3. 種子の発芽

  1. 滅菌鉗子を使用して、約500〜600個の種子を培地の各ボトルに均一に分散させます(ステップ2.3で調製)。種子が水を吸収し、液体培地の底に落ち着くようにします。
  2. 培養物を25°Cで12時間の明暗サイクルと36μmol・m-2・s-1の光強度で維持します。
  3. 種子の発芽を毎週観察し、形態学的変化を記録し、記録用の写真を撮ります。
  4. ほとんどの種子が発芽した約12週間後、発芽した種子の数を数えて発芽率を計算します。滅菌接種ループを使用して、種子を含む液体培地を1ループフルにランダムに収集します。サンプリングした種子をシャーレまたはスライドガラスに移し、実体顕微鏡で観察します。
  5. 発芽した原球茎を形成した種子の数を数えます。次の式を使用して発芽率を計算します。
    発芽率(%)=(発芽種子数/サンプル中の種子総数)×100。

4. プロトコームの亜代培養と増殖

  1. B5培地(3.21 g / L)にココナッツウォーター(100 mL / L)、6-ベンジルアミノプリン(BA、0.5 mg / L)、およびNAA(0.2 mg / L)を添加して増殖培地を調製します。20 g / Lのショ糖と7.3 g / L寒天を加え、pHを5.8に調整します。
  2. 沸騰後、すぐに培地を150 mLの培養ボトルに分注します(ボトルの数は、所望の増殖スケールに応じて調整できます)。
  3. 分注した培地をオートクレーブに入れ、121°Cで15分間滅菌します。使用前に培地を室温まで冷ましてください。
  4. ボトルあたり10〜15個の発芽プロトコルム(サイズ0.3〜1 cm)を、ステップ4.3で調製した培地に無菌移します。
  5. 5週間の培養期間の後、増殖状態を評価し、ボトルあたりに新しく形成されたプロトコームの数を記録します。
  6. 増殖したプロトコルムをさらに4〜6週間培養を続け、芽の伸長のために移す前に、目に見える芽の頂点と根茎のような構造を持つ小苗に発達できるようにします。
    注:培養物を25°Cに維持し、12時間の明暗サイクルと36μmol・m-2・s-1の光強度で維持します。

5.シュート伸び

  1. B5培地(3.21 g / L)にBA(0.5 mg / L)とNAA(1 mg / L)を補給することにより、シュート伸長用の培地を準備します。20 g / Lのショ糖と7.3 g / L寒天を加え、pHを5.8に調整します。
  2. 沸騰後、培地を150 mLの培養ボトルに分注します(ボトルの数は、所望の増殖スケールに応じて調整できます)。
  3. シュートの伸びのために健康な小苗(サイズ1〜2 cm、明らかな黒化や完全な黄変なし)を選択します。滅菌および冷却した鉗子を使用して、ステップ5.1で調製した新鮮な培地を含む各150mL培養ボトルに8〜12個の小苗を無菌的に移します。小苗が各ボトル内に均等に分散されていることを確認してください。
  4. 5週間のシュート伸長期間の後、葉の外植片サンプリングのために、完全に発達したシュートと健康な葉を持つ小苗を選択します。
    注:培養物を25°Cに維持し、12時間の明暗サイクルと36μmol・m-2・s-1の光強度で維持します。

6. 葉の外植片からのPLBの誘導

  1. MS基礎培地(4.43 g / L)にBA(3 mg / L)とNAA(0.2 mg / L)を添加して、PLB誘導培地を調製します。20 g / Lのショ糖と7.3 g / L寒天を加え、pHを5.8に調整します。
  2. 沸騰後、培地を150 mLの培養ボトルに分注します(ボトルの数は、所望の増殖スケールに応じて調整できます)。
  3. シュート伸長の5週間後に健康な小苗を選択します(ステップ5.4)。完全に膨張した無菌葉を切除し、頂端領域と縁を取り除き、無菌条件下で滅菌メスを使用して各葉を約0.5 cm×0.5 cmのセグメントに切断します。
  4. 10 個の葉セグメントを PLB 誘導媒体の上に置き、近軸面を上に向けて、媒体表面としっかりと接触するようにします。
  5. 5週間の培養後、誘導に成功したPLBの数を評価し、誘導率(%)を計算します。さらに、平均芽の高さ(cm)と外植片ごとに形成される芽の数を記録します。
    注:培養物を25°Cに維持し、12時間の明暗サイクルと36μmol・m-2・s-1の光強度で維持します。

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結果

この研究で提示されたプロトコルステップは、 H. cucullataの非共生種子発芽、原球茎増殖、シュート伸長、およびPLB誘導を改善することを目的とした一連の比較実験を通じて開発された最適化された方法論を表しています。たとえば、種子の発芽を促進するための PGR の選択では、NAA は胚の発育と水分の取り込みを促進し、BA は芽の分化と細胞分裂を促進します。それらの相乗効果は、蘭の種子培養における発芽率と初期の苗の成長を改善することが示されています17。プロトコルの各段階は、反復実験、統計分析、形態学的観察から導き出されたパフォーマンス指標に基づいて改良されました。

種子発芽条件の最適化
種子の発芽条件を最適化するために、H . cucullata、2つの培地タイプ(液体対固体1/2 MS)と4つの植物成長調節剤(PGR)処理(対照(PGRなし)、NAA(0.5 mg / L)、BA(0.5 mg / L)、およびBA(0.5 mg / L)+ NAA(1....

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ディスカッション

蘭のカプセルには通常、多数の種子が含まれており、多くの場合1万個を超えますが、胚乳がなく、共生真菌の会合と特定の環境の手がかりへの依存度が高いため、それらの自然発芽は非常に制限されています20。したがって、非共生発芽プロトコルは、これらの制限を回避し、制御された条件下での効率的な苗の繁殖を可能にするために広く採用されています。たとえば、Chen ら15 は、最初の 14 日間の暗前処理で MS 培地を使用した Bletilla で 93% の発芽率を報告しました。さらに、さまざまな陸生蘭種の非共生発芽のために、普遍的な培地(5%ココナッツウォーターを添加した1/2 MS)が提案されています21,22。ただし、発芽の成功は種固異的であり、培地組成、特にPGRの種類と濃度に強く影響されます。Gogoiら23

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ビタミンを含む1/2 MSの塩クーラバーPM1061
6-ベンジルアミノプリン上海マックリン生化学技術有限公司1214-39-7
寒天パワー北京ケムベーステクノロジー株式会社1400
クリーンベンチ蘇州浄化設備有限公司SW-CJ-2G
ココナッツウォーターグッドファーマーhttps://e.tb.cn/h.6F8GTrHG7pif7Tj?tk=jFTyVPU3OBs
洗剤リビー科学技術6920174756784
ガンボーグ B5 ミディアムフィトテクノロジー研究所G398型
ガラスボトルモアベターバイオテクノロジー株式会社MBT-BL-240
村重&さんスクーグ基礎塩フィトテクノロジー研究所M519
ピペットエッペンドルフ3123000268
精密天びんメトラー・トレド30834109
SPSSのインターナショナル・ビジネス・マシーンズ株式会社統計的有意性検定に使用されるソフトウェア
蔗糖シノファーム化学試薬株式会社20210802
チジアズロン上海マックリン生化学技術有限公司51707-55-2
&α;-ナフタレン酢酸上海マックリン生化学技術有限公司86-87-3

参考文献

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