このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

Alu RNAトランスフェクトされた初代マウス網膜色素上皮:加齢黄斑変性症の病理学的に関連するin vitroモデル

562 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/68570

⸱

2025年10月17日

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3National Clinical Research Center for Eye Diseases, 4Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、Alu RNAトランスフェクションを使用して、初代マウス網膜色素上皮(RPE)細胞における加齢黄斑変性症(AMD)の病理学関連モデルを確立する全プロセスについて説明します。

要約

加齢黄斑変性症 (AMD)、特に非滲出性 AMD には、人間の病理をよりよく再現する実験モデルが必要です。現在の in vivo モデルは依然として技術的に要求が厳しく、時間がかかりますが、従来の in vitro システムは疾患特異的な病理学的トリガーを再現できません。ここでは、地理的萎縮病理学に直接関与するレトロトランスポゾンであるAlu RNAをトランスフェクトした初代マウスRPE細胞を使用して、網膜色素上皮(RPE)変性モデルを確立する方法を提示します。

このプロトコルは、初代マウスRPE細胞の酵素単離と、それに続くRPE変性を誘導するためのAlu RNAトランスフェクションについて詳しく説明しています。バリデーションには、形態学的(六角形の構造)、機能的(極性の喪失とマウスタンパク質のZO-1破壊)、および分子分析(定量的PCR)が統合されています。その結果、Alu RNAトランスフェクションによって引き起こされる多因子変化が観察されました:炎症性サイトカイン分泌(マウス遺伝子 Ifn-β、 Il-6、 Tnf-α、p < 0.05)および細胞老化(マウス遺伝子p21 および p53 アップレギュレーション、p < 0.05)。従来の急性ストレス モデルと比較して、このシステムは標準化された技術を通じて AMD の慢性炎症性変性カスケードを要約し、再現性を確保します。このアプローチは、簡素化された in vitro アッセイと複雑な in vivo モデルの側面を組み合わせることにより、レトロトランスポゾン駆動メカニズムを調査し、潜在的な治療候補をスクリーニングするための予備プラットフォームとして機能する可能性があります。

概要

加齢黄斑変性症 (AMD) は、全体的な視覚障害の主な原因です。しかし、非滲出性 AMD の効果的な治療法は依然として限られています。したがって、疾患のメカニズムを明らかにし、治療標的を特定するための再現性のある効率的な研究モデルが緊急に必要とされています1,2。この取り組みの中心となるのは、ブルッフ膜 (脈絡膜) と光受容体 (網膜) の間に位置する単層である網膜色素上皮 (RPE) であり、光受容体機能をサポートし、血液網膜関門を調節し、老廃物の除去を促進することにより、網膜恒常性の維持に極めて重要な役割を果たします 3,4。

RPE細胞の機能不全または喪失は、多くの網膜変性疾患、特にAMDの顕著な特徴であり、RPE機能不全はその進行における初期かつ重要なステップを表します2,4,5。特に、AMDの進行期である地理的萎縮(GA)を呈する患者では、マイクロRNA処理酵素Dicer 1リボヌクレアーゼIII(DICER1)のレベルが低下すると、RPE変性に直接関連し、ヒトの病理に関与するレトロトランスポゾン転写物であるAlu RNAの毒性蓄積が生じます6。

ヨウ素酸ナトリウム (NaIO3) モデルやアミロイド β (Aβ) モデルなどの従来の in vivo モデルは、全身性疾患の複雑さを保持していますが、重大な制限に直面しています。NaIO3 モデルは網膜酸化ストレスと RPE 損傷を急速に誘発しますが、その急性毒性は RPE と光受容体の両方を破壊し、AMD の慢性病理学関連の進行を模倣できず、微妙な RPE 機能障害の治療評価を曖昧にします7。同様に、Aβモデルは疾患固有のストレッサーを導入しますが、in vitroアプローチと比較して広範な技術的専門知識と長期のタイムラインを必要とします8,9。一方、H2O2 やハイドロキノン曝露モデルなどの従来の in vitro RPE モデルは病理学的関連性に欠けており、有毒なタンパク質凝集体や炎症誘因などの疾患特異的ストレッサーを再現できません1。

ここでは、GAの病因に直接関与するレトロトランスポゾン由来のノンコーディングRNAであるAlu RNAを使用して、初代マウスRPE細胞におけるRPE変性モデルを確立するための詳細なプロトコルを提供します6。Alu RNAは炎症経路を活性化し、RPEバリアの完全性を損ない10,11、それによって非滲出性AMDに関連する病理学的特徴を模倣します。この方法は、RPE 細胞を酵素的に単離して培養し、その後 Alu RNA を使用して RPE 変性を誘導する方法です。さらに、この変性モデルを評価するために、形態学的(六角形のアーキテクチャ)、機能的(バリアの完全性と極性の喪失)、および分子(炎症および老化マーカー)の読み出しを組み合わせた包括的な検証システムを提供します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

この研究は、上海交通大学医学部付属の上海総合病院の動物倫理委員会によって承認されました。このプロトコルは、実験動物に関する事務管理規則(国家科学技術委員会が発行)および視覚および眼科研究協会(ARVO)によって確立された眼科および視覚研究における動物の倫理的使用に関するガイドラインに厳密に従っています。このプロトコルで使用される材料の詳細については 、 材料表 を参照してください。

1. 初代マウスRPE細胞の単離

  1. コーティングされたプレートの準備
    1. マトリゲルを150 μLのマトリゲルと13 mLのDMEM / F12(最終濃度約1.14%)の比率で希釈します。
    2. 希釈したマトリゲル(48ウェルプレートで約150 μL)でプレートの底面を均一にコーティングします。37°Cで一晩インキュベートしてゲルを形成します。
  2. 溶液の調製
    1. 10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補完したDulbeccoのModified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12(DMEM/F12)を使用して、完全なRPE培地を調製します。
    2. 4.5 mLのアール平衡塩溶液(EBSS)をパパインバイアル(100単位/バイアル)に加えて、パパインミックスを調製します。
    3. DNase I バイアル (1,000 ユニット/バイアル) に 500 μL の EBSS を加えて、DNase I ミックスを調製します。
    4. 250 μLのDNase Iミックスを4.5 mLのパパインミックスに加え(サプライヤーから提供されたプロトコルを調整して、最終的なパパイン濃度を22 IU / mLにすること)ことにより、パパイン消化液を調製し、最終容量を4.75 mLにします。
  3. 安楽死と組織採取
    1. 150〜200 mg / kg体重の5%ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射により、2〜3週齢のマウスを安楽死させます。心拍と呼吸の停止を確認し、深部麻酔と死亡を確認します。
    2. 核出前に眼領域に70%エタノールを徹底的にスプレーして、表面汚染物質を除去します12、13、14。眼窩周囲の縁を軽く押して、地球を突き出させます。次に、鉗子を使用して眼球を抽出し、解剖を容易にするために視神経を温存します。
      注:すべてのツール(鉗子、はさみなど)はオートクレーブ滅菌され、無菌性を維持するために層流フードの下で手順が実行されます。
    3. 37°Cに予熱した滅菌完全RPE培地に眼球をすぐに浸漬します。
  4. 酵素消化
    注:酵素消化およびその後の手順を含むすべてのステップは、無菌性を維持するために層流フードの下で実行する必要があります。
    1. 眼球を皿に移し、鉗子を使用して、実体顕微鏡下で付着した結合組織と残存する外眼筋を除去します。
    2. 予冷したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS、Ca2+/Mg2+なし、4°C)で目を2回優しくすすぎます。
      注:残留完全RPE培地は、パパイン酵素活性を損なう可能性があります。
    3. 目を1mLのパパイン消化液に完全に浸し、37°Cで45分間インキュベートします。
  5. RPE細胞の分離
    1. 消化後、完全なRPE培地で酵素活性を中和します。
    2. 眼球を皿に移し、実体顕微鏡下で角膜、虹彩、水晶体を切除し、後眼カップを保存します。
      注:RPE細胞は、プロセス全体を通して(単一細胞に解離するのではなく)無傷のシートとして単離され、維持されました。
    3. 網膜-RPE複合体を脈絡膜から分離し、完全なRPE培地で連続シートとしてRPE層を網膜から剥がします。剥離したRPE層を混合物として新鮮な完全RPE培地に均一に集め、続いてマトリゲルでコーティングされた表面で培養します。
  6. 細胞培養
    1. 混合物をマトリゲルでコーティングされた24ウェルプレート(カバーガラス上のウェルあたり8〜10個の眼球、免疫染色用)、マトリゲルでコーティングされた48ウェルプレート(qPCR用、ウェルあたり6〜8個の眼球)、またはマトリゲルでコーティングされた96ウェルプレート(ウェルあたり5〜6個の眼球)に播種します。
    2. 37°Cで5%CO2でインキュベートします。完全なRPE培地を使用して、48時間後に最初の培地交換を行います。最初の交換後、48時間ごとに培地を交換してください。
      注:RPE細胞の極性を可能な限り維持するために、継代培養を繰り返すと分化と機能的完全性が失われる可能性があるため、可能な限り継代を避けてください。
  7. 細胞形態モニタリング
    1. 細胞が特徴的な六角形の形態を持つ単層を形成できるようにします。倒立細胞培養顕微鏡下での形態のモニター

2. RPE変性モデルの誘導

  1. Alu RNAの合成と検証
    1. in vitro転写系を用いてAlu RNAを合成する。
      注:私たちの研究で使用されたAlu RNAの合成は、Ambati Lab6によって記述されたプロトコルに基づいていました。
    2. RNAを精製し、マイクロ分光光度計を使用してその品質を確認します。
  2. Alu RNAトランスフェクション
    注:一次RPE細胞播種の日を0日目と指定しました。5日目に、接着した初代RPE細胞は均一な形態を示し、50%以上の細胞コンフルエンスに達し、その時点で、メーカーのガイドラインに従って、カチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬を使用してAlu RNAトランスフェクションが実施されました。
    結果を検証するために 2 つの対照群が含まれました: i) Alu RNA もトランスフェクション試薬も添加せず、低血清培地を代替品として使用した陰性対照 (NC)。ii)リポソームコントロール(LC)では、Alu RNAを省略しましたが、同量のトランスフェクション試薬を低血清培地と混合して細胞に適用して、リポフェクション関連効果を制御しました。次の手順は、Alu RNAトランスフェクション手順の概要です。
    1. トランスフェクション手順の前に、既存の培地をウェル(48ウェルプレート)あたり300 μLの完全RPE培地に交換します。
    2. 低血清培地中でAlu RNAおよびカチオン性脂質ベースの試薬を使用したトランスフェクション複合体を調製します。
      1. ミックス1を1.2 μLのカチオン性脂質ベースの試薬と18.8 μLの低血清培地で調製します。穏やかに混合し(渦を起こさないでください)、室温で5分間インキュベートします。
      2. 6 μLのAlu RNA(100 μg/mL)と14 μLの低血清培地でMix 2を調製します。
      3. 20 μLのMix 2を20 μLのMix 1に滴下して、トランスフェクション複合体を調製します。
        注:Alu RNAは、ウェルあたり1.2 μLのカチオン性脂質ベースの試薬(1.2 μLの試薬:0.6 μgのRNA比)を使用して、ウェルあたり0.6 μgの最終濃度でトランスフェクトしました。
      4. 軽くフリックして混ぜます。その後、室温で20分間放置します。
    3. 40 μL/ウェルのトランスフェクション複合体を24ウェルプレートの各ウェルに加えます。プレートを37°C / 5%CO2 インキュベーターに48時間置きます。
    4. トランスフェクションの48時間後にqPCR、免疫染色、およびその他の実験手順を実行します。

3. 変性モデルの検証

注:包括的なモデル検証実験は7日目に実施されました。

  1. 極性およびバリア完全性評価のための免疫蛍光染色
    1. 培養したRPE細胞を4%メタノールフリーのホルムアルデヒドで室温で20分間固定します。1x PBSで3 x 10分洗浄します。
    2. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の5%ウシ血清アルブミン(BSA)との非特異的結合を1時間ブロックします。
    3. 一次抗体の抗ZO1(3%BSAで1:1,000希釈)およびファロイジン488(3%BSAで1:1,000希釈)と4°Cで一晩インキュベートし、光を避けて。
    4. 細胞をPBSで3 x 10分間穏やかに洗浄します。
    5. 二次抗体(3%BSAで1:1,000希釈)と室温で1時間インキュベートします。
    6. サンプルを1x PBSで3 x 10分間洗浄します。
    7. DAPI(PBSで1:1,000希釈)で10分間対比染色します。
    8. サンプルを1x PBSで3 x 10分間洗浄します。
    9. 24ウェルプレートからカバーガラスを慎重に取り外し、封入剤を一滴あらかじめロードしたスライドガラスの上に置きます。40倍/0.95対物レンズを使用して共焦点画像をキャプチャします。
  2. 老化および炎症マーカーの定量的 PCR (qPCR)
    注:グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(マウス遺伝子 Gapdh)を、閾値サイクル(Ct)値の正規化のための内部参照遺伝子として使用しました。すべての定量的PCR(qPCR)反応には、実験グループごとに3つの生物学的反復が含まれていました。プライマー配列は、 補足表S1に記載されている。
    1. RNA抽出
      1. 溶解バッファー(トータルRNAキット)を培養プレート(10 cm²表面積あたり1 mL)に加え、室温で5分間インキュベートします。
      2. 13,400 × g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。 上清を新しいRNaseフリーチューブに移します。
        注:サンプルに破片(透明細胞ライセートなど)がない場合は、このステップをスキップしてください。
      3. 200 μLのクロロホルムを上清に加え、15秒間ボルテックスし、室温で3分間インキュベートします。
      4. 13,400 × g で 4 °C で 10 分間遠心分離します。 上部水相(~500 μL)を新しいチューブに移します。
      5. 水相に0.5容量のエタノールを加えます。ピペッティングで穏やかに混合します。
      6. 混合物をシリカ膜カラム(Total RNA Kitに含まれています)にロードします。13,400 × g で 30 秒間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
      7. 500 μLのタンパク質除去バッファー(トータルRNAキット)をカラムに加えます。13,400 × g で 30 秒間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
      8. 500 μLの洗浄バッファー(Total RNA Kit)をカラムに加えます。13,400 × g で 30 秒間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
      9. 前の手順 3.2 を繰り返します。
      10. 空のカラムを13,400 × g で2分間遠心分離し、メンブレンを乾燥させます。
      11. 30〜100 μLのRNaseフリー水をメンブレンに加えてRNAを溶出します。室温で2分間インキュベートします。13,400 × g で 2 分間遠心分離します。
    2. 相補的DNA(cDNA)合成
      1. 260 nmおよび280 nmの分光光度計を使用してRNA濃度を測定します。
        注:1.8〜2.0のA260/A 280 比は、許容可能なRNA純度に関連していると考えられます。
      2. RNaseフリーチューブで反応ミックスを調製します:RNAテンプレート(500-1,000 ng):X μL(その濃度に関連)、5x逆転写バッファー:4 μL、RNaseフリー水:20 μLまで。
      3. 次のプログラムを使用して、反応混合物をサーマルサイクラーでインキュベートします:37°Cで15分間、85°Cで5秒間、および4°Cで無期限に保持します。
    3. qPCR検査
      1. 各反応のqPCRマスターミックスを調製します(合計10 μL):TBグリーン(プレミックスTaqに含まれる):5 μL、ROX色素(プレミックスTaqに含まれる):0.2 μL、フォワードプライマー(1 μM):0.2 μL、リバースプライマー(1 μM):0.2 μL、RNaseフリー水:3.4 μL、cDNAテンプレート:1 μL。
      2. 10 μLのマスターミックスを96ウェルプレートの各ウェルに加えます。
      3. 接着剤光学カバーでプレートを密封します。300 × g で 1 分間遠心分離します。
      4. リアルタイムPCRシステムで次のプログラムを実行します。ステージ1:95°Cで30秒間。ステージ2:40サイクル:95°Cで5秒、60°Cで30秒。ステージ3:融解曲線解析。
      5. 2-ΔΔCt法15を使用して、標的mRNAの相対発現レベルを計算します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

Alu RNAトランスフェクション前の初代マウスRPE細胞
0日目(図1)に、初代マウスRPE細胞を単離し、健康なRPE細胞に典型的な特徴的な六角形の形態を示しました。これらの細胞は、よく組織化された単層を維持しました。細胞は、六角形の形状と明確に定義された境界によって証明されるように、初期の構造組織化とタイトジャンクションの形成を可能にするために培養されました。この形態は、その後のRPE変性の誘導のベースラインとして機能しました。RPEバリアの完全性もこの段階で維持され、5日目にAlu RNAトランスフェクションが行われる前に細胞が機能状態にあることが確認されました(図1)。これらの観察結果は、RPE 細胞の単離と初期培養の成功を確認し、細胞の形態と機能に対する Alu RNA トランスフェクションの影響を研究するための信頼できる基盤を提供します。

Alu RNAトランスフェクション後のRPE形態学的変化、...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

私たちの目標は、最小限のリソース制約で高解像度のイメージングと機構分析を可能にする、再現性がありアクセス可能な RPE 損傷モデルを確立することでした。このアプローチにより、共焦点Zスタックイメージング(0.5μmステップサイズ)による頂端タイトジャンクション断片化や基底細胞骨格の混乱など、Alu RNA誘発性構造破壊を対照群と比較して明確に視覚化しました。酵素消化とAlu RNAトランスフェクションという2つの重要なステップにより、システムの信頼性が保証されます。パパインベースの単離(22 IU/mL、37°C、45分)を用いて、偏光と一致する構造的特徴を観察し、特徴的な六角形の形態(図1A、B)によって部分的に示されるように、タイトジャンクションの完全性を達成しました。特に、変更によりプロトコルの適応性が強化される可能性があります。RPE収量が最適でない場合は、生後年齢に応じて±10分以内に酵素消化時間を調整することをお勧めします。0.6 μg/ウェルのAlu RNAで48...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、科学技術イノベーション行動計画医療イノベーション研究特別プロジェクト(23Y11901300)、中国国家自然科学基金(82171076)、上海市教育委員会(2023ZKZD18)によって部分的に支援されました。Alu RNAの親切な贈り物をしてくれたL.Z教授に感謝します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1300シリーズクラスII、タイプA2生物学的安全キャビネットサーモサイエンティフィック
37 & 度;C/5% CO2 インキュベーターサーモサイエンティフィック
4%パラホルムアルデヒド(PFA)サービスバイオG1101-500MLの
ヒトAlu RNAL.Z.から贈られた
抗ウサギ二次抗体、Alexa Fluor 568(ヤギ)Invitrogen サーモサイエンティフィックA11011
Applied Biosystems MicroAmp 接着剤光学カバーサーモフィッシャーサイエンティフィック
Applied Biosystems MicroAmp Optical 96ウェル反応プレートサーモフィッシャーサイエンティフィック
Applied Biosystems ViiA 7 リアルタイム PCR システムサーモフィッシャーサイエンティフィック遺伝子発現定量解析のためのリアルタイムPCRシステム
ウシ血清アルブミン(BSA、フラクションV)ビヨティーンST023-50g
Carl Zeiss Primirvert倒立細胞培養顕微鏡ツァイス細胞形態モニタリング用
遠心分離機 5424 Rエッペンドルフ
クロロホルムシグマRNA抽出における相分離
共焦点レーザー走査顕微鏡(LSM900+Cell discover 7)ツァイス免疫蛍光マーカー(ZO-1やF-アクチンなど)の高分解能イメージング。
Costar 24/48/96ウェルプレートコーニング
カバーガラスサーモフィッシャーサイエンティフィック免疫蛍光イメージング用の24ウェルプレートで使用します。
DAPIの熱62248
デジタルドライバスムラブ
DMEM/F12ギブコRPE細胞を増殖させる培地 
ダルベッコリン酸緩衝液(D-PBS)シェアバイオSB-CR017
アール's 平衡塩溶液 (EBSS)ギブコRPE単離中のパパインとDNase Iの希釈に用いる平衡塩溶液
エタノール(絶対)シグマRNA沈殿とカラム洗浄
ウシ胎児血清 (FBS)シグマ完全なRPE細胞培養培地の場合
鉗子解剖用
Lipofectamine 3000 (カチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬)サーモフィッシャーL300015Alu RNAをRPE細胞にトランスフェクトするには
マトリゲルコーニング356234RPEの接着と分極をサポートするコーティングプレート用のマトリックス(1.14%希釈)。
メタノールフリーホルムアルデヒドサーモサイエンティフィック免疫蛍光法でエピトープを保存するための代替固定剤(4%)
マイクロピペットエッペンドルフ
Nanodrop 2000分光光度計サーモサイエンティフィックRNA濃度と純度を測定
ニコン ECLIPSE Ti-S倒立蛍光顕微鏡ニコン染色サンプルの蛍光イメージング
オリンパス SZX16 実体顕微鏡オリンポスマウス眼球の解剖とRPEの分離に
オプティMEMギブコトランスフェクション複合体調製用低血清培地
パパイン解離システムワージントンLK003150働く酵素用
ペニシリン-ストレプトマイシン ギブコ完全なRPE細胞培養培地の場合
ペントバルビタールナトリウム塩シグマ安楽死剤
ファロイジン488 アブカム176753極性評価用
PrimeScript RT試薬キットタカラRR037AcDNA合成用逆転写キット(qPCRテンプレート調製)
RNAsimpleトータルRNAキット天玄DP419RNA抽出用
TBグリーン プレミックスEx Taq (Tli RNaseH Plus)タカラRR420A型qPCR用
ZO-1ウサギポリクローナル抗体プロテインテック21773形態学的評価用

参考文献

  1. Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 13 (4), 359-377 (2018).
  2. Fleckenstein, M., Schmitz-Valckenberg, S., Chakravarthy, U. Age-related macular degeneration. JAMA. 331 (2), 141-157 (2024).
  3. Kaufmann, M., Han, Z. Rpe melanin and its influence on the progression of AMD. Ageing Res Rev. 99, 102358(2024).
  4. Du, J., Zhu, S., Lim, R. R., Chao, J. R. Proline metabolism and transport in retinal health and disease. Amino Acids. 53 (12), 1789-1806 (2021).
  5. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Prog Retin Eye Res. 79, 100858(2020).
  6. Kaneko, H., et al. DICER1 deficit induces Alu RNA toxicity in age-related macular degeneration. Nature. 471 (7338), 325-330 (2011).
  7. Anderson, B. D., Lee, T. T., Bell, B. A., Wang, T., Dunaief, J. L. Optimizing the sodium iodate model: Effects of dose, gender, and age. Exp Eye Res. 239, 109772(2024).
  8. Qarawani, A., et al. PEDF-derived peptide protects against amyloid-β toxicity in vitro and prevents retinal dysfunction in rats. Exp Eye Res. 242, 109861(2024).
  9. Chen, S. -J., et al. Cytoprotective potential of fucoxanthin in oxidative stress-induced age-related macular degeneration and retinal pigment epithelial cell senescence in vivo and in vitro. Mar Drugs. 19 (2), 114(2021).
  10. Kerur, N., et al. cGAS drives noncanonical-inflammasome activation in age-related macular degeneration. Nat Med. 24 (1), 50-61 (2018).
  11. Kim, Y., et al. Dicer1/ Alu RNA dysmetabolism induces caspase-8-mediated cell death in age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (45), 16082-16087 (2014).
  12. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  13. Shang, P., et al. A novel method of mouse rpe explant culture and effective introduction of transgenes using adenoviral transduction for in vitro studies in AMD. Int J Mol Sci. 22 (21), 11979(2021).
  14. Sun, J., et al. ROS production and mitochondrial dysfunction driven by PU.1-regulated NOX4-p22phox activation in aβ-induced retinal pigment epithelial cell injury. Theranostics. 10 (25), 11637-11655 (2020).
  15. Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2ˆ(-delta delta ct) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostat Bioinforma Biomath. 3 (3), 71-85 (2013).
  16. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. J Vis Exp. (133), e56997(2018).
  17. Datta, S., Cano, M., Ebrahimi, K., Wang, L., Handa, J. T. The impact of oxidative stress and inflammation on RPE degeneration in non-neovascular AMD. Prog Retin Eye Res. 60, 201-218 (2017).
  18. Liu, X., et al. The novel triterpenoid RTA 408 protects human retinal pigment epithelial cells against H2O2-induced cell injury via NF-E2-related factor 2 (Nrf2) activation. Redox Biol. 8, 98-109 (2016).
  19. Bhattarai, N., et al. Resvega alleviates hydroquinone-induced oxidative stress in ARPE-19 cells. Int J Mol Sci. 21 (6), 2066(2020).
  20. Chen, C., et al. Role of unfolded protein response dysregulation in oxidative injury of retinal pigment epithelial cells. Antioxid Redox Signal. 20 (14), 2091-2106 (2014).
  21. Lin, C. -H., et al. Low-luminance blue light-enhanced phototoxicity in A2E-laden RPE cell cultures and rats. Int J Mol Sci. 20 (7), 1799(2019).
  22. Lewis Luján, L. M., et al. Nutraceuticals/drugs promoting mitophagy and mitochondrial biogenesis may combat the mitochondrial dysfunction driving progression of dry age-related macular degeneration. Nutrients. 14 (9), 1985(2022).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

Alu RNAトランスフェクションマウス初代培養網膜色素上皮（RPE）細胞RPE変性酵素的分離炎症性サイトカイン分泌細胞老化定量PCR慢性炎症

この記事は公開されました

動画は近日公開

お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。