方法論記事

ウイルス学における走査型透過型電子顕微鏡断層撮影:高圧凍結凍結置換サンプルの3Dイメージング

DOI：

10.3791/68568

⸱

2025年8月6日

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1Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, 2Central Facility for Electron Microscopy, Ulm University, 3Institute of Molecular Virology, Ulm University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このビデオプロトコルは、ウイルス学的標本の走査型透過型電子顕微鏡断層撮影法を実行する方法を示しています。最適な結果を得るために、サンプルは高圧凍結とその後の凍結置換によって調製されます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

電子顕微鏡 (EM)、特に 3 次元 (3D) EM 技術は、構造ウイルス学において確立された方法となっています。ジカウイルス(ZIKV)誘発複製工場やコロナウイルス複製オルガネラなど、ウイルス誘発性細胞超微細構造の変化の調査には、3Dイメージングが必要です。透過型電子顕微鏡 (TEM) 断層撮影法は、厚さ 200 nm までのサンプルに限定されているにもかかわらず、広く使用されている方法です。集束イオンビーム走査型電子顕微鏡(SEM)断層撮影法は、通常は解像度は低くなりますが、等方性で大量の3Dデータを生成できます。ブロック顔走査型電子顕微鏡 (BF-SEM)、SEM アレイ断層撮影、または連続切片の TEM イメージングなどの代替技術は、より大きなボリュームのイメージングに使用されます。ただし、前述の技術と比較して、これらの技術はサンプルのZ軸に沿った分解能が大幅に低くなるという代償を払っています。厚さ1μmまでのサンプルの3D情報を数ナノメートルの等方性分解能で提供する技術は、走査型透過型電子顕微鏡(STEM)断層撮影法です。

ここでは、高圧凍結、凍結置換、および樹脂包埋ウイルス学的標本の調製と、STEMトモグラフィーを使用したそれらの分析のためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、生物学的超微細構造をネイティブに近い状態で維持しながら、室温イメージングの利点の恩恵を受けます。STEM断層撮影法で答えられる質問の代表的な例を2つ紹介します。まず、組換え水疱性口内炎ウイルス(VSV)のビリオン形態形成を研究するためのプロトコルを適用します。STEM断層撮影は、2Dイメージングではアクセスできない組換えVSV出芽に関する情報を提供します。次に、EF-Cペプチドナノフィブリルのフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)イメージングとSTEMトモグラフィー(FRET-3D-CLEM)を使用した相関光学および電子顕微鏡(CLEM)を示します。最近発表されたこの組み合わせは、感染増強ペプチドナノフィブリルの取り込みと分解に関する新しい洞察を提供し、特にSTEM断層撮影でアクセスできる大量の利益から利益を得ています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

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図1:解像度、機器、取得時間、労力を考慮したさまざまな3D顕微鏡技術の比較。 この技術の最大実行可能な体積は、分子分解能を提供する技術的に要求の厳しいクライオTEM断層撮影と、光の回折限界によって解像度が制限される光学顕微鏡の中間です。略語:TEM =透過型電子顕微鏡;STEM = 走査型 TEM;SEM = 走査型電子顕微鏡;FIB = 集束イオンビーム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ウイルス関連の構造とシステムは、サブオングストローム領域(ウイルス療法用の小分子、単離されたウイルスタンパク質など)から数メートル(感染した生物全体など)までのスケールに及びます。ウイルス粒子は20〜1,000 nmの範囲にあり、主に宿主細胞やウイルス生産細胞株などの生物学的文脈で調査され、μmの範囲にあります。したがって、特定のウイルス関連構造の視覚化は、十分な視野と適切な解像度を提供する技術の選択にかかっています。ウイルスに感染した細胞や組織片の研究は、顕微鏡技術に依存しています(図1)。細胞や組織の概要画像は古典的な光学顕微鏡を使用して取得できますが、ウイルスの複製に関与する細胞内構造は、電子顕微鏡(EM)を使用して研究されることがよくあります。現在では主に基礎ウイルス学研究に使用されていますが、EMは診断1,2にも使用されており、バイオ医薬品の用途にも採用されています3。

多くの場合、従来の透過型電子顕微鏡(TEM)のような2D電磁波アプローチでは、特定の生物学的質問に十分に答えることができません。ウイルス学では、これは、ビリオンの付着と侵入、ウイルス工場の形成、またはビリオンの形態形成などのウイルス-宿主-細胞相互作用を研究する場合に特に当てはまります4,5,6,7,8,9。したがって、EM トモグラフィーは生体サンプルの 3D 超微細構造の分析に使用されます。原則として、特定のサンプルの断層撮影を取得するには、1)後で3D画像スタックに結合されるシリアルスライスの段階的なイメージング、または2)サンプルのさまざまな視野角からの投影の取得と、その後、情報を仮想画像スタックに計算的に再構成する2つの方法があります。

最初のタイプの技術には、TEM または SEM (SEM アレイ断層撮影)、シリアル ブロック フェース SEM、および集束イオン ビーム (FIB)-SEM 断層撮影による連続切片のイメージングが含まれます。シリアル切片のSEMおよびTEMイメージングは、切片の厚さによって制限されるzの分解能に欠けていますが、広い視野を提供し、ほとんどのEMラボで容易に利用できる機器に依存しています4。FIB-SEM断層撮影は等方性分解能を得ることができますが、デバイスとメンテナンスのコストは困難な場合があり、等方性分解能での全細胞のイメージングには時間がかかります9,10。

2番目のタイプの断層撮影は、サンプルを通る電子ビームの透過のみに依存しています。これは、TEM または走査型透過型電子顕微鏡 (STEM) の 2 つの異なるイメージング モダリティを使用して行うことができます。TEM 断層撮影はより普及しており、実装が容易ですが、断面の厚さは ~200 nm に制限されています。したがって、ミトコンドリア、小胞、ビリオンなど、切片の厚さよりも大きい構造は、1 回の断層撮影では画像化できません。STEM断層撮影は、厚さ1μmまでのサンプルを画像化する可能性を提供します11,12。ただし、高い加速電圧(≥200 kV)を備えたSTEMと、高い傾斜角と小さな半収束角をサポートするセットアップが必要です13。STEM イメージングは材料科学では一般的な技術ですが、生物学的 EM 研究所では依然としてまれな技術です。

ここでは、ウイルス学的標本にSTEM断層撮影を使用するためのアプリケーション主導のアプローチを紹介します。EM 断層撮影は非常に複雑で労働集約的であるため、高品質のサンプル前処理が非常に重要です。極低温TEM(断層撮影)は間違いなく分子レベルでの研究のゴールドスタンダードですが、高圧凍結凍結置換細胞の室温イメージングは、細胞の超微細構造の確実な保存と明瞭さを提供します7,14。簡単に言えば、接着細胞はサファイアディスク上で増殖し、感染するか、または必要に応じて処理されます。次に、セルを非常に高い冷却速度で高圧下で凍結することによって固定化され、その結果、内部の水がガラス化されます。その後、水を溶媒に置き換え、サンプルをコントラストしてゆっくりと室温に戻します。その後、サンプルを徐々に樹脂に埋め込みます。

高圧凍結および凍結置換には多くのプロトコルがあり、それらは機械、キャリアシステム、および試料の組成が異なります。Walther et al.15 によるプロトコルや、マイクロ波支援コントラスト増強を使用した FIB-SEM の組織準備に焦点を当てた Steyer et al.16 によるビデオ プロトコルなど、高圧凍結の詳細なプロトコルが公開されています。ウイルス学研究のために、Readら17とRomero-Brey18は、サファイアディスクによる高圧凍結とその後の電子トモグラフィーを使用した分析によるウイルス感染細胞の調製のための詳細なプロトコルを発表しました。超薄切片化も以前に記載されています15,17。これらのアプローチの詳細については、引用された文献を参照してください。

ここでは、以前に公開されたプロトコル15,17の適応および更新バージョンであるワークフローを、詳細なビデオガイドと初めて組み合わせて紹介します。このプロトコルは、高圧凍結、凍結置換、およびエポキシ樹脂への埋め込みを使用したサンプル調製のワークフローを提供します。厚さ800 nm〜1,000 nmの切片は、ウルトラミクロトームを使用して切断されます。チルトシリーズは、ソフトウェアEMツールを使用して、200kVのSTEMで取得されます。このプロトコルは接着細胞に最適化されており、組織や浮遊細胞などの他の種類の検体への変更を可能にしながら、包括的なワークフローを提供します。極低温条件下でのSTEM断層撮影については、Michael Elbaumのグループ19,20の研究を参照してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 細胞培養

  1. サファイアディスクの準備
    1. サファイアディスクを100%エタノールで3回20分間洗浄して洗浄します。乾いたろ紙の上にディスクを引っ張って、残りのエタノールを取り除きます。ディスクを37°Cの乾燥室に少なくとも30分間、または完全に乾くまで放置します。
      注:このプロトコルでは、直径3 mm、厚さ0.16 mmのサファイアディスクが使用されます。他のシステム、組織または浮遊細胞に最適化されたワークフローについては、Walther et al.15を参照してください。培養細胞やその他のシステムに関するいくつかの「ヒントとコツ」は、McDonaldらによって提供されています21。
    2. サファイアディスクを50枚ほどきれいな時計ガラスの上に平らに置き、カーボンコーティング装置を使用して厚さ10〜15nmのカーボン層でコーティングすることで、サファイアディスクをカーボンコーティングします。ディスクを120°Cで一晩焼き、炭素層を安定させます。
      注:相関EMアプローチの場合は、座標系を導入します:カーボンコーティングの前にサファイアディスクの上にファインダーグリッドを配置して、グリッドがディスク21にネガとして見えるようにします。
    3. 後でサファイアディスクのカーボンコーティングされた面を識別できるようにするには、鋭利なツール(ピンセットの先端など)を使用して、片側からしか正しく読み取れないカーボンのマークを引っ掻きます。
      注: 「2」または同様の数字をお勧めします(図2A、B)。コーティングされた座標系を持つサファイア円盤については、この手順をスキップします。
    4. サファイアディスクは、さらに使用するまで37°Cの乾燥室に保管してください。
      注: サファイアディスクを再利用すると、高圧凍結中に破損する可能性が高くなるため、お勧めできません。
  2. 細胞培養
    1. 細胞培養に配置する直前に、グロー放電装置でディスクのカーボンコーティング側をグロー放電して親水性にします(たとえば、0.26 mbar、20 mAの電流で40秒間)。次に、ディスクを紫外線に15分間さらして滅菌します。
      注意: 紫外線に30分以上さらされると、カーボンコーティングが損傷する可能性があります。
    2. 滅菌ピンセットを使用して、培地を含む培養皿の底にディスクを置き、ディスクが浮かないようにします。その上にセルを慎重に播種します。サファイアディスクが細胞培養培地に浮いている場合は、実験を繰り返すときにグロー放電を長時間行ってください。
      注: 「2」の向きが正しい、つまりカーボンコーティングされた面が上を向いていることが重要です。最終コンフルエントが~80%のディスク上のセル単層が望まれます。サファイアディスク上の細胞増殖は、周囲の培養皿での細胞増殖と異なる場合があります。プロトコルを続行する前に、ディスク上の細胞の分布と品質を倒立光学顕微鏡で確認してください。細胞の分布は、細胞を播種しながらプレートを穏やかに揺らすことで改善できます。
      浮遊細胞の場合は、15に記載されているように、カーボンコーティングされたサファイアディスクをポリ-L-リジンで覆うか、毛細血管を使用します。ポリ-L-リジンで覆われたディスクを紫外線にさらすと、ポリ-L-リジンコーティングが損傷する可能性があるため、紫外線にさらさないでください。
    3. サファイアディスクを所定の位置に保ちながら、細胞の任意の処理(感染、薬物治療など)を実行します。セルの剥離やカーボンコートの傷を避けるために、ディスクを慎重に扱ってください。それに応じて細胞をインキュベートします。サンプルを高圧冷凍庫1,7,22に輸送する前に、地域の規制に従って、例えば2.5%グルタルアルデヒド、0.1Mリン酸緩衝液(pH 7.3)中の1%サッカロース、または4%パラホルムアルデヒドで化学プレ固定を行います。
      注:感染したサンプルがバイオセーフティレベルの研究所を離れる前に、モデルシステムに適用されるすべての地域のバイオセーフティ規制に準拠してください。

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図2:高圧凍結。 (A)カーボンコートが「2」(左)または相関光学顕微鏡と電子顕微鏡の座標系(右)を示すサファイアディスク。(B)高圧凍結用に準備されたSD-金スペーサー-SDサンドイッチの概略図。ディスク上で増殖した細胞は向かい合っているため、狭い空洞内で保護されています。(C)SDサンドイッチを含む高圧冷凍用ホルダー。(D)HPFホルダーを装填するための材料および装置:(1)加熱プレート、(2)実体顕微鏡、(3)ろ紙、(4)1-ヘキサデセンを含む反応チューブ、(5)ピンセット、(6)コーティングされていないSD、(7)金スペーサー付きペトリ皿、(8)HPFホルダー。(E)HPFシステムのセットアップ:(1)凍結サンプルを移送するためのLNボックス( Fも参照)、(2)凍結後のHPFホルダーのウォームアップをスピードアップするためのヘアドライヤー、(3)LNボックスを補充するための窒素デュワー。(F)高圧凍結後の凍結試料を保持するためのLNボックスで、HPFホルダーを開けることができ、SDを安全に取り扱うことができる中央トラフ(点線の輪郭)を備えています。高圧凍結直後に必要な材料:(1)最大6つのサンプル容器用のホルダー、(2)断熱ピンセット、(3)蓋付きサンプル容器。容器には、液体窒素に浸すように小さな穴と小さな重り(ネジなど)が含まれています。略語: SD = サファイアディスク;HPF = 高圧冷凍庫;LN = 液体窒素。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. 電子顕微鏡検査のためのサンプル調製

  1. 高圧冷凍
    注:このプロトコルは、参照された高圧冷凍庫(HPF、 材料表).説明されている手順は、同じ目的を果たすため、他のマシンでもそれほど変わらないはずです。
    1. 製造元の指示に従って高圧冷凍庫をセットアップしてください。適切な液体窒素供給を確認し(図2E)、マシンの電源を入れて、テスト実行を実行します。
    2. ディスクをHPFホルダーにロードするためのワークスペースを設定します(図2D)。次のアイテムを準備してください:加熱プレート(1)、実体顕微鏡(2)、ろ紙片(3)、フィラーとしてヘキサデセンを含む反応チューブ(4)、ピンセット(5)、セルで奇数のSDを凍結するための空/コーティングされていないサファイアディスク(6)、金スペーサー(7)、およびHPFホルダー(8、 図2Cの詳細)。
    3. 凍結サンプルを扱うための作業スペースを準備します(図2E、F)。高圧冷凍を開始する前に、次の機器を準備してください。
      1. LNボックスを準備し、液体窒素(図2E、F)で満たして、凍結したサファイアディスクをHPFホルダーから保存カプセルに移す準備をします。
      2. 小さなデュワー(図2Eの3)を準備し、液体窒素で満たします:凍結プロセス中にLNボックスに液体窒素を数回補充する準備をしてください。
      3. 絶縁ピンセット(図2Fの2)を準備しておきます。
      4. 高圧凍結後にサファイアディスクを保持するサンプル容器を準備します(保存カプセル、図2Fの3)。液体窒素を注ぐための蓋といくつかの穴、および浮かないように小さな重り (小さなネジなど) があることを確認してください。使用前に容器にラベルを貼り、LNボックスで予冷してください。
        注:保存カプセルとしてBEEMカプセルを使用しています。
    4. 細胞がプレフィックスされていない場合、または不可能な場合は加熱プレート(図2Dの1)にサンプルを高圧冷凍庫の近くのインキュベーターに保管して、生理学的条件(37°C、5%CO2)をできるだけ長く維持します。
    5. 高圧凍結を開始する前に、サファイアディスク上の十分な数のセルと良好なセル品質を確認してください。これを行うには、倒立光学顕微鏡を使用してディスクを検査します。
    6. 高圧冷凍を行います。
      1. ピンセットで培養皿から1つのサファイアディスクを取り出し、カーボンコーティングされた面を上に向けてHPFホルダー(図2C)に入れます(「2」は読み取り可能)。その前に、ディスクをろ紙にすばやく浸して余分な培地を取り除きますが、細胞が乾燥しないように注意してください。
      2. 金のスペーサーをヘキサデセンに浸し、サファイアディスクの上に慎重に置きます。2 番目のサファイア ディスクを取り、カーボンコーティングされた面を下に向けてゴールド スペーサーの上に置き、セルが互いを向いたサファイア ディスク - ゴールド スペーサー - サファイア ディスク サンドイッチを形成します。サンドイッチキャビティに空気が閉じ込められていないことを確認してください。
      3. HPFホルダーを閉じます。このステップは、特にプレフィックスが付けられていない生細胞の場合、サンプルへのストレスを最小限に抑えるために、慎重かつ迅速に実行してください。
        注:化学固定剤などの発がん性、変異原性、または生殖毒性(CMR)物質を含む検体の場合は、曝露を最小限に抑えるためにHPFホルダーをヒュームフードの下にロードします。
      4. 凍結プロセスを開始します。HPF ホルダーを高圧冷凍庫にすばやく挿入し、メーカーの指示に従ってロックし、冷凍プロセスを開始します。
    7. ガラス化したサンプルをHPFホルダーから取り出します。凍結したサファイアディスクを運ぶHPFホルダーの先端を予冷LNボックスに素早く移します。ディスクを HPF ホルダーから LN ボックスの中央トラフに慎重に取り外します ( 図 2F の破線)。その後、HPFホルダーを温め、残留エタノールまたはヘキサデセンを取り除いてから、次のサンドイッチの組み立てを開始します。
      メモ:今後は、ディスクに接触するすべてのものが液体窒素で予冷されていることを確認してください。窒素雰囲気中で移送手順を迅速に実行し、試料の解凍を避けるためにディスクを液体窒素に保管します。HPFからLNボックスへのホルダーの移動を事前に練習して、スムーズかつ迅速な移行を確保してください。ホルダーの加温プロセスは、ヘアドライヤーを使用して凍結後にスピードアップできます(図2Eの2)。
    8. サファイアディスクをホルダーから取り外した後、凍結置換装置に移すか、さらに処理するまで液体窒素を保管するために、ラベルの付いた容器に入れます。HPF後にサファイアディスクがしっかりと積み重ねられている場合は、凍結置換の前にメスを使用してサファイアディスクを分離します。
      メモ: ディスクを壊さないように注意し、せん断力を避けてください。このステップに十分な時間を計画します。
  2. 凍結置換
    1. 製造元の指示に従って凍結代替装置をセットアップします。液体窒素デュワーを充填し、サンプルチャンバーを-90°Cに予冷するプログラムを開始します。 置換プロセス全体に十分な液体窒素があることを確認してください。
      注:関連する化学物質は危険です。すべての手順をヒュームフードの下で実行し、地域の環境、健康、安全(EHS)ガイドラインに準拠します。
    2. 0.1%(w / v)酢酸ウラニル、0.2%(w / v)四酸化オスミウム(OsO4)、および5%(v / v)の水をアセトンに含む凍結置換溶液を調製します。6 mLの容量(24個のクライオバイアルを充填するのに十分で、ここで使用する置換デバイスの最大容量に等しい)を調製するには、次の手順に従います。
      1. 酢酸ウラニル6mgを蓋をしっかりしたガラス容器に入れます。
      2. 300 μL の 4% (w/v) 四酸化オスミウムを水に加えます。
      3. 容器を閉じ、5分間超音波処理して酢酸ウラニルを溶解します。
      4. 5.7 mLのアセトンを加え、混合し、凍結置換装置と互換性のあるクライオバイアルで溶液を均一に分割します。
    3. 凍結置換溶液を含む閉じたクライオバイアルを-90°Cで予冷した凍結置換装置に入れ、溶液も-90°Cまで冷却されるまで待ちます(約20分間)。
    4. LNボックスに液体窒素を充填します。サファイアディスクを凍結置換装置に移すには、ピンセット、メス、ペンチ(または大きなピンセット)を液体窒素で予冷します。
    5. 予冷した大きなピンセットを使用して、高圧凍結サンプルの入った保存カプセルを貯蔵タンクからLNボックスに移します。
      注:サンプルの解凍を防ぐために迅速に作業してください。高圧凍結直後にサンプルを処理する場合、このステップはスキップできます。
    6. 高圧凍結サンプルを凍結置換装置に移します。サファイアディスクを液体窒素に保ちながら、1つずつ分離します。各ディスクを凍結置換溶液を含むクライオバイアルに個別にすばやく移し、ディスクが完全に浸漬されるようにします。クライオバイアルを閉じ、すぐに凍結置換装置に戻します。
      注:移送中は、置換溶液が温まるのを防ぐためにクライオバイアルを液体窒素雰囲気中に保管しますが、凍結を防ぐために液体窒素の中に保管しないでください。置換液が温まらないように、バイアルを蓋に近づけて指を持ちます。代替液には有毒物質が含まれているため、取り扱いには注意してください。
    7. すべてのディスクが置換デバイスに転送されたら、置換の凍結プロセスを開始します。-90°Cから0°Cまで16時間かけて温度を徐々に上昇させ、0°Cで1時間のインキュベーションステップを行い、その後1時間かけて20°Cまで徐々に上昇させるように装置を設定します。
    8. サンプルが20°Cに達したらすぐに、100%アセトンでサンプルを3 x 30分間直接洗浄します。
      メモ: ディスク上のセルを乾燥させないでください。ヒュームフードの下で後続のすべての手順を実行します。すべての廃棄物を適切な容器に収集し、地域の EHS 規制に従って処分します。
  3. 埋め込み
    1. 製造元の指示に従ってエポキシ樹脂を新たに調製します。
      メモ:すべての手順は、ヒュームフードの下でエポキシ樹脂を使用して実行します。粘度が低く、サンプルの浸透が良好であるため、包埋手順ごとに新しい樹脂を調製することをお勧めします。
    2. サンプルを事前に埋め込むには、1/3のエポキシ樹脂と2/3のアセトンを含む溶液でサンプルを1時間インキュベートします。溶液を2/3エポキシ樹脂と1/3アセトンに置き換え、3時間インキュベートします。溶液を100%エポキシ樹脂と交換し、バイアルの蓋を開けて一晩インキュベートし、残りのアセトンを蒸発させます。
    3. 翌日、サファイアディスクを、調製したばかりのエポキシ樹脂で満たされた新しい標識反応チューブに移します。反応チューブの壁で支えられたディスクを水平に配置し、細胞のある側が反応チューブ内で上を向くようにします(「2」は実体顕微鏡で読み取り可能)。蓋を開けた状態で反応チューブを60°Cのオーブンに入れ、エポキシ樹脂を少なくとも48時間重合させます。
      注:サファイアディスクの破片を埋め込む必要がある場合は、以前の実験の樹脂ブロックの重合先端を使用して埋め込みます:先端を反応チューブに入れ、チューブに新しい樹脂を充填し、壊れたディスクを重合した先端の上に置きます。
      エポキシ樹脂で汚染された使い捨て消耗品は、廃棄前に樹脂が完全に重合するように、60°Cのオーブンに入れる必要があります。ピンセットなどはあらかじめエタノールで拭くことができます。
    4. 閉じた反応管の先端を液体窒素に約10秒間浸します。続いて、テーブル上の反応管を叩いて、反応管から樹脂ブロックを取り出します。サファイアディスクは、埋め込まれたセルの上にとどまるカーボンコートから簡単に分離します。
      注:包埋培地が液体窒素処理によって誘発される温度変化に耐えることを確認してください。
  4. STEM断層撮影切片の準備
    1. TEMイメージング用の極薄切片よりもはるかに厚い切片を準備し、通常は800 nmから1 μmの間でします。
      注:STEM断層撮影のための切片の準備は、従来の超微小切開術とは若干異なります。STEM断層撮影切片の準備を説明する詳細なプロトコルについては、Walther et al.15 およびVillinger et al.10を参照してください。
      STEM断層撮影切片の準備を続行する前に、細胞の品質が良好であることを確認してください。このために、極薄切片(~70 nm)およびTEM分析を実行します(図3D、E)。
    2. サンプルを高角度に傾けるときにグリッドバーが電子ビームを遮らないように、平行棒の銅グリッドにセクションを収集します。より良いセクションの取り付けのために、グリッドを0.01%ポリ-L-リジンで処理します:0.1%ストック溶液から0.01%ポリ-L-リジンの小さなアリコートを準備し、グリッドをアリコートに浸し、グリッドの縁をろ紙の上にドラッグして慎重に乾燥させます。グリッドをグロー放電し、それらを使用してセクションを収集します。
    3. 傾斜直列アライメントの基準マーカーとして金コロイドで切片を処理します(セクション3を参照)。
    4. セクションにカーボンコートを塗布して、セクションを安定させ、導電性を高めます。

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図3:包埋、トリミング、および極薄切片後の細胞のTEM異なる外観による品質管理。 (A)SD除去後のエポキシ樹脂包埋セル。傷がついた「2」のカーボン層は、樹脂が埋め込まれたセルに残り、はっきりと見えます。ほぼ透明なセルは、ブロック面全体に均等に分布しています。(B) マイクロトミー前にトリミングされたブロック面。傷がついた2の部分が樹脂ブロックの表面に残っています。(C)TEMグリッドに取り付けられた70 nmの薄いセクション。(D)1つの超薄切片全体のTEM概要。不完全な樹脂浸透から生じるセクションの穴(白い矢印)に注意し、一般的なアーティファクトです。(E) (D) で白い長方形でマークされた選択したセルの拡大ビュー。(D)と同様に、不完全な埋め込みが原形質膜(白い矢じり)に見られます。ただし、細胞の残りの部分は良好な保存と埋め込みを示しています。スケールバー = 100 μm (D)、10 μm (E)。略語: SD = サファイアディスク;TEM = 透過型電子顕微鏡。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. イメージング

  1. STEMチルトシリーズ取得
    1. メーカーのガイドラインに従って顕微鏡をセットアップします。ビームの位置合わせが適切であることを確認します。
    2. 顕微鏡で液体窒素デュワーを慎重に充填します。
    3. 顕微鏡操作ソフトウェアで正しい断層撮影ホルダーを選択してください。
    4. グリッドをホルダーに挿入します。グリッドのバーは傾斜軸に対して垂直に向けられ、高い傾斜角でバーが電子ビームを遮断しないように注意してください。
    5. ホルダーを顕微鏡に挿入します。
    6. 次の手順を実行して、梁を位置合わせします。
      1. メーカーから提供された位置合わせファイルをロードします。ビームバルブを開き、とりあえず TEMモードで 作業します。倍率を 約20,000倍 に設定し、 STDフォーカスを押して標準フォーカスを設定します。
      2. サンプルの穴を検索します。これは、低倍率モード( LowMagを押す)で簡単です。
      3. 絞りが挿入されていないことを確認してください。 スポットサイズを1に、アルファを3に設定します。明るさボタンを反時計回りに回し、ビームシフトボタンで中央に配置して、画面上のビームを最小限に抑えます。
      4. ガンの正しい位置合わせ:顕微鏡操作ソフトウェアの 位置合わせ パネルで、[ ガン と 陽極のウォブラー]を選択します。 DEF/STIG ボタンでビームの対称性を調整します。蛍光スクリーン上のビームの動きが均一であることを確認します。 SHIFT ボタンで最も明るい場所を画面の中央に移動します。完了したら、すべて選択を解除します。
      5. コンデンサーの柱頭を修正する: 同じ 位置合わせ パネルで、 CLA と HT ウォブラーを選択します。 DEF/STIG ボタンで調整し、均質な動きを実現します。
      6. コンデンサーレンズの絞りを設定する: 明るさボタンを時計回りに回して、蛍光スクリーンのビームを最大化します。最小のコンデンサーレンズの開口部を挿入し、明るさを交互に切り替えてビームに正しく位置合わせされていることを確認します。ビームが表示画面上で非対称に動く場合は、手動絞りドライブを使用して絞りを手動で調整します。蛍光スクリーンで絞りが歪んでいるように見える場合は、コンデンサーの柱頭 CLA を DEF/STIG で再度補正します(前のステップ3.1.6.5)。
      7. STEMモードに切り替えます(ASIDを選択)。
        注意: 5〜10秒後にレンズの弛緩ダイアログを中断できます。
      8. ステージをサンプルの薄くてコントラストの強い領域に移動します。STD Focusを押して、すべての絞りを取り外します。スポットサイズ1.5nmで倍率25,000に変更し、カメラの長さを80〜120cmに設定し、スポットモードを選択します。
      9. ロンキグラムが表示画面に表示されるまで、ゴニオメーターの Z値 を変更します。ロンキグラムがかすかに見える場合は、カメラの長さを変更します。丸くない場合は、 COND Stig ボタンを使用して調整します。
      10. 最小のコンデンサーレンズ絞りを挿入します。手動絞りドライブを使用して、開口部をロンチグラムの中心に配置します。
    7. 適切な検出器を挿入します。研究課題に基づいて、明視野検出器および/または暗視野検出器を使用します。 スキャン モードをアクティブにし、サンプルの最初のテスト画像を取得します。
    8. 断層撮影に必要な倍率よりも大きい倍率( 800,000倍以上)を選択します。焦点と乱視の補正:重要なサンプル領域へのビーム損傷を防ぐために、関心領域(ROI)の近くで直接行わずにこれを行います。
      注:ゴールドの基準マーカーを使用すると、このステップを簡単にすることができます。
    9. ROIが傾斜範囲全体(つまり、-72°〜72°)にわたって中央に保たれるように、真心の高さを設定します。ROIの近くの特徴を選択し、中央に持ってきて焦点を合わせ、乱視を補正し、ステージを段階的に-72°に傾けます。ホルダーのZ位置を調整してフィーチャーを中央に保ち、必要に応じてコントラストと明るさを調整します。必要に応じて、+72°に段階的に傾けてこれを繰り返します。
    10. ROIに戻り、焦点を合わせて、概要画像を取得して視野を選択します(図4)。チルトシリーズ取得に必要な倍率を設定します。
    11. -72°から+72°までの画像と1.5°ごとの画像の自動チルトシリーズ取得を設定します。
    12. ステージの傾きの方向を切り替えるときに発生する機械的効果を打ち消すには、イメージングを開始する角度よりも大きな角度でチルトシリーズを開始します。-72°から72°までイメージングする場合は、ステージを0°から-74°まで傾けてから、+72°まで画像取得を開始し、-72°で最初の画像を取得します。
    13. 自動チルトシリーズ取得を開始します。取得ソフトウェアで ダイナミックフォーカス を有効にしてください。
      メモ: チルトシリーズの取得が途中で終了した場合は、ユーセントリックの高さを修正してください。特に高倍率では、ROIが視野外に移動するため、自動チルトシリーズ取得に問題が発生する可能性があります。
      STEMおよびTEM断層撮影に一般的に使用されるソフトウェアはSerialEMです。Kirchwegerら20 は、室温のSTEM断層撮影に簡単に適応できるSerialEMを使用したCryo-STEM断層撮影のビデオプロトコルを公開しました。

figure-protocol-3
図4:チルトシリーズ取得。 (A)200kVのSTEM。(B)エポキシ樹脂に包埋された高圧凍結凍結置換細胞のSTEM概要。(C-E)に示したチルトシリーズは、白い長方形でマークされた位置で取得されました。(C-E)-72°から+72°まで取得したチルトシリーズの選択された画像。セクションの両側にある金の基準点は、計算断層撮影再構成に使用されます。白い楕円でマークされたようなクラスター化された基準点は、断層撮影の再構成には使用できませんが、高い傾斜角ではよく認識できます。関心領域の外側にあるこれらまたは同様の構造は、真心の高さを設定するのに役立ちます。スケールバー= 1 μm(B)。略語:STEM =走査型透過型電子顕微鏡。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. トモグラムの再構成とセグメンテーション

  1. 断層撮影再構成を実行します(たとえば、IMODソフトウェアパッケージ23のEtomoソフトウェアを使用)。
    1. チルトシリーズの最初のアライメントを実行し、重み付けされたバックプロジェクションを使用して断層撮影を再構築します。
      注:詳細なプロトコルは、IMODのWebサイトにあります:IMOD断層撮影ガイド(https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/tomoguide.html)。暗視野検出器で取得した画像の処理については、以前に公開された研究11,13を参照してください。
  2. セルラー構造をセグメント化します(たとえば、IMODパッケージの3DMODなどのソフトウェアやAIベースのソリューションを使用)。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

STEMトモグラフィーは、ナノメートル範囲の等方性分解能でTEMトモグラフィーよりも厚い切片を画像化する可能性を提供し、FIB-SEMトモグラフィーと比較して、比較的時間効率の高いイメージングワークフローを提供します。ウイルス学では、3Dでの統計分析やまれなイベントの検索のために、多数の超微細構造の特徴をイメージングできるため、特に有用です。ここでは、これら2つの側面に関してSTEM断層撮影をどのように使用できるかを示す2つの代表的な結果を示します。

出芽組換えVSVビリオンの可視化

さまざまな形やサイズの粒子を形成するウイルスは多種多様です。ウイルス懸濁液中のビリオンの形状を分析するには、多くの場合、ネガティブ染色TEMなどの簡単な方法で十分です。細胞文脈におけるビリオンの形態を特徴付けることは、より困難です。これは、ラブドウイルス科のような異方性形態を持つ粒子を形成するウイルスに特に当てはまります。VSVは、長さ~180 nmの弾丸状のビリオンを形成するラブドウイルスです。浮遊細胞では、ビリオンはランダムに配向しているため、2D画像で弾丸の形状を常に識別することは困難です(図5A-C)。サンプル内のすべての組換えVSVビリオンの弾丸形状を適切に定義するには、等方性分解能を備えた3D法が必要であり、十分に広いサンプル領域にわたって体積情報を提供できる方法が必要です。STEM断層撮影は、単一のデータセットに多くの完全なビリオンを含めることができます(図5D、E)。これにより、細胞ごとに1つのトモグラフィーしか取得されていなくても、統計解析のために多数のビリオンを画像化することができます。比較すると、厚さ200 nmの切片のTEM断層撮影では、少数の完全な組換えVSVビリオンしか捕捉できません(図5Eに示されているように)。

figure-results-1
図5:組換えVSV出芽部位のSTEM断層撮影 。(A-C)厚さ800 nmの切片から得られたSTEM断層撮影の仮想切片からの詳細は、ビリオンの(A、B)方向が異なるため、弾丸の形状が常に見えるとは限らないことを示しています。(C)表示面に平行に向けられたビリオンのみが、明確に定義された弾丸として存在します。(D)組換えVSVの出芽部位は、好ましい方向のないビリオンの大きなクラスターに似ています。(E)断層撮影の側面図は、STEM断層撮影法を使用して、1つのセクションで多くの完全な組換えVSVビリオンをキャプチャする能力を示しています。仮想像スタックの厚さは、この位置で約 600 nm です。破線は、TEM断層撮影用のセクション(200 nm)のおおよその厚さを表しており、いくつかの完全な弾丸状のビリオンのみが含まれます。スケールバー = 500 nm (D)。略語:STEM =走査型透過型電子顕微鏡;VSV = 水疱性口内炎ウイルス。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

EF-Cペプチドナノフィブリルの分解

遺伝子治療の文脈では、形質導入増強ペプチドナノフィブリルが関心のあるトピックとなっています。最近発表された研究24 では、Foerster Resonance Energy Transfer (FRET) イメージングと STEM 断層撮影法 (FRET-3D-CLEM) を使用した相関イメージングを使用して、EF-C ペプチド ナノフィブリルの取り込みと分解を調査しました。互いに近いFRETペアに対応する高いFRET効率は、組み立てられたフィブリルに対応する赤色蛍光を発します。互いに遠く離れたFRETペアに対応する低いFRET効率は、分解されたフィブリルを表す緑色の蛍光を発します。どちらのシグナルも、EF-Cペプチドナノフィブリルを取り込んで分解する過程にあるときに細胞に現れます。FRET効率が高い領域と低い領域は黄色で表示されます(図6A)。

figure-results-2
図6:相関FRETイメージングとSTEMトモグラフィー(FRET-3D-CLEM)によるEF-Cペプチドナノフィブリル分解のイメージング。 (A)FRETペアで標識されたEF-Cナノフィブリルでインキュベートした細胞の共焦点顕微鏡検査。緑色の信号は、推定上分解されたフィブリルに対応します。赤は、推定上無傷の原線維に対応します。黄色は、赤と緑の信号が混在している領域に対応します。ニュー核。(B)同じ細胞からの厚さ800 nmの切片のSTEMの概要。(C)断層撮影の位置が示されます。この画像は、セルがセクションの1つのバーグリッドによって部分的にブロックされていたため、異なるセクションで取得された2つの画像の合成です。核は 、A、 B、 およびCにNuでラベル付けされています。(C)断層撮影からの仮想セクション。赤い矢印は、赤色蛍光シグナルと重なる領域を示します。STEM断層撮影は、無傷の原線維の存在を確認します。緑色の矢印は、分解されたフィブリルがある領域を指します。(D)断層撮影のセグメンテーション。エンドサイトーシスされた糸状体が小胞膜をつまんでいます(白い矢印)。STEM断層撮影(ここでは約:7 μm x 7 μm x 550 nm)で調査できる大量のため、このようなまれなイベントを簡単に観察できます。(E)断層撮影の仮想セクション19、24、および29。ピクセルサイズが6.8nmの場合、セクションはそれぞれ27.2nm離れています。この図は、Rauch-Wirth et al.24 によって公開されたデータから再現されています。スケールバー = 5 μm (A)、1 μm (C)。略語:STEM =走査型透過型電子顕微鏡;FRET = フェルスター共鳴エネルギー移動。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

この相関アプローチによって視覚化を実行し、EF-Cフィブリルが細胞に取り込まれ、その後分解されることを確認しました。光学顕微鏡法では、赤色と緑色のシグナルを提供する電子顕微鏡用の細胞を選択して、さまざまな蛍光シグナルと相関する超微細構造の外観を比較できます。同じ細胞からのSTEM断層撮影は、赤色シグナルがまだ細胞の外側にある原線維に由来するか、マクロピノサイトーシスによって新たに内在化されているように見える可能性があることを示しています(図6C)。さらに、CLEMは、緑色のシグナルが実際に分解されたフィブリルに由来することを確認しました(リソソームに見られる図6B、C (図6C、最大の小胞)。STEM断層撮影と構造の3D視覚化によってアクセス可能な大量のボリュームにより、光学顕微鏡からの信号を超微細構造の特徴と相関させ、それらを解釈することが容易になります。さらに、リソソーム内の糸状偽足のつまみ取り(図6D、E、白い矢印)などのまれなイベントをこのアプローチで検出できます。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

STEMトモグラフィーは、TEMトモグラフィーに匹敵する分解能と、最大1μmの厚さの体積を調査する機能を提供します。したがって、膜リモデリング4、6、25、ビリオンの出芽7、エンドサイトーシス5など、ウイルス誘発性の細胞内構造の変化をイメージングするのに理想的であると考えています。研究課題によっては、他のVolumeEM手法が検討される場合があります。同等の解像度でより広い視野を提供する技術には、FIB-SEMトモグラフィーをお勧めします。FIB-SEM 断層撮影は、解像度が上がるとイメージング時間が長くなるため、同様の解像度で同等のボリュームをイメージングする場合、STEM 断層撮影よりも遅くなります。多くの場合、これは、より小さな視野をイメージングすることによって対抗されます。さらに、6.8 nmのz分解能(図6)は、イオンビームミリングでは技術的に困難です。したがって、FIB-SEMは、通常、数十ナノメートルの(等方性)ピクセルサイズではありますが、細胞全体や組織9、10、26、27などのより大きな構造をイメージングするのに最適です。さらに、FIB-SEM断層撮影では、傾斜シリーズから再構成された断層撮影に典型的な「欠落ウェッジ」効果は示されません。さらに、プラズマ FIB マシンの開発により、より高速で正確なフライス加工を提供する代替品が現在この分野に導入されています。

zの高解像度が重要でない場合は、連続切片のTEMまたはSEMイメージングが代替手段となり得ますが、短時間で非常に広い視野を調査することができますが28,29、通常は異方性分解能で。TEM断層撮影では、連続厚切片からの異なる断層撮影を組み合わせることができます30,31。STEM断層撮影でも同じことが可能です。ただし、調査できる切片の厚さを考えると、多数の断層撮影を組み合わせる必要は少なくなります。ウイルス学では、TEM断層撮影法は、ウイルス誘発性膜リモデリングを特徴付けるためによく使用されます32,33,34,35。TEM断層撮影自体は、ウイルスの複製サイクルに関する貴重な洞察を提供しますが、ほとんどのユースケースは、より厚いボリュームを画像化するSTEM断層撮影の機能から恩恵を受けるでしょう。これは、ラブドウイルス科のような異方性形態を持つビリオンに特に当てはまり、TEM断層撮影は1回のトモグラフィー35で少数の完全なビリオンしか捕捉できない、またはヒトサイトメガロウイルス(HCMV)の細胞質ウイルス集合複合体(cVAC)のサイズを持つ複製コンパートメントで複数の包み込むビリオンをイメージングする場合に当てはまる4。

極低温条件下でのSTEM断層撮影は、さらなる機能的洞察を提供し19 、ビデオプロトコルが利用可能です20。私たちのプロトコルは、サンプルをネイティブ状態で保存する代わりに、ネイティブに近い超微細構造の保存を提供するサンプル調製ワークフローが異なります。高圧凍結凍結置換サンプルのSTEM断層撮影では、極低温EMに見られる超微細構造の保存と原子分解能を達成できませんが、装置の簡素化、より安定した試料、およびより高いスループットの利点の恩恵を受けます。

次の手順は、メソッドを成功させるために重要です。

まず、イメージング実験の明確な目標です。この技術は労働集約的な性質を持っているため、イメージングの明確な目標を持った綿密に計画された実験が必要です。モデルシステム(細胞株とウイルス)に関する詳細な知識は、実行がそれほど難しくない他の方法を使用して事前に生成する必要があります。そのため、光学顕微鏡を用いた事前実験では感染率を最適化し、生物学的システムに合わせて実験条件を調整することを奨励します。最適化パラメータには、ウイルスと画像化するイベントに基づく細胞数、感染の多重度(MOI)、および時点が含まれます。これにより、サンプル中の評価可能な細胞の割合が高くなります。

第二に、高品質のサンプル前処理。私たちは、高品質のサンプル前処理の重要性を強調しています。現時点では、高圧凍結によるガラス化を、細胞のような厚い試料のゴールドスタンダードと見なしています。室温での凍結置換、包埋、およびその後のイメージングは、STEM断層撮影と組み合わせると、高品質の結果を得るための堅牢な方法です。したがって、サンプル前処理のための安定したルーチンを確立することが重要です。このために、高圧凍結に関する文献を強調したいと思います14,21。毒性の低い凍結置換溶液を使用する場合は、Schauflinger et al.36 で説明されているように、四酸化オスミウムの代替品として過マンガン酸カリウムを使用することをお勧めします。

最後に、適切に位置合わせされた顕微鏡を含む、チルトシリーズ取得のためのスムーズに実行されるワークフローは、STEMのユーザー指示に従って確立する必要があり、顕微鏡ごとに異なります。スムーズなワークフローの確立は、スキャン ジェネレーターと画像取得ソフトウェアにも依存します。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JGW、RH、EP、JSR、およびMDは、ウイルスベースの製品の開発と製造に関心を持つ製薬会社であるBoehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG の従業員です。これは紙のデザインには影響しませんでした。したがって、利益相反は報告されません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この出版物は、グローバル開発技術戦略の一部であり、ベーリンガーインゲルハイム開発CMCバイオロジカルズのグローバルテクノロジーマネジメントによってサポートされています。サンプル調製に関する優れた技術支援と有益な議論をしてくれたRenate Kunz氏とJana Apolloni氏に感謝します。技術的な問題やデバイスのメンテナンスに関する優れた支援をしてくれたラインハルト・ヴァイに感謝します。参考に議論してくださり、顕微鏡のセットアップを支援してくれたTorsten Friedrichに感謝します。クラリッサ・リード、ジュリア・ラロッシュ、ヤン・ミュンヒの研究は、ドイツ研究財団(SFB1279)の共同研究センター助成金から資金提供を受けています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1-ヘキサデセンメルク KGaA8220640500
200銅グリッド(平行棒付き)プラノ GmbHG2014C
37 & deg;C乾燥室バインダー有限会社9010-0323
アセトンVWRインターナショナルGmbH20066330
DDSAです電子顕微鏡科学13710
ダイヤモンドナイフダイアトーム社https://www.diatomeknives.com/ultra-35
DMP-30電子顕微鏡科学13600
Embed-812 レジン電子顕微鏡科学14900
EMツールTVIPS GmbHTVIPSソフトウェア:EM-Tools;https://www.tvips.com/imaging-software/em-tools/
エタノール 100%メルク KGaA1.00983.2511
ろ過紙VWRインターナショナルGmbH516-0812
フラッシェンとシュナップデッケルグラス 11 mLVWRインターナショナルGmbH548-0625
Formvar電子顕微鏡科学15830-25
ライカ EM AFS2 フリーズ代替ユニットライカ・マイクロシステムズ GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-afs2/
グロッドソル 25 nmAURION 免疫金試薬&アクセサリー425.011
金の松穴とオスラッシュ;2000年以降;mサイエンスサービスGmbHGA2000-Au
Graiticules Buchstaben-Netzchen Kupferプラノ GmbHNH6C
加熱板MEDAX GmbH &KG中隊12501
高真空蒸気化システム BAF 300BAL-TEC AG
高圧冷凍庫 Wohlwend HPF コンパクト 01エンジニアリングオフィス M. Wohlwend GmbHhttps://www.wohlwend-hpf.ch/index.html
液体窒素タンクH.エルベン有限会社94500
窒素(流体)VWRインターナショナルGmbH-
NMA電子顕微鏡科学19000
四酸化オスミウムChemPur Feinchemikalien und Forschungsbedarf GmbH006051
オーブン120度、Cバインダー有限会社9010-0194
PELCOイージーグローテッド・ペラ社91000
ポリ-L-リシン 0.1% w/v aq。解決策テッド・ペラ社18026
セーフロックチューブ 0.5 mLエッペンドルフSE0030 121.023
サンプル容器(ビームカプセル)プラノ GmbHG360-1
サファイア円盤直径3 x 0.16 mmエンジニアリングオフィス M. Wohlwend GmbH500
ウルトラミクロトム ライカ EM UC7ライカ・マイクロシステムズ GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/de/produkte/em-probenvorbereitung/p/leica-em-uc7/
ウラニル酢酸塩リーデル・デ・ハウンムル;n AG31697
UV光チャンバーディニーズELG100S

参考文献

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