特定の部位における翻訳後修飾レベルの迅速な In vitro ダウンレギュレーションのための阻害ペプチドの設計と応用

サマリー

ここでは、翻訳後修飾阻害ペプチドであるTAT-PIPの設計仕様、品質管理基準、および機能検証システムの概要を示すプロトコールを紹介します。

要約

タンパク質は生命活動の主要な執行者であり、転写、翻訳、および翻訳後修飾(PTM)レベルで制御されています。さらに、タンパク質は一般にさまざまな種類のPTMと特定のPTMの複数の部位を持っているため、PTMはタンパク質活性を調節するためのより複雑なメカニズムを表しています。プラスミドトランスフェクションまたはレンチウイルスとアデノウイルスは、同定されたすべての部位の中で機能的に重要なPTM部位の初期スクリーニングに使用できる可能性があります。しかし、これらの方法は、細胞や組織への侵入効率が低い、時間とコストが高い、免疫反応の可能性など、常に課題に直面しています。これに対処するために、私たちは最近、TAT-PIPと呼ばれる組換えペプチドの一種、TAT標識PTM阻害ペプチドを開発し、成功裏に採用しました。TAT-PIPは、細胞や組織の侵入を容易にするTATモジュールと、競合的結合を通じて標的部位のPTMを特異的にダウンレギュレートするPIPモジュールで構成されています。ここでは、TAT-PIPの設計仕様、品質管理基準、および機能検証システムの概要を示すプロトコルを紹介します。設計セクションでは、TAT-PIPの一貫性、オプションの長さ、特異性、および保存について説明します。次に、TAT-PIPの有効性と安全性を保証するTAT-PIPの品質試験要件について紹介します。TAT-PIP部分の応用では、TAT-PIPの濃度勾配試験、試験した細胞のインキュベーションプロセス、その後の表現型検出について紹介しました。要約すると、特定の部位を選択的にノックダウンし、結果として生じる表現型を観察してその機能を推測することにより、PTM部位をスクリーニングするための効果的な方法について説明します。この方法は、合成コストが低く、効率が高いため、プラスミドトランスフェクションなどの既存技術の限界を克服します。

概要

タンパク質は生命活動の主要な執行者であり、その生物学的調節プロセスには、遺伝子発現制御の2つの主要な側面、つまり遺伝子転写とmRNA翻訳が関与しています。しかし、過去数十年の間に、翻訳後修飾(PTM)は、細胞機能を調節するためのもう一つの不可欠なメカニズムになりました¹。リン酸化は、研究者に最もよく知られているPTMであり、生理学的機能において特に重要な役割を果たしています。例えば、細胞外シグナル制御キナーゼ(ERK)がThr202およびTyr204部位でMEKキナーゼによってリン酸化された後、そのコンフォメーションが変化して活性部位が露出し、^{転写因子2}などの下流の標的タンパク質が活性化されます。一方、GSK-3βのN末端Ser9がAkt/PKBキナーゼによってリン酸化されると、その基質結合ポケットが塞がれ、キナーゼ活性が失われます³。ユビキチン化は、ユビキチン分子が基質タンパク質に共有結合することで、さまざまな細胞プロセスを調節するもう一つの重要なPTMです。ユビキチンには、7つのリジン残基(K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63)とN末端メチオニン(M1)が含まれています。異なる部位でのユビキチン鎖の結合は、基質タンパク質に異なる運命を与えます。K48結合ユビキチン化の主な機能は、プロテアソーム⁴による分解のために基質タンパク質をマークすることです。逆に、K63結合型ユビキチン化の主な機能は、DNA損傷修復、炎症反応、エンドサイトーシスなどの非分解的なシグナル伝達に関与すること^{である5。}近年、プロテオミクス技術の急速な進歩に伴い、新規PTMの発見が増加しています。古典的なアセチル化を超えて、プロピオニル化、クロトニル化、グルタリル化などの新規なアシル化が同定されています⁶。ヒストン修飾の分野では、ヒストンのラクトシル化はRNAの^m6A修飾と免疫微小環境の恒常性を阻害する⁷。非ヒストン修飾の分野では、ATP5Oクロトニル化の減少は、リン脂質代謝のダウンレギュレーションにおける主要な有害因子である⁸。

PTMの研究を行うためには、PTMプロテオーム⁹の解析を体系的に進める必要があります。この分野には、プロテオームレベルでのPTMプロファイルの解析と、特定のタンパク質のPTM部位の包括的な同定という2つの主要な研究方向性が含まれています。最新の質量分析法では、さまざまなタイプのPTMや特定の部位を効果的に同定することができますが、主要な機能部位のスクリーニングとバリデーションは、依然として研究の進行を制限する主要な科学的課題です。効率的な施設スクリーニング戦略を確立することは、主要な規制施設の機能を解決するための第一歩です。従来の方法では、特定の部位に対する変異プラスミドの構築(不活性化変異、活性化変異)、 in vitro トランスフェクション技術による標的細胞への導入、細胞増殖、アポトーシス、酸化ストレスなどの表現型指標の変化を系統的に評価していました。しかし、この戦略は、卵子や初代組織培養システムのような転写的にサイレントな細胞モデルでは、大きな技術的障害に直面しています。レンチウイルスまたはアデノウイルス形質導入システムは、トランスフェクション効率の問題を部分的に克服することができますが、その応用は、高い経済的コストとウイルス粒子の in vitro 組織モデルの浸透効率の低さという2つの課題に直面しています。一方、変異型ノックインマウスを構築する戦略は、非常に長持ちし、コストがかかります。全体として、機能的に重要なPTM施設の初期スクリーニングのために、経済的で効率的な戦略を策定することが急務です。

近年、私たちのチームは、ポリペプチドの競合阻害に基づいて、TAT-PIP、TAT-conjugated PTM inhibitory peptideと呼ばれる迅速なPTMダウンレギュレーション技術を開発し、採用することに成功しました。その主な利点は、機能的に重要なPTM部位の予備スクリーニングを実施するための普遍性と高効率であり、主要なPTM部位の分子メカニズムの詳細な分析のための重要な基盤を提供します。本研究は、TAT-PIPの主要な枠組みと実施プロセスを体系的に解明し、代表的な実験データを通じて特定の部位におけるPTMレベルの制御に有効性を実証するものである。

プロトコル

1. TAT-PIP配列の設計

注:TAT-PIPはペプチドの2つの部分で構成されています(図1):N末端部分はTAT、CYGRKKRRQRRRであり、これはすべてのTAT-PIPで変化せず、 in vitro 培養細胞または in vivo 組織に効率的に侵入するのに役立ちます。C末端部分は、物体タンパク質の特異的なPTM部位(図1、通常は記号「K」のリジン、赤で強調表示)の周りのポリペプチド配列です。PIPの長さは約10〜15 AA残基です(長ければコストが増加し、短くなると特異性は大幅に低下します)。

1. Blast 解析により PIP のシーケンスを最適化します (図 2)。
   1. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ にログインし、blastpをクリックしてタンパク質配列を検索します。
   2. ターゲットタンパク質配列を Enter the query sequence ウィンドウにコピーします。
   3. [検索の選択] で、[標準データベース] オプションを選択します。プログラム選択でblastp(タンパク質-タンパク質BLAST)オプションを選択します。最後に、[BLAST]ボタンをクリックします(図2B)。
   4. 特異性が最も高いペプチドセグメントをPIP候補として選択します。
2. 最終的なPIPのために、ヒトとマウスの間で相同性比較を行います。
   1. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ にログインし、blastpをクリックしてタンパク質配列を検索します。
   2. ヒトとマウスの両方の種からタンパク質の配列をコピーし、入力配列ボックスに貼り付けます。
   3. 送信ボタンをクリックして結果を取得します。
   4. ヒトとマウスの相同性が 100% の PIP を選択します (図 2C)。
3. N端子TATとC端子PIPで構成されるTAT-PIPの構成を決定します。

2. TAT-PIPの合成と品質検証

1. 質量分析でペプチド純度を98%以上確保し、その後の実験に影響を与える可能性のある不純物を避けるための広範なプロジェクト経験を持つ企業を選択してください。
   注:ポリペプチドのエンドトキシンレベルは≤10である必要があり、病原体を含まない必要があります。

3. TAT-PIPの適用

1. 病原体を含まない超純水を使用してTAT-PIPを溶解し、ストック濃度10 mg/mLを達成します。部分的な変性を引き起こす凍結融解サイクルが繰り返されるのを避けるために、ストックを小さなチューブに分注します。
   注:1%ジメチルスルホキシド(DMSO)を添加すると、TAT-PIPの構造を保護するのに役立ちます。
2. TAT-PIPで細胞を処理。
   1. 標準培養条件(37°C、5%CO₂)で、10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグルス培地でヒト胚性腎臓293T細胞を培養します。
      注:播種後、細胞を約12時間培養し、コンフルエンシーが約70%に達したときにTAT-PIP処理を行いました。
   2. 溶解させたTATをPBSを用いて1 mg/mLに希釈し、適切な投与量(培地の推奨最終濃度:0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL)を細胞培養培地に直接24時間加えます。
   3. 元の培地で細胞を3回洗浄します。
   4. ウェスタンブロット解析を実施して、PTMのダウンレギュレーションの程度を確認します。
      注:経験とその後の実験結果に基づいて、TAT-PIPの最適な最終濃度は0.1 mg / mLです。.

4. ウェスタンブロット

1. 細胞タンパク質サンプルを調製します。
   1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を3回洗浄し、200 μLの強力な放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)溶解バッファー(フェニルメチルスルホニルフッ化物[PMSF]-プロテアーゼ阻害剤を添加)を細胞ペレットに加え、予備溶解のために5分間インキュベートし、細胞スクレーパーでそれらをこすり落とします。
   2. 超音波クラッシャーを使用して、12%のエネルギー強度で5秒間混合物を超音波処理します。
   3. 細胞溶解物を氷上で30分間冷却し、13400g、4°Cで10分間遠心分離します。
   4. タンパク質を含む上清を、予冷した1.5mLの遠心分離チューブに移します。上清に1/4容量の5xサンプルバッファーを加えます(最終濃度1x)。
   5. 混合物をボルテックスし、乾燥したサーモスタットで95°Cで5分間加熱し、氷の上で2分間冷やします。
   6. Nanodrop上のBradfordアッセイを使用して、総タンパク質濃度を測定します。
2. ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を行います。
   1. SDS-PAGEには12%分解能ゲルと4%スタッキングゲルを使用してください。
   2. タンパク質サンプルを指定された容量に従ってウェルにピペットで移します。
   3. 電気泳動装置の電源を入れ、まず80 V、300 mAで30分間運転し、スタッキングゲルと分離ゲルの間の界面のバンドを位置合わせします。その後、120 V、300 mAで45分間運転し、タンパク質を分離します。
   4. 高速転写装置を使用して、タンパク質をゲルからポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンに移します。
3. ブロッキング、抗体インキュベーション、および可視化を行います。
   1. 0.1% Tween 20 (TBST) を含むトリス緩衝生理食塩水中の 5% スキムミルクで PVDF メンブレンをブロックし、室温 (RT) で 1 時間インキュベートします。
   2. 1:1000に希釈した一次抗体を5%スキムミルク/PBSTで1:1000に希釈し、ローテーター上で4°Cで一晩インキュベートします。
   3. メンブレンをTBSTで3回(各10分)洗浄します。
   4. 5%スキムミルク/TBSTで1:1000に希釈した二次抗体とメンブレンを室温で1時間インキュベートします。
   5. メンブレンをTBSTで3回(各10分)洗浄します。
   6. メンブレンを時系列(5秒、10秒、20秒、30秒、60秒、120秒)で露光し、電界化学発光(ECL)デバイス下で最適な画像を取得します。

5. TAT-PIPのin vitro培養細胞における機能検証

1. 細胞内活性酸素種(ROS)レベルを検出します。
   1. 293T細胞を1 x 10⁵ 細胞/ウェルの最適密度で24ウェル培養プレートにプレート化します。
   2. TAT標識ヒストン3リジン116クロトニル化阻害ペプチド(THCIP)(0.1 mg/mL)で細胞を24時間処理し、PBSで細胞を洗浄します。
   3. 細胞を10 μMのジクロロ-ジヒドロ-フルオレセインジアセテート(DCFH-DA)と無血清DMEMで37°C、暗所で20分間インキュベートします。
   4. 倒立蛍光顕微鏡で画像を取得し、ImageJの Measure 関数で蛍光強度を測定します。
      注:FITCフィルターセットを使用し、465〜495 nmの発光フィルター、505Aのダイクロイックミラー、および512〜550 nmの2番目の発光フィルターを使用しました。
2. 細胞増殖アッセイ
   1. 293T細胞を1ウェルあたり1 x 10⁵ 細胞の最適密度で24ウェル培養プレートに播種します。
   2. 各ウェルに10 μLのCCK-8試薬を添加します。
   3. 細胞を37°Cで2時間インキュベートします。
   4. マイクロプレートリーダーを使用して450nmでの吸光度を記録し、ブランクウェル(培地+CCK-8)からバックグラウンドシグナルを差し引きます。
   5. データを正規化して細胞生存率を計算します。
3. 細胞ATPレベルの検出
   1. 溶解バッファーで細胞を溶解します。ライセートを12,000 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 その後の分析のために上清を収集します。
   2. ATP標準溶液を溶解バッファーで希釈し、0.5 μM、1 μM、2 μM、3 μM、4 μM、5 μMの濃度勾配を作成します。
   3. 細胞上清またはATP標準物質を含む各ウェルに20 μLのATP検出溶液を添加します。
   4. マイクロプレートリーダーを使用して発光信号をすぐに測定します。
      1. [プレート レイアウト]をクリックし、[プレート テンプレートの変更]で対応するプレート テンプレートを選択して、サンプル(標準とサンプル)を設定します。
      2. 次に、左側の [Protocol ]をクリックし、[ Chemiluminescence] ボタンを選択し、[ Start ]をクリックして検出を開始します。
   5. ATP標準の発光シグナルから標準曲線を生成し、それを使用して細胞上清中のATP濃度を定量します。

結果

この研究では、TAT-PIPを使用して、競合阻害に基づいて特定の部位で標的タンパク質のPTMレベルをダウンレギュレートする戦略について説明しています。典型的な例では、ここでの TAT-PIP の名前は THCIP に変更されます。これは、2つの機能モジュールで構成されています:(1)、THCIPが細胞に浸透することを可能にするN末端細胞貫通ペプチドTAT(CYGRKKRRQRRR)。(2)H3のK116周りのC末端配列AIHAKRVTIMPKDは、K116でクロトニル化される内因性H3と特異的に競合します（図2A)。この部位に対する特異的抗体は、H3crHS(H3リジンクロトニル化抗体)と名付けられています。

THCIPの設計プロセスは次のとおりです:機能ドメインとしてターゲットPTMサイトの隣接する配列から15-20アミノ酸を選択し、次のバイオインフォマティクス基準に基づいて最適化します:(1)、オフターゲット効果を避けるために、マウスタンパク質データベース(図2B

ディスカッション

このプロトコルでは、次の手順が重要です。まず、TAT-PIPデザインはペプチドの特異性に対処します。次に、アプリケーションと最終的な濃度を最適化します。最適化された濃度は、効率的かつ迅速なノックダウンを達成するために慎重にテストする必要があります。第3に、TAT-PIPの効果を検証するためには、1回の実験に頼って追加の効果を確認するのではなく、複数回の実験を行うことが推奨されます。

既存の方法を比較すると、この方法は主に3つの利点を示しています:まず、プラスミドトランスフェクションやレンチウイルスまたはアデノウイルス感染と比較して、TAT-PIPはあらゆる細胞や組織への侵入において常に高い効率を示します。第二に、TAT-PIPは、機能的に重要なPTM部位の初期スクリーニングにおいて他の戦略よりも優勢です。第三に、TAT-PIPは、キナーゼ活性を阻害する点で阻害剤よりも特異的です。

私たちの研究では、HDAC2-S424 リン酸化を選択的に阻害する TAT-PI...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
自動多機能イメージングシステム	Tanon	4600	露光計は、現像処理後の膜上の蛍光または化学発光シグナルを検出することにより、標的タンパク質バンドを同定し、可視化します。
細胞計数キット-8	GLPBIO	GK10001	この方法は、細胞代謝生存率と細胞数との相関関係に基づいて、CCK-8試薬Dulbecco'への細胞の還元能力を測定することにより、細胞の増殖能力を評価し
のモディファイドイーグル」培地(DMEM)	Gibco	11995065	ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)は、幅広い哺乳類細胞の増殖をサポートするために広く使用されている基礎培地です。
ECL化学発光基質	バイオシャープ	BL520B	ECL基質は、化学発光反応により光シグナルを生成し、特定のタンパク質や核酸の検出を可能にします。
電気泳動装置	タノン	EPS600	電気泳動装置の主な役割は、生体高分子&zwnjを分離し、分析することです。
強化されたATPアッセイキット	Beyotime	S0027	このキットは、サンプルのATPレベルを効果的に検出することができます
胎児ウシ血清(FBS)	Gibco	16000-044	ウシ胎児血清(FBS)は、細胞の維持と成長に必要な栄養素と成長因子を提供します。
GenScript eBlotL1	GenScript	L00686	この装置は非常に効率的で、ポリアクリルアミドゲルからPVDF膜へのタンパク質移動を15分以内に迅速に達成することができます
倒立蛍光顕微鏡	オリンパス株式会社	IX73	蛍光顕微鏡は、紫外線を光源として使用して、検査対象物に放射線を照射して蛍光を発させ、その下の対象物の形状と位置を観察します。顕微鏡。
NanoDrop2000微量UV-Vis分光光度計	Thermo Scientific	2000	NanoDropは、DNAまたはRNA PVDF膜の濃度を決定するために使用されました
	BioRAD	1620177	このタイプのPVDF膜は、優れた耐薬品性と高いタンパク質結合能力を備えています
ROSアッセイキット	Beyotime	S0033S	キットは、細胞
内の活性酸素種のレベルを正確に検出できますTAT-conjugater H3K16 クロトニル化阻害ペプチド	南京桃府バイオテクノロジー株式会社	CN218107533U	K16
TBST	Biosharp	BL602A	TBSTは、膜上の無関係な物質を洗浄し、実験エラーを減らし、実験結果の精度を確保できます‌
超音波クラッシャー	LICHEN	LC-AUD-150P	装置の主な機能には、細胞の断片化、粒子分散、乳化が含まれます
Varioskan LUX	サーモフィッシャー	VL0000D0	マイクロプレートリーダーは、マイクロプレート内のサンプルの光学信号(吸光度、蛍光、発光など)を検出することにより、生体サンプルのハイスループット定量分析を実現できます