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方法論記事

ヒト腎動脈枝のマルチレベル顕微解剖と機能構造プロファイリング

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DOI:

10.3791/68579

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2025年9月5日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cardiovascular Sciences, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center; State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 2Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 3Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, Peking University, 4Department of Urology, Peking University First Hospital; Institute of Urology, Peking University; Beijing Key Laboratory of Urogenital Diseases (Male) Molecular Diagnosis and Treatment Center, National Urological Cancer Center, 5Institute of Cardiovascular Diseases, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 6NHC Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides, Peking University

この記事について

サマリー

この記事では、ヒト腎動脈枝の単離と機能評価のための段階的なプロトコルを紹介し、医薬品開発のための前臨床研究を促進します。

要約

腎血管機能障害は、急性腎障害、腎虚血、高血圧などの複数の臨床症状の病因において重要な役割を果たしており、臨床管理に重大な課題をもたらし、患者の転帰に悪影響を及ぼします。腎内動脈の分離と機能的特徴付けは、特に腎障害に関連する腎血管機能障害の根底にあるメカニズムを解明し、標的治療の開発を導くために非常に重要です。臨床的重要性にもかかわらず、さまざまな分岐レベルにわたるヒト腎内動脈を分離し、機能的に評価するための標準化されたアプローチは、未開発のままです。このプロトコルは、生理学的および病理学的条件の両方下での機能的および構造的評価を組み込んだ、腎内動脈枝の体系的な分離と集学的評価のための包括的なフレームワークを提供します。この方法論には、次の 3 つの重要な要素が含まれます: (1) 構造確認のためのヘマトキシリン-エオシン (H&E) 染色を伴う、ドナー腎臓からの腎内動脈の正確な解剖学的同定と顕微解剖。(2) 測定の再現性と信頼性を高めるためのワイヤー ミオグラフィーにおける厳密な正規化手順。(3) 精密ワイヤー筋造影技術を使用した血管運動反応の定量的分析。正規化は筋肉の長さと張力の関係に基づいており、動脈セグメントの増分ストレッチにより最適な安静時張力が確立され、アクチンとミオシンの重複が最大化され、それによってピーク収縮反応が引き出されます。ワイヤー筋造影では、孤立した血管セグメントが 2 本の平行なワイヤーの間に吊り下げられ、血管張力を正確に測定できます。この技術は、厳密な正規化プロトコルを適用することにより、さまざまな病態生理学的状態や薬理学的介入にわたる血管反応性の再現性と信頼性の高い定量化を可能にします。

概要

腎臓は、代謝老廃物の除去、電解質バランス、体液調節など、非常に高い血流を必要とする機能を通じて人間の恒常性を維持する重要な器官です。生理学的条件下では、腎臓は毎分心臓から送り出される総血液量の約 25% (心拍出量) を受け取り、全身血流における腎臓の重要な役割と、全体的な生理学的バランスを維持する上での腎灌流の決定的な重要性を強調しています1。腎動脈系は、全身の血行動態の変化に適応しながら GFR を維持するために、この大量の血液供給を正確に調節します。したがって、腎灌流の障害は、急性腎障害や腎虚血などの症状における糸球体濾過率 (GFR) の低下に寄与する重要な病理学的メカニズムです。さらに、ショック、心機能障害、敗血症など、腎血流を損なう全身性疾患に続発して頻繁に発生します 2,3,4,5。腎動脈は腎臓内で連続した分岐を遂げ、最初に髄質錐体間の腎柱を通る葉間動脈に分かれます。皮質髄質接合部に到達すると、これらの血管は弓状動脈を生じさせ、皮質と髄質の境界に沿ってアーチ状に描きます。これらの曲線血管から、皮質実質に放射状に浸透する小葉間動脈が出現し、最終的に求心性細動脈を介して糸球体毛細血管に血液を送り込み、個々のネフロンを灌流します1,6,7。葉間動脈、弓状動脈、および小葉間動脈は腎臓の重要な抵抗血管系を構成し、腎内血行動態と圧力制御の主要な調節因子として機能します 1,8。これらの血管の正確な分離と特性評価は、腎灌流恒常性を支配する基本的なメカニズムを解明するために重要です9。さらに、さまざまな病態生理学的条件下での不均一な血管反応性は、腎保護の可能性を有する新規血管拡張剤を開発するための戦略的枠組みを提供します10,11。

現在、腎血流の変化を監視するために臨床画像技術 (超音波など) が日常的に使用されています。しかし、腎灌流の重要な決定要因である腎血管張力を直接評価するための基礎研究における実験的方法論は、依然として限られています 12,13,14,15。ワイヤーミオグラフィーシステムは、血管、気管16、17、18、直径50μmから10mm16、19、20の範囲の小さな生体組織の張力変化をin vitroで測定する確立された実験プラットフォームです。ワイヤーミオグラフィーは動物実験に広く適用されていますが、血管構造と機能の種間の違いにより、げっ歯類の血管が人間の血管生理学を表現できる範囲が制限されています21。したがって、さまざまな解剖学的レベル (葉間、弓状、および小葉間) でのヒト腎内動脈の正確な同定と分離は、その生理学的特性、疾患関連の機能変化、および病理学的損傷メカニズムに関する包括的な in vitro 調査を可能にするために非常に重要です。このシステムは、さまざまな血管作動性化合物を使用した薬理学的介入と組み合わせると、単離された動脈輪における血管収縮/血管拡張反応の動的評価と定量的記録を可能にし、制御された実験条件下で血管反応性を調査するための強力なツールを提供します19,22,23。

このプロトコルは、ヒトの腸内動脈枝(葉間動脈、弓状動脈、および小葉間動脈)の正確な解剖学的局在化と顕微解剖のための包括的な方法論を詳述し、続いて、血管作動性薬に対する反応性の違いを評価するために、 in vitro 血管張力モニタリングシステムを使用した機能的特徴付けを行い、それによってこれらの血管セグメント間の構造的および機能的区別の両方を確立します。解剖学的局在化と薬理学的反応性プロファイリングおよび組織病理学的分析を組み合わせることにより、血管作動剤に対する領域特異的な血管応答の包括的な評価を可能にするex vivo プラットフォームを確立します。

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プロトコル

ここで説明するプロトコルと例は、北京大学第一病院泌尿器科 (承認番号 2023yan500-002) によって審査および承認され、ヘルシンキ宣言に従って実施されました。すべての参加者は、参加前に書面によるインフォームドコンセントを提供しました。

1. 溶液の調製

  1. pH 7.4で、119.0 mM NaCl、4.7 mM KCl、2.5 mM CaCl2、1.0 mM MgCl2、25.0 mM NaHCO3、1.2 mM KH2PO4、および11.0 mM D-グルコースを含むクレブスリンゲル溶液(クレブス)を調製します。
  2. pH 7.4で、64.0 mM NaCl、60 mM KCl、2.5 mM CaCl2、1.0 mM MgCl2、25.0 mM NaHCO3、1.2 mM KH2PO4、および11.0 mM D-グルコースを含む高カリウム塩溶液(60K+)を調製します。

2. 試薬の調製

注:医薬品を受け取ったらすぐに、製品安全データシート(MSDS)に記載されている詳細に従って保管してください。

  1. 167.21 mgのフェニレフリンを10 mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解することにより、フェニレフリン(Phe、ストック中の10〜1 M)を調製します。原液を-80°Cで保存し、使用日に使用濃度として10-6、10-5、10-4、10-3、10-2Mに希釈します。
  2. 18.166 mgのアセチルコリンを10 mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解することにより、アセチルコリン(ACh、10〜2 Mのストック)を調製します。原液を-80°Cで保存し、使用当日に使用濃度として10-5、10-4、10-3、10-2Mに希釈します。

3. 腎臓組織の採取と腎内動脈の隔離

  1. 術前のコア針生検または術中凍結切片によって組織学的に確認された、腎細胞癌と診断された成人患者を募集します。
    注: 根治的腎摘出術が予定されている患者は、手術標本が腫瘍縁の遠位にある無傷の腎内動脈セグメントへのアクセスを提供するため、特別に選択されます。これらのセグメントは正確に解剖および分離できるため、悪性組織の干渉を受けることなくヒトの腎血管生理学を詳細に研究できます。組織学的確認により、がんの正確な同定と腫瘍境界の明確な描写が保証され、実験的調査のための正常で腫瘍のない動脈セグメントの選択が容易になります。
    1. 血管機能への交絡影響を避けるために、重大な併存疾患(高血圧、糖尿病、またはその他の全身性疾患)のある患者を除外し、生理学的評価の信頼性と関連性を高めます。
      注: この実験のサンプルは、北京大学第一病院で根治的腎摘出術が予定されている患者から収集されました。
  2. 根治的腎摘出術では、切除したばかりのヒト腎臓標本を採取し、すぐに氷冷のクレブス溶液に浸して、組織の生存率を維持します。腫瘍縁の遠位にある肉眼的に正常に見える領域のみが動脈解離のために保持されます(図1A)。
    注:最適な腎内動脈隔離のためには、根治的腎摘出術中に隣接する健康な組織を全層皮質髄質ウェッジとして採取し、それによって皮質から髄質血管系までの完全な動脈樹を温存する必要があります。
    1. 切除した組織をすぐに200 mLの冷たいクレブス溶液に保存します。容器を氷の上に置き、採取後2時間以内に断熱クーラーバッグに入れて実験室に輸送します。その後の解剖および機能分析のために生存率と構造的完全性を維持するために、輸送中ずっと組織が完全に水没したままであることを確認してください。
      注:組織の生存率と生理学的機能を維持するために、4°Cでのクレブス溶液での単離およびその後の保存の全プロセスは、6時間以内に完了する必要があります24、25、26、27。溶液は、血管内腔からの血液成分の除去を促進しながら、酸素化と組織の生存率を維持するために、処置中に定期的に交換する必要があります。
  3. 腎門の位置を特定し、腎盂と外側の凸状境界の両方を通過するように切り口を位置合わせすることにより、冠状面を視覚的に識別します。滅菌メスを使用して、冠状面に沿って腎臓を二等分し、対称的な2つの半分を作成します。このアプローチにより、腎ピラミッドや柱などの内部構造が明らかになり、腎内動脈の正確な識別とその後の解剖が容易になります (図 1A)。
    注:腎動脈の分離を容易にするために、腎盂の一部、腎錐、および断面の脂肪を最初に除去して、より多くの血管を露出させる必要があります(図1B)。血管を切らないように注意してください。
  4. 実体顕微鏡下で、10 cmの黒底培養皿で顕微解剖ハサミと鉗子を使用して、葉間動脈、弓状動脈、および小葉間動脈を細心の注意を払って分離します(図1C)。
    注:ヒトの腎臓では、小葉間動脈は腎錐体を通っており、3つの動脈枝1,8の中で最も厚い血管壁を特徴とし、平均直径は約1〜2 mmです。皮質髄質接合部では、葉間動脈は弓状動脈に移行し、皮質髄質境界に沿って半円弧を形成し、平均直径は約500μmです。血管はさらに小葉間動脈である腎皮質に分岐し、3つの中で最も薄い血管壁と最小の直径で、約200μmです(図1C)。さらに、3つの血管枝を区別する場合、解剖学的局在化は、絶対血管径測定よりも重要な情報を提供します1,8。
    1. 動脈から周囲の組織と脂肪をそっと取り除き、10 cmの黒底培養皿で徹底的に洗浄します(図1B)。
  5. 単離された腎動脈(小葉間動脈、弓状動脈、および葉間動脈)を次の実験に使用します。
    1. パラフィン包埋および組織学的切片に適した、分離された組織を約 3 mm の標準化された長さに慎重にトリミングすることにより、組織学的処理用の動脈セグメントを準備します。各サンプルを2 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)に室温で1時間固定し、組織の形態を保ちます。固定後、確立された組織学的プロトコルに従って、その後のヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色のための標準的な脱水、洗浄、およびパラフィン包埋プロトコルで処理します(図2)。
      注:潜在的な組織学的評価のために、確立された組織学的プロトコルに従って、サンプルは、コラーゲン沈着を評価するためのマッソンのトリクロ染色、または弾性繊維の視覚化のためのVerhoeff-Van Gieson(EVG)染色を受けることができます28,29。
    2. 血管機能研究の場合は、検査まで腎内リングを氷冷のクレブス溶液に保管します。動脈輪は完全に水没する必要があります。
      注:ウェスタンブロット/qPCRなどの後続の分子アッセイでは、解剖後すぐに新鮮な検体を液体窒素で急速凍結し、RNAの完全性を維持し、タンパク質の分解を防ぐために、以前に公開された手順に従って-80°Cで保存します30,31。

4. 動脈リングの取り付け

  1. 葉間動脈、弓状動脈、および小葉間動脈を、それぞれの異なる解剖学的位置(図1C)と直径範囲(図2)によって識別し、血管機能研究用の顕微解剖はさみを使用して、それらを約2 mmの長さのリングに慎重に切断します(図3A)。
    注:機能テストまで、すぐに分離された各動脈リングを5 mLの氷冷クレブス溶液に別々に保管します。機能テストでは、長さ1.5〜2.0 mmの分岐していない血管リングを選択し、きれいに垂直にカットします。取り付けの困難を防ぐために2.0mmを超えるリングや、不安定な張力記録を避けるために1.5mm未満のリングは除外します。
  2. ステップ4.1で述べたように、すべての動脈リング(葉間動脈、弓状動脈、および小葉間動脈から別々に)を準備し、クレブス溶液と60K + 溶液の両方を室温に戻します。次に、接続されたコンピュータの電源を入れ、続いてワイヤーミオグラフシステムの電源を入れ、実験を進める前にすべてのコンポーネントが適切に初期化されていることを確認します。
  3. 動脈リングをワイヤーミオグラフチャンバーに取り付ける前に、各チャンバーを5mLのクレブス溶液で2回すすぎ、清浄度を確保し、残留物質を除去してから、各チャンバーに5mLのクレブス溶液を追加します。
    1. ミオグラフに内蔵された温度制御システムを使用して、溶液を37°Cに加熱します。同時に、実験中に適切な酸素化とpHバランスを維持するために、接続されたガスラインを介してガス(95%O2 と5%CO2の混合物)で溶液を連続的に曝気します。
  4. 各動脈リングに直径40μmの長さ3cmのガイドワイヤーを2本準備し、単離された動脈リングをクレブス溶液を含む別の10cmの黒底培養皿に慎重に移します。
    注:異なる直径の血管には、異なる直径のガイドワイヤーを選択する必要があります。直径約100μm以下の動脈リングには、15μmのガイドワイヤーが必要です。直径が100μmから200μmの場合、25μmのガイドワイヤーが使用されます。直径が200μmを超える場合は、40μmのガイドワイヤーを使用できます。実験の一貫性を保つために、1回の実験内で同じタイプのすべての容器に同じ直径を使用することをお勧めします。19.
  5. 最初のガイドワイヤーを皿内の動脈リングに慎重に挿入し、ガイドワイヤーの片側を90°曲げてから、時計回りのネジ締め用の器具付属の専用ネジを使用して、クランプタイプのサンプルホルダーに固定するためにチャンバーに移します(図3B)。
    注:ガイドワイヤーは、動脈リングをサンプルホルダーに取り付けるときに動脈リングを移動する際に構造的なサポートを提供するために挿入され、取り扱いによる損傷や歪みを最小限に抑えます。
  6. 動脈リングをホルダーに固定する前に、血管の長さと幅を記録します。動脈リングを2つのホルダーの間に置き(図3C)、マイクロメータースケールを読み取ります(1スケールは10μmを表します)。ホルダーが互いにほとんど接触していないときに測定されたスケール値を差し引いて(図3D)、動脈リングの長さと幅を決定します。
  7. 別のガイドワイヤーを血管に通し、最後に反対側に固定します。ガイドワイヤーを両側の固定ネジに時計回りに巻き付け、サンプルホルダーの表面にしっかりと取り付けられていることを確認します。
    注:固定プロセス全体では、血管内皮の損傷を避けるために、血管を引っ張ったり、ガイドワイヤーで血管の内壁を引っ掻いたりしないようにする必要があります。ガイドワイヤーは、重ならないように単層で固定ネジに巻き付ける必要があります。2本のガイドワイヤーは、同じ水平面上にあり、互いに平行で、互いに交差してはなりません。また、ガイドワイヤーを固定した後、両側のサンプルホルダーを近づけます。ただし、 図3E および 図3Fに示すように、力を避けるために、実際に接触せずに互いに近づける必要があります。
  8. チャンバーをワイヤーミオグラフシステムに取り付け直します。次に、蓋をしてガスを換気します。センサーを接続し、血管張力テスト用のデータ収集ソフトウェアを開きます。

5. 最適な初期張力測定のための血管固有の正規化

注:最大の収縮反応性のための最適な安静時張力として定義される安定したベースライン条件を確立することは、再現性のある機能測定にとって重要です。しかし、固有の個人間の生理学的差異により、ヒトの血管は、動物の血管と比較してベースラインの機械的特性においてより大きな変動性を示します32,33,34,35,36。これらの要因は、固有の血管の不均一性 (直径、壁の厚さ、収縮特性における構造的および機能的差異など) と組み合わされて、集合的にベースライン張力の有意な変動につながります。したがって、実験の再現性を確保するために、各血管を個別に正規化することをお勧めします。ワイヤーミオグラフシステムには専用の正規化モジュールが含まれており、各血管のベースライン張力を正確に決定できます。

  1. 手順4.1〜4.8で説明されているように、動脈リングをチャンバーに取り付けます。チャートの記録を開始し、チャネルをゼロにし(図4A)、少なくとも30分間安定化してから、正規化を続行する前にチャネルを再度ゼロにします。
  2. DMTメニューから[正規化設定]を選択し(図4B)、パラメータを次のように設定します(図4C)。
    1. 接眼レンズキャリブレーション(mm / div):1;目標圧力 (kPa): 13.3;IC1/IC100: 0.9;オンライン平均時間 (秒): 3;遅延時間(秒):60。
      注:IC1は最大有効力生成時の内部血管円周を示し、IC100は100 mmHg経壁圧に対応する円周を表します。ヒトの腎動脈は、実験的決定とIC100比の再利用のために一貫した血管特性を持つ動物モデルとは異なり、標本間のかなりの変動性を示し、標準化が必要です。個々のヒト標本では血管の直径、肉厚、機械的特性が大きく異なるため、各血管は独自のベースライン特性を確立するために独立した正規化を受ける必要があります。したがって、ここでは 0.9 の比率がプロトコル初期化のプレースホルダーとして確立され、このプロトコルでは実際には使用されていません。
  3. 標的動脈に対応するチャネルを選択し、 DMT メニュー(図4C)から正規化画面を開き、適切なデータを入力します。
    1. 組織エンドポイント: a1 は0、 a2 は血管の長さ(mm)である必要があります。線径:40μm(使用する線の直径を入力);マイクロメーターの読み取り:マイクロメータースケールの値、ポイント の追加 をクリックしてポイントを記録します。
  4. 準備ができたら、[ 点の追加 ] をクリックして最初の点を記録し、正規化手順を開始します。
  5. 受動的ストレッチを適用し、3分間待ってから、マイクロメーターの読み取り値を次のポイントとして入力し、5 mLの60K + を加えてカリウムを介した血管収縮を誘発します(図5)。
  6. 収縮が停滞期に達するまで待ちます。次に、60K+ 溶液を5mLのクレブス溶液で3回洗い流し、カリウム活性化力から各ストレッチでの受動力を差し引いて、トレースから能動力データを計算します(図5)。
  7. 有効力が最大に達するまでステップ5.5〜5.6(「ストレッチ-60K+ 刺激-洗浄」ステップ)を繰り返し、血管の有効力生成が最大になる最適なベースライン張力を決定します(図5)。
  8. 実験の次のステップに進む前に、チャンバー内の動脈リングを10分間平衡化します。

6. 腎動脈輪反応性の検出

  1. 実験開始前に、各チャンバー内のクレブスの容量が5 mLであることを確認してください。
  2. フェニレフリン誘発性濃度依存性収縮を評価するには、累積Pheを半対数刻み(10〜9 〜10〜4 M)で適用します37。
  3. 最低のPhe濃度(10〜9 M)から始めます。5 mLのクレブスバッファーを含むチャンバーに5 μLのPheストック(10〜6 M)を加え、継続的に監視し、収縮が安定するまで待ち(張力が2〜3分間変化せず)、ポイントに印を付けてから、次の濃度をハーフログ刻みで追加します。最終濃度(10-4 M)に達するまで繰り返し、全体を通して一貫したモニタリングを維持します(図6)。
  4. 追加の薬物試験のために、張力がベースラインに戻り、少なくとも10分間安定するまで、温かい5 mLのクレブス溶液でチャンバーを少なくとも5回洗浄します。
  5. アセチルコリン誘発性濃度依存性血管拡張を評価するには、累積AChを半対数刻み(10〜8 〜10〜5.5 M)で適用します。
    注:正常な血管系では、アセチルコリン(ACh)に対する応答は、内皮完全性の機能的指標として機能します37,38。ACh に対する血管拡張反応は、健康な血管における NO を介した弛緩による内皮機能を反映しています。ただし、病理学的条件下では、一酸化窒素 (NO) のバイオアベイラビリティの障害および/または受容体シグナル伝達経路の変化により、この応答が減衰または廃止される可能性があります。
  6. 10〜4 M Pheで容器を事前に契約し、5 mLのクレブスバッファーを含むチャンバーに5 μLのPheストック(10〜1 M)を加え、15分間インキュベートします。最低ACh濃度から始めて、5 mLのクレブスバッファーを含むチャンバーに5 μLのAchストック(10〜5 M)を加え、継続的に監視して血管拡張反応(持続的な微量検出によって確認)を待ち、ポイントをマークしてから、次の濃度に進みます。すべてがテストされるまで繰り返します(図7)。
  7. ファイルを保存し、動脈リングを削除して実験を完了します。10 mLの8%酢酸溶液で3分間インキュベートしてチャンバーを徹底的に洗浄し、10 mLの水で3回すすいでください。次に、10 mLの95%エタノールで3分間インキュベートし、10 mLの水で再度3回すすいでください。最後に、ヒーターとガスの両方をオフにし、ガスを止める前にすべての液体が除去されていることを確認してください。

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結果

人間の腎臓では、葉間動脈は対応する静脈に沿って腎錐体の間を走っています。比較的厚い血管壁と重要な脂肪組織の包囲を特徴とするこの動脈は、特に慎重な解剖を必要とします。周囲の脂肪組織は、分離手順中に過度の力を加えないように注意深く除去する必要があります(図1C)。

弓状動脈は解剖学的に皮質髄質接合部に位置し、腎錐体の外縁に沿って特徴的な半円形のアーチを形成します。葉間動脈と比較して、血管壁が薄いです。隔離中は、動脈の湾曲した形態のために周囲の実質組織を除去する際には特に注意する必要があります。解剖は、弧の長さ全体に沿って外膜と末梢実質の両方に体系的に対処する必要があります。不完全な除去は、解放された動脈が未クリア側に向かって曲がり、その後の実験操作を損なう可能性があるため、両側から同時に実質組織を完全に除去するには特別な注意が必要です(図1C)。

小葉間動脈は、比較的薄い血管壁で腎皮質を直線的に走っています。周囲...

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ディスカッション

腎灌流の安定性は、重要な治療標的であると同時に、血行動態の病態生理学への窓としても機能します39,40。私たちは、新鮮な腎摘出標本からのヒト腎動脈の階層的分離と機能評価のためのプロトコルを提示し、現在の方法論の大きなギャップに対処します。死体標本や動物モデルに限定された既存のアプローチとは異なり、私たちの技術は、形態学的完全性と生理学的機能の両方を維持しながら、生存可能な腎内動脈(葉間から小葉間)の信頼性の高い分離を可能にします。この進歩により、ヒトの腎血管生物学を調査し、潜在的な治療法をスクリーニングするための忠実度の高い実験プラットフォームが確立されます。

このプロトコルの有効性は、いくつかの重要なステップにかかっています。まず、根治的腎摘出術から得られた腎組織を氷冷のクレブス溶液に直ちに浸漬し、続いて6時間以内に単離を完了することで、血管反応性を最適に維持します。第二に、私たちの特殊な顕微解剖...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者らは、この研究に参加してくれたボランティアに感謝するとともに、腎臓組織を提供してくれた北京大学第一病院泌尿器科の外科スタッフにも感謝したいと思います。この研究は、北京市自然科学基金(YZにF251013、YLに7232096)によって支援されました。中国国家科学基金(82325004、92168114からY.Z.、82170422からY.L.);中国国家重点研究開発プログラム (2021YFF0501401、2018YFA0800501 から YZ、2021YFF0501404 から YL、2023YFC2415500 から LY);北京大学第三病院の血管恒常性とリモデリングの国家重点研究所の研究プロジェクト (北京大学; 2024-VHR-SY-07 から Y.Z.);2023年北京市衛生健康委員会首都医学科学技術イノベーション成果変革優秀推進プログラムプロジェクト(YC202301QX0162からL.Y.まで);国立高レベル病院臨床研究資金(北京大学第一病院科学技術成果変革インキュベーション指導基金プロジェクト、2024CX24〜L.Y.)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
塩化アセチルコリンSigma-Aldrich、メルク、ダルムシュタット、ドイツA6625
黒底培養皿デンマークのMyo Technology、オーフス、デンマーク300412
CaCl2Sangon Biotech Co.,Ltd.、上海、中国A501330
D-グルコースSangon Biotech Co.,Ltd.、上海、中国A610219
デュモン鉗子デンマークのMyo Technology、オーフス、デンマーク300413
Geuder解剖はさみデンマークのMyo Technology、オーフス、デンマーク400431
ガイドワイヤーデンマークのMyo Technology、オーフス、デンマーク400447直径40&マイクロ;m
KClSangon Biotech Co.,Ltd.、上海、中国A100395
KH2PO4Sangon Biotech Co.,Ltd.、上海、中国A100781
LabChart Professionalバージョン8.3 ADInstruments, オーストラリア-
MgCl2·6H2OSangon Biotech Co.,Ltd.、上海、中国A100288
マルチミオグラフシステム デンマークのMyo Technology、オーフス、デンマーク620メートル
NaClSangon Biotech Co.,Ltd.、上海、中国A100241
NaHCO3Sangon Biotech Co.,Ltd.、上海、中国A100865
フェニレフリンSigma-Aldrich、メルク、ダルムシュタット、ドイツP6126

参考文献

  1. Molema, G., Aird, W. C. Vascular heterogeneity in the kidney. Semin Nephrol. 32 (2), 145-155 (2012).
  2. Jentzer, J. C., et al. Contemporary management of severe acute kidney injury and refractory cardiorenal syndrome: Jacc council perspectives. J Am Coll Cardiol. 76 (9), 1084-1101 (2020).
  3. Kanji, H. D., et al. Difference between preoperative and cardiopulmonary bypass mean arterial pressure is independently associated with early cardiac surgeryassociated acute kidney injury. J Cardiothorac Surg. 5 (1), 71(2010).
  4. Kwiatkowska, E., Kwiatkowski, S., Dziedziejko, V., Tomasiewicz, I., Domanski, L. Renal microcirculation injury as the main cause of ischemic acute kidney injury development. Biology (Basel). 12 (2), 327(2023).
  5. Ruilope, L. M. Hypertension in 2010:Blood pressure and the kidney. Nat Rev Nephrol. 7 (2), 73-74 (2011).
  6. Barger, A. C., Herd, J. A. The renal circulation. N Engl J Med. 284 (9), 482-490 (1971).
  7. Beloncle, F., Piquilloud, L., Asfar, P. Critical care nephrology. , third edition, Elsevier. Philadelphia. (2019).
  8. MompeóCorredera, B., HernándezMorera, P., CastañoGonzález, I., QuintanaMontesdeoca, M. D. P., MederosReal, N. Regions of the human renal artery:Histomorphometric analysis. Anat Cell Biol. 55 (3), 330-340 (2022).
  9. Evans, R. G., Smith, D. W., Lee, C. J., Ngo, J. P., Gardiner, B. S. What makes the kidney susceptible to hypoxia. Anat Rec (Hoboken). 303 (10), 2544-2552 (2020).
  10. Hwa, J. J., Ghibaudi, L., Williams, P., Chatterjee, M. Comparison of acetylcholinedependent relaxation in large and small arteries of rat mesenteric vascular bed. Am J Physiol. 266 (3 Pt 2), H952-H958 (1994).
  11. Buus, N. H., Van Bavel, E., Mulvany, M. J. Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations. Br J Pharmacol. 112 (2), 579-587 (1994).
  12. Barone, R., et al. Renal arterial and venous doppler in cardiorenal syndrome: Pathophysiological and clinical insights. Biomedicines. 12 (6), 1166(2024).
  13. Cuttone, G., et al. Exploring the utility of renal resistive index in critical care: Insights into ARDS and cardiac failure. Biomedicines. 13 (2), 519(2025).
  14. Li, Y., et al. Clinical practice report of contrastenhanced ultrasound in renal artery disease. J Ultrasound Med. 43 (1), 117-125 (2023).
  15. Andersen, F. T., et al. Continuous assessment of tissue perfusion using quantitative indocyanine green fluorescence imaging during controlled hypo and reperfusion. Surg Endosc. 39 (10), 6512-6521 (2025).
  16. Schubert, R., Gaynullina, D., Shvetsova, A., Tarasova, O. S. Myography of isolated blood vessels:Considerations for experimental design and combination with supplementary techniques. Front Physiol. 14 (8), 1176748(2023).
  17. Wang, Z., et al. Mir1865p carried by M2 macrophagederived exosomes downregulates TRPP2 expression in airway smooth muscle to alleviate asthma progression. Int Immunopharmacol. 148 (1), 114107(2025).
  18. Ikeda, M., Nakada, A., Abukawa, H., Yamazaki, T., Maruyama, I. Vibegron inhibits enhanced spontaneous contractions induced by anoxia/reoxygenation in isolated whole bladder from rats. Eur J Pharmacol. 926 (1), 175017(2022).
  19. Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 321 (1), H77-H111 (2021).
  20. Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. J Physiol. 28 (3), 220-231 (1902).
  21. Darmon, M., Schnell, D., Schneider, A. Monitoring of renal perfusion. Intensive Care Med. 48 (10), 1505-1507 (2022).
  22. Offenhäuser, C., et al. EphA2 regulates vascular permeability and prostate cancer metastasis via modulation of cell junction protein phosphorylation. Oncogene. 44 (4), 208-227 (2025).
  23. Vitverova, B., et al. Soluble endoglin and hypercholesterolemia aggravate endothelial and vessel wall dysfunction in mouse aorta. Atherosclerosis. 271, 15-25 (2018).
  24. Maathuis, M. H. J., De Groot, M., Ploeg, R. J., Leuvenink, H. G. D. Deterioration of endothelial and smooth muscle cell function in DCD kidneys after static cold storage in IGL1 or UW. J Surg Res. 152 (2), 231-237 (2009).
  25. Ingemansson, R., Budrikis, A., Bolys, R., Sjoberg, T., Steen, S. Effect of temperature in longterm preservation of vascular endothelial and smooth muscle function. Ann Thorac Surg. 61 (5), 1413-1417 (1996).
  26. McIntyre, C. A., Williams, B. C., Lindsay, R. M., McKnight, J. A., Hadoke, P. W. Preservation of vascular function in rat mesenteric resistance arteries following cold storage, studied by small vessel myography. Br J Pharmacol. 123 (8), 1555-1560 (1998).
  27. Ingemansson, R., Sjoberg, T., Massa, G., Steen, S. Longterm preservation of vascular endothelium and smooth muscle. Ann Thorac Surg. 59 (5), 1177-1181 (1995).
  28. Zheng, Y., et al. HMGB2 promotes smooth muscle cell proliferation through PPARγ/PGC1α pathwaymediated glucose changes in aortic dissection. Atherosclerosis. 399, 119044(2024).
  29. Zhang, B., Zhang, Y., Deng, F., Fang, S. Ligustrazine prevents basilar artery remodeling in twokidneytwoclip renovascular hypertension rats via suppressing PI3K/AKT signaling. Microvasc Res. 128, 103938(2020).
  30. Somiari, S. B., et al. Assessing the quality of RNA isolated from human breast tissue after ambient room temperature exposure. PLoS One. 17 (1), e0262654(2022).
  31. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  32. Potente, M., Makinen, T. Vascular heterogeneity and specialization in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (8), 477-494 (2017).
  33. Lake, B. B., et al. An atlas of healthy and injured cell states and niches in the human kidney. Nature. 619 (7970), 585-594 (2023).
  34. Greenbaum, S., et al. A spatially resolved timeline of the human maternal-fetal interface. Nature. 619 (7970), 595-605 (2023).
  35. The Tabula Sapiens Consortium. The Tabula Sapiens: A multipleorgan, singlecell transcriptomic atlas of humans. Science. 376 (6594), eabl4896(2022).
  36. Barnett, S. N., et al. An organotypic atlas of human vascular cells. Nat Med. 30 (12), 3468-3481 (2024).
  37. Shen, Y., et al. Targeting cytokinelike protein FAM3D lowers blood pressure in hypertension. Cell Rep Med. 4 (6), 101072(2023).
  38. Zhao, L., et al. Restoration of autophagic flux improves endothelial function in diabetes through lowering mitochondrial ROSmediated eNOS monomerization. Diabetes. 71 (5), 1099-1114 (2022).
  39. Ergin, B., Akin, S., Ince, C. Kidney microcirculation as a target for innovative therapies in AKI. J Clin Med. 10 (18), (2021).
  40. Deferrari, G., Cipriani, A., La Porta, E. Renal dysfunction in cardiovascular diseases and its consequences. J Nephrol. 34 (1), 137-153 (2021).
  41. Owen, M. K., et al. Perivascular adipose tissue potentiates contraction of coronary vascular smooth muscle: Influence of obesity. Circulation. 128 (1), 9-18 (2013).
  42. AyalaLopez, N., et al. Perivascular adipose tissue contains functional catecholamines. Pharmacol Res Perspect. 2 (3), e00041(2014).
  43. AyalaLopez, N., Thompson, J. M., Watts, S. W. Perivascular adipose tissue's impact on norepinephrineinduced contraction of mesenteric resistance arteries. Front Physiol. 8, 37(2017).
  44. Ahmad, M. F., et al. Perivascular adipocytes store norepinephrine by vesicular transport. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (2), 188-199 (2019).
  45. Ya-Jing, W., et al. Adipose tissue-derived cytokines, CTRPs as biomarkers and therapeutic targets in metabolism and the cardiovascular system. Vessel Plus. (1), 202-212 (2017).
  46. Osol, G., Brekke, J. F., McElroyYaggy, K., Gokina, N. I. Myogenic tone, reactivity, and forced dilatation: A threephase model of in vitro arterial myogenic behavior. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283 (6), H2260-H2267 (2002).

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