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方法論記事

心不全患者の血漿および糞便代謝産物に関連する腎動脈機能および組織病理学

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DOI：

10.3791/68583

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2025年9月9日

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1Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 2Institute of Cardiovascular Sciences, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center; State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 3Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 4Research Unit of Medical Science Research Management/Basic and Clinical Research of Metabolic Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences, Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, 5Department of Cardiology, State Key Laboratory of Complex Severe and Rare Diseases, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 6Department of Urology, Peking University First Hospital; Institute of Urology, Peking University; Beijing Key Laboratory of Urogenital Diseases (Male) Molecular Diagnosis and Treatment Center, National Urological Cancer Center, 7Institute of Cardiovascular Diseases, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 8Research Center for Cardiopulmonary Rehabilitation, University of Health and Rehabilitation Sciences Qingdao Hospital (Qingdao Municipal Hospital), School of Health and Life Sciences, University of Health and Rehabilitation Sciences

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、心腎症候群における心臓代謝産物による腎血管機能障害を解明するためのマルチモーダルプラットフォームを開発するためのプロトコルを提示します。

要約

腸内細菌叢とそれに関連する宿主微生物の共代謝産物は、特に心腎症候群の文脈において、全身の代謝バランスと心腎軸の重要な調節因子としてますます認識されています。臨床的証拠は、心機能障害が腎臓の病理学的変化を開始または悪化させる可能性があることを示していますが、心腎軸を媒介する重要な代謝シグナル伝達分子とその根底にあるメカニズムはとらえどころのないままです。この研究は、心臓代謝シグネチャと腎血管機能分析を統合する新しい体系的な研究プラットフォームを確立します。(2) ex vivo 腎血管分離および初代培養技術。(3) 血管機能アッセイ、腎血管損傷マーカーの分子生化学検査、および組織病理学的分析を組み込んだ、心腎代謝相互作用のマルチモーダル評価フレームワーク。健康な対照と比較して、心不全患者の代謝産物は腎血管機能を損ない、炎症反応を誘発し、心腎症候群の機能的バイオマーカーとしての可能性を強調しました。この研究は特定の代謝産物に焦点を当てていません。したがって、病原性作用を発揮する特定の種類の代謝産物のさらなる同定と検証は、LC-MS/MS や NMR などの分析技術を使用した将来の研究で必要になります。このプラットフォームの適用により、心疾患関連代謝物が腎血管機能と恒常性を損なうことが明らかになりました。これらの発見は、心腎相互作用の代謝ドライバーに関するメカニズムの洞察を提供し、新しいバイオマーカーと治療標的を特定するためのトランスレーショナルツールを提供します。

概要

心腎症候群 (CRS) は、心臓と腎臓の間の双方向の損傷を特徴とする複雑な病理学的状態です。これら2つの臓器間の複雑な相互依存性は、1836年にロバートブライトによって最初に記述され、進行した腎臓病に関連する心臓の重大な構造変化を体系的に記録しました1。CRS の有病率は、心血管疾患 (CVD) と慢性腎臓病 (CKD) の共存と強く関連しています。研究によると、心不全患者の約 30% も CKD を患っており、CKD 患者の死亡の 44%-51% は心血管イベントに直接起因しています2。

CRS の管理には、いくつかの重大な課題があります。まず、臨床ケアは依然として断片化されており、学際的な調整や早期警告メカニズムが欠如しており、代償不全フェーズ3 での介入の遅れにつながることがよくあります。第二に、現在の治療戦略は逆説的なジレンマに直面しています。利尿薬やレニン-アンジオテンシン-アルドステロン系 (RAAS) 阻害剤などの従来の治療法は、心不全の症状を軽減できます4;しかし、それらを長期間または大量に使用すると、RAAS および交感神経系 (SNS) が活性化され、腎の低酸素症と線維症が悪化し、最終的に利尿薬抵抗性に寄与し、腎機能が悪化する可能性があります5。同様に、アンジオテンシン変換酵素阻害剤 (ACEI) およびアンジオテンシン受容体遮断薬 (ARB) は心腎障害を軽減できますが、血清クレアチニンの上昇または高カリウム血症の懸念により、それらの臨床使用は制限されることが多く、長期治療に耐えられる患者はわずか30%-40% です 6。

これらの課題を考慮すると、新しい治療標的の発見を促進するために、効果的な早期バイオマーカーを特定し、CRS 病因をより深く理解することが緊急に必要とされています。しかし、心腎クロストークの実用的なメディエーター、特に心機能障害と腎血管障害を直接結びつける疾患特異的代謝産物を特定する際の現在の限界は、これらの満たされていない臨床ニーズの解決における進歩を妨げています。新たな証拠は、心疾患関連代謝産物が腎血管恒常性を再プログラミングすることにより、診断バイオマーカーとCRSの機構的ドライバーの両方として機能する可能性があることを示唆していますが、腎障害の開始または増幅におけるそれらの時空間的役割は依然として十分に特徴付けられていません7,8,9。最近の研究では、セラミドなどの内因性代謝産物が、特に心腎疾患下で血管の炎症とリモデリングを積極的に悪化させる可能性があることが実証されており、血管病理における代謝産物センシングのより広範な関連性が浮き彫りになっています10。

CRS で影響を受ける腎コンパートメントの中で、血管系は損傷の主要かつ初期の標的としてますます認識されています。腎微小循環における内皮機能障害は、一酸化窒素のバイオアベイラビリティの障害、酸化ストレス、炎症誘発性および血栓誘発性メディエーターの発現の上昇を特徴とし、微小血管の希薄化、血管透過性の増加、および局所的な低酸素症に寄与します11。並行して、動脈の緊張とコンプライアンスの調節に不可欠な血管平滑筋細胞 (VSMC) も、CRS における代謝調節不全に対して脆弱です。蓄積された証拠は、疾患関連代謝産物が VSMC 収縮性を破壊し、不適応なリモデリングを促進し、血管硬さの増加と腎灌流障害に寄与する可能性があることを示しています。それらの基本的な役割にもかかわらず、血管機能障害の平滑筋駆動のメカニズムは、現在のCRSモデルでは十分に調査されていません8,12。これらの病態生理学的変化は、腎障害を悪化させるだけでなく、不適応な神経ホルモンの活性化と全身の血行動態障害を促進し、心機能をさらに損ない、CRS の進行を永続させます13。したがって、腎血管損傷を標的とすることは、CRS の初期病因へのメカニズム的に有益な窓を提供し、心臓と腎臓の代謝相互作用を調査するための合理的な焦点を提供します。

これらのギャップに対処するために、私たちの研究では、CRS 進行の中心的な調節因子としての心不全関連代謝産物の体系的な同定と機能検証を優先しています。この研究は、これらの代謝産物がどのように腎血管機能障害を誘発し、炎症カスケードを活性化し、組織修復メカニズムを損なうかを明らかにすることにより、観察バイオマーカーの発見とメカニズムの病因研究の間の重大な断絶を埋めます。動物モデル、 in vitro 細胞培養、人工多能性幹細胞(iPSC)由来オルガノイドなど、CRSの研究に使用される従来のモデルには、それぞれ制限があります14。動物モデルは、臨床的関連性を制限する種間の違いに悩まされています。 in vitro 培養は臓器レベルの統合を欠いていますが、iPS細胞由来のオルガノイドは、心筋細胞と尿細管上皮細胞の相互作用をモデル化することはできますが、機能的には未熟なままであり、発生初期に限定されています15。さらに、現在の血管オルガノイド系は主に内皮単層または原始的な微小血管で構成されており、代謝障害に対する血管レベルの反応を評価するために必要な収縮性平滑筋層と機能的読み出しが欠けています16。

対照的に、当社のプラットフォームはヒト由来の心臓代謝産物と ex vivo ヒト腎血管系を採用しており、生理学的に関連性があり、構造的に無傷の ex vivo ヒト腎動脈を可能にし、血管界面での心腎代謝相互作用の生理学的に関連性があり、機械的に有益な分析を可能にします。これは、心腎症候群の進行の根底にある臓器間代謝コミュニケーションのモデル化において独自の利点をもたらします。当社の先駆的な統合心腎研究プラットフォームは、心不全由来の血漿/糞便代謝産物のメタボロミクスプロファイリング、 ex vivo 腎血管分離/培養システム、およびマルチモーダル機能分子組織病理学的評価という3つのコアイノベーションを相乗効果を発揮します。このプラットフォームの各コンポーネントは、サンプルあたり200 μLの血漿または0.1 gの糞便物質の使用、2 mmのヒト腎動脈セグメントを37°Cで5%CO2 で最大24時間インキュベート、および血管損傷マーカーの定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)ベースの検出など、再現性と翻訳の関連性のために最適化されました。このシステムは、代謝物の特徴の診断の可能性を解読するだけでなく、代謝物の特徴の因果関係を CRS 病理に直接結び付け、臓器間代謝調節不全の分子レベルのマッピングを通じて治療標的の特定を可能にします。メカニズムの発見と臨床翻訳を橋渡しすることで、この二重に焦点を当てたパラダイムは、CRS 管理を事後的な症状制御から積極的なバイオマーカー主導の介入に移行します。

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プロトコル

この研究で採用された実験プロトコルと症例方法論は、北京大学第一病院の泌尿器科 (倫理審査コード: 2023yan500-002) および北京協和医科大学病院 (承認番号 I-23PJ585) によって倫理的に承認され、ヘルシンキ宣言に概説されている原則を厳格に遵守しました。この研究では、2019 年 7 月から北京協和医科大学病院 (PUMCH) に入院し、少なくとも 2 人の経験豊富な心臓専門医によって心不全 (HF) と診断された男性または女性の患者を募集しました。合計 4 人の心不全患者 (HF1-HF4) が血漿および糞便代謝産物の抽出に含まれました。研究に含める前に、すべての被験者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。実験装置と試薬は 材料表に示されています。

1. 血漿および糞便サンプル処理 - 極性代謝産物抽出

  1. サンプル収集
    1. すべての血漿および糞便サンプルを滅菌済みの予冷収集チューブに収集し、収集後にすぐに液体窒素で急速凍結します。処理までサンプルを-80°Cで保存します。
    2. 代謝産物の安定性を確保するために、すべてのサンプルを1回の凍結融解サイクルで処理し、サンプルの収集から抽出までの時間間隔を2週間超えないようにしてください。
      注:これらの対策は、代謝物の分解を最小限に抑え、下流のメタボロミクス分析における再現性を確保するために講じられました。
    3. プロトコルステップ1.3または1.4に従って、糞便および血漿サンプルから代謝産物を抽出します。
  2. 研究対象集団
    1. ベースラインの血圧測定を行い、すべての参加者の投薬履歴を記録します。
    2. メタボロミクス分析における交絡因子を最小限に抑えるために、主要な代謝併存疾患(糖尿病、原発性高血圧など)を持つ個人を除き、急性の臨床的悪化の前に患者サンプルを収集します(補足表S1)。
    3. 標準的な手順を使用して、各被験者の臨床情報を取得します。
  3. 血漿抽出
    1. 生血清を14,000 × g で10分間(4〜8°C)遠心分離します。上清を新しい1.5 mL微量遠心チューブに集めます。
    2. 冷却(-80 °C)HPLCグレードのメタノールを加えて、80%(v/v)のメタノール濃度を達成します。反転で穏やかに混合し、-80°Cで6〜8時間インキュベートします。
    3. 14,000 × g で 10 分間 (4-8 °C) 遠心分離します。メタボロムプロファイリングのためにメタノール上清を新鮮なチューブに移します。
      注:採取後の血漿サンプルを-80°Cの冷凍庫に2時間以内に置き、凍結融解サイクルを最小限に抑えて代謝物の安定性を確保します。
  4. 糞便抽出
    1. 500 μL の HPLC グレードのメタノール (-80 °C に予冷) を、1.5 mL 微量遠心チューブ内の新鮮または凍結の糞便サンプルに加えます。マイクロペストル/組織ホモジナイザーを使用してドライアイス上で1〜2分間ホモジナイズし、続いてボルテックス(4〜8°Cで1分間)、-80°Cで4時間インキュベートします。
    2. 冷蔵遠心分離機を使用して、14,000 × g で10分間(4〜8°C)遠心分離します。上清を新しい1.5 mL微量遠心チューブに移します。ステップ1.4.4まで-80°Cで保存します。
    3. ペレットを400 μLの予冷(-80°C)HPLCグレードメタノールで再懸濁します。完全にボルテックスし(4〜8°Cで1分間)、-80°Cで30分間インキュベートします。
    4. 遠心分離を繰り返します(14,000 × g、10分、4〜8°C)。両方の抽出段階の上清を混ぜ合わせます。
    5. 最終清澄遠心分離(14,000 × g、10分、4〜8°C)を行います。精製した上清を滅菌1.5mLチューブに移し、下流分析を行います。
      注:収集後の糞便サンプルを-80°Cの冷凍庫に2時間以内に置き、凍結融解サイクルを最小限に抑えて代謝物の安定性を確保します。

2.腎動脈の隔離

  1. 参加者の選択と組織の収集
    1. 腎細胞癌の根治的腎摘出術を受ける患者をスクリーニングします。代謝性併存疾患(原発性高血圧、糖尿病など)のない18歳≥の人のみを含めます。手術中は、腫瘍縁から少なくとも3cm離れた場所にある組織学的に正常な腎実質を採取します。
    2. 採取した検体を酸素化Krebs-Henseleit緩衝液(4°C、pH 7.4、mMでの組成:119.0 NaCl、4.7 KCl、2.5 CaCl2、1.0 MgCl2、25.0 NaHCO3、1.2 KH2PO4、11.0グルコース)に直ちに浸漬します。手術後6時間以内に隔離手順を完了します。
  2. 腎臓組織の準備
    1. 4°Cクレブスバッファーで冠状切片化を実行して、無傷の肺門構造を含む半血球標本を取得します。立体顕微鏡システム(40倍倍)を使用して顕微解剖を行い、腎弓状動脈枝を露出させ、弓状動脈を特定します。
  3. 微小血管解離
    1. マイクロ角膜ハサミを使用して血管周囲外膜組織を順次除去することにより、動脈セグメントの正確な分離を実現します。
    2. 直径約500μmの動脈セグメントを保存します。
    3. マイクロ鉗子による張力のない操作により、内皮せん断応力を最小限に抑えます。生理学的pHとイオン恒常性を維持するために、15分ごとに更新されたクレブスバッファーを使用して、低体温条件(4°C)で解剖を実行します。
      注:動脈の寸法と緩衝液組成の明示的な定量化、調達(4°C)から処理(4°C)までの熱的に調整されたワークフロー、および検体採取後6時間以内の完全な微小血管郭清により、最適な組織生存率と機能的完全性が保証されます。

3. 心損傷代謝物による腎動脈のインキュベーション

  1. 血管組織の準備: 無菌条件下で顕微外科的に腎動脈を解剖し、細い眼科用鉗子を使用して付着した血管周囲結合組織を細心の注意を払って除去します。その後の器官型培養のために滅菌マイクロハサミを使用して、単離された腎動脈を2 mmのセグメントに切断します。
  2. 抗生物質の除染:微生物汚染を最小限に抑え、代謝物への曝露前の無菌性を確保するために、トリプル抗生物質/抗真菌剤カクテルを添加したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で血管セグメントを3 x 5分間洗浄します。
  3. 実験的グループ化:血管セグメントを4つの実験コホートにランダムに割り当て、ウェルあたり500 μLのDulbeccoのModified Eagle Mediumを含む24ウェル培養プレートに移します。
  4. 代謝物介入
    1. 次のグループから代謝物を追加します: 1) 健康な対照血漿由来代謝物 (HC-P)。2) 心不全患者の血漿由来代謝物 (HF-P);3) 健康な対照糞便由来代謝物 (HC-F)。4) 心不全患者の糞便由来代謝物(HF-F)。
    2. 代謝物抽出物をメタノール(HPLCグレード)で再構成し、各抽出物10 μLを、500 μLのDulbecco's Modified Eagle Mediumおよび腎動脈セグメント(最終溶媒濃度2%(v/v))を含む24ウェル培養プレートの対応するウェルに投与します。等量のビヒクル(メタノール/PBS混合物)をコントロールウェルに加えます。
  5. 培養条件:加湿インキュベーターを使用して、標準的な細胞培養条件(37°C、5%CO2、95%湿度)でプレートアセンブリを24時間インキュベートします。

4.腎動脈輪アッセイ

  1. 腎動脈輪の懸濁と固定
    1. ワイヤーの準備:光学顕微鏡下で2本の平行な2 cmステンレス鋼ワイヤー(クレブスで予備平衡化、95%O2/5%CO2)を動脈内腔に通し、両端で均等なワイヤーの突起を確保します。
    2. ミオグラフの取り付け: 暖房システムとガスをオンにして、生理学的温度と酸素化を維持します。温度制御されたワイヤーミオグラフバス(クレブス、95%O2 / 5%CO2)でワイヤーを水平に固定します。ネジノブを調整して、血管の自然な弛緩を維持します。
  2. 血管固有の正規化による最適な初期張力の決定
    注:安静時張力は、ベースライン条件を標準化し、血管の反応性を最適化し、再現性を確保するために、正規化手順を使用して調整されました。正規化を続行する前に、30分間平衡化します。
    1. 次のパラメータを使用して、DMTメニューから正規化設定を選択します:接眼レンズキャリブレーション:1 mm / div;目標圧力:13.3 kPa;IC1/IC100 比: 0.9 C;オンライン平均:3秒;遅延時間:60秒。
      メモ: その他の背景とシステム構成の詳細については、参照資料17 を参照してください。
    2. 船舶を正規化するには、目的の チャネル を選択し、正規化画面にデータを入力します。マイクロメーターの読み取り値と40μmのワイヤー直径に基づいて組織エンドポイントを設定します。
    3. パッシブストレッチを適用し、3分間待ちます。60K+ を投与してカリウム媒介収縮を誘発し、収縮がプラトーに達するまで待ちます。製剤をクレブス溶液で3 x 5分間すすぎ、60K +を洗い流します。トレースに記録されたカリウム誘発力から各伸張レベルでの受動力を差し引いて、能動力を計算します。
    4. 最大有効力に達するまで、手順4.2.3を繰り返します。最適な安静時張力を、各動脈で最大能動張力をもたらすレベルとして定義し、高 K+ に対するピーク応答を基準収縮として使用します。
    5. さらなる実験の前に、動脈リングを10分間平衡化します。
      注:血管のグレード、厚さ、および起源には個人差が大きいため、再現性を確保するために各血管を個別に正規化します。ワイヤー ミオグラフ システムの正規化モジュールを使用して、各血管の受動直径と機械的特性に基づいて適切なベースライン張力を決定します。機能テストの前に、すべてのサンプルに手順を一貫して適用します。
  3. 腎動脈輪の反応性検出
    1. 血管収縮性に対するさまざまな代謝産物の影響を調査するには、健康なボランティアおよび心不全患者から抽出された血漿および糞便代謝産物と 12 時間インキュベートした腎動脈を使用して血管収縮機能検査を実施します。詳細については、セクション 3 を参照してください。
    2. 60K+ を使用して、カリウムを介した収縮を誘発します。各チャンバーに5 mLのクレブス溶液があることを確認してください。
    3. フェニレフリン(Phe)誘発性の動脈輪の濃度依存性収縮を決定するには、10〜9 〜10〜4 Mの半対数刻みでPheを追加します。最低のPhe濃度から始めて、チャンバーに導入し、安定した収縮を待ちます。
    4. 安定した収縮に達する場所をマークし(つまり、プラトーでの張力値を記録)、次の濃度に進みます。最終濃度が正常に追加されるまで繰り返します。
    5. 実験が終了したら、データファイルを保存し、動脈リングを取り外します。チャンバーを8%酢酸溶液でよく洗浄し、3分間インキュベートします。
    6. ガスを止める前に、暖房システムとガスをオフにし、すべての液体が除去されていることを確認してください。

5.腎動脈の病理組織学的検査:ヘマトキシリン-エオシン染色

注:危険な試薬と生物学的廃棄物は、施設のバイオセーフティおよび化学衛生プロトコルに従って廃棄してください。具体的には、キシレンとパラホルムアルデヒドは、認定された有害廃棄物取扱業者が廃棄する前に、ラベル付きの密封可能な化学廃棄物容器に収集し、指定されたヒュームフードエリアに保管する必要があります。ミオグラフチャンバーの洗浄に使用される酢酸は、標準的な酸廃棄物処理手順に従って中和して廃棄する必要があります。これらの試薬を実験室のシンクに排出しないでください。

  1. 冷たいPBSで動脈を洗浄し、4%パラホルムアルデヒド(pH 7.4)で一晩固定します。4 μmで連続切片を切断し、組織学のために処理します。
  2. スライドガラスにマウントされた組織切片をスライド乾燥機で60°Cで1時間インキュベートし、すぐにキシレンに移します。切片をキシレンに浸漬します(3 x 5分)。
  3. セクションに段階的なエタノール水和を施します:100%エタノール(2 x 5分)、95%エタノール(1 x 5分)、90%エタノール(1 x 5分)、80%エタノール(1 x 5分)、70%エタノール(1 x 5分)、超純水ですすいでください(1 x 5分)。
  4. ヘマトキシリン(0.5%w / v)で5分間染色します。その後、流水ですすいでください。
  5. 1%酸性アルコール(HCl-エタノール)で5〜10秒間区別し、流水ですすいでください。
  6. 0.6%アンモニア水で切片を青くし、流水ですすいでください。
  7. 切片をエオシン溶液(1%w / v)に2分間浸漬します。
  8. 95%エタノール(2 x 5分)、100%エタノール(2 x 5分)、およびキシレン(2 x 5分)で切片を脱水し、除去します。
  9. 光学的透明性が得られるまで短時間自然乾燥させ、封入剤に取り付け、カバーガラスで覆い、中性の封入剤でカバーガラスを密封します。
  10. 明視野イメージングと組織形態計測評価を実行します。

6. 腎障害関連分子バイオマーカーの検出

  1. 腎動脈mRNA抽出
    1. 凍結保存した血管組織を液体窒素で1 mLのRNA抽出試薬に加え、予冷した組織ホモジナイザーに移して完全に均質化します。
    2. 抽出試薬100 μLあたり250 μLのクロロホルムを加え、30秒間激しくボルテックスし、25°Cで10分間インキュベートします。
    3. 12,000 × g (10分、4°C)で遠心分離し、水相を新しいチューブに移します。
    4. 500 μLのイソプロパノールを水相に加え、反転で混合し、25°Cで20分間インキュベートします。
    5. 12,000 × g (10分、4°C)で遠心分離し、上清を廃棄します。
    6. ペレットを1 mLの75%エタノール(2 x 5分)で洗浄し、RNAペレットを自然乾燥させ、DEPC-H2O(0.1%v / v)に再懸濁します。
      注:RNA純度(OD260 / OD280 = 1.9-2.0)を検証し、無傷の28S / 18S rRNAバンドを確認します。
  2. cDNA合成
    1. 2 μgのmRNA + 1 μLのオリゴ(dT)プライマーを混合し、DEPC-H2O(0.1% v/v)で8 μLに調整し、70°Cで5分間加熱し、氷上で5分間スナップ冷却します。
    2. 逆転写マスターミックスを10 μLの2x TS反応ミックス、1 μLのRT/RI酵素ミックス、および1 μLのgDNAリムーバーで調製します。ステップ6.2.1の8 μLのRNA/プライマー混合物に12 μLのマスターミックスを加えて、総反応量20 μLにします。
    3. ステップ6.2.2の混合物を加熱します。42°Cで60分間加熱し、85°Cで5分間加熱してプロセスを終了します。
    4. 80 μLのヌクレアーゼフリーH2Oを添加して20 μLの逆転写反応を希釈し、最終容量を100 μL(4倍希釈)にします。希釈したcDNAを定量PCRのテンプレートとして使用します。
  3. 定量的PCR分析
    1. 2.0 μLのcDNAテンプレート、0.5 μLのフォワードプライマー(10 μM)、0.5 μLのリバースプライマー(10 μM)、10 μLのSYBR Greenマスターミックス(2x)、および7 μLのddH2Oを混合して反応を設定します。
    2. 次の設定を使用してPCRを実行します:初期変性:95°C / 3分;40サイクル:95°C/30秒;Tm-5°C/30秒;72°C/30秒;溶融曲線:65-95°C(+0.5°C / 5秒)。
    3. 2-ΔΔct法で遺伝子発現を解析します。プライマー配列を 補足表S2に示します。

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結果

コホートは女性2名と男性2名で構成され、年齢範囲は46歳から73歳(平均年齢:64.0歳)でした。ベースライン血圧測定では、収縮期血圧が 109 から 168 mmHg の範囲、拡張期血圧が 68 から 115 mmHg であることが示されました。すべての心不全患者は、ベータ遮断薬、スタチン、抗血小板薬などの一般的な心臓保護薬を含む投薬歴を記録しており、レニン-アンジオテンシン系阻害剤や利尿薬には個人差がありました。対照については、医師の診察、身体検査、臨床検査によって確認された、心臓病や心不全関連の症状や徴候のない 4 人の被験者を募集しました。

この研究は、主に腸バリア機能障害に起因する血漿および腸由来代謝産物に分布する、心不全患者の心筋損傷に由来する循環代謝産物によって誘発される腎障害の根底にある病理学的メカニズムを体系的に評価することを目的としています。そのために、形態学的、分子生物学的、機能的評価を統合した総合評価システムを構築しました(図1)。代謝物誘発性血管炎症を評価するために、炎症誘発性サイトカインインター...

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ディスカッション

CRS の最近の研究では、代謝物が腎血管恒常性を調節する重要な病理学的メカニズムとして代謝リプログラミングが特定されています 7,8,9。VSMC は CRS における血管緊張とコンプライアンスの調節に重要な役割を果たしますが、私たちの研究は、心臓損傷関連代謝産物が血管平滑筋の収縮性と構造的完全性を損なうという直接的な証拠を提供します。具体的には、私たちの発見は、慢性心不全 (CHF) 患者の血漿および腸由来の代謝産物が腎動脈中間層における VSMC 増殖を促進し、血管収縮性を損なうことを示しています。血管平滑筋細胞の密度の増加を特徴とする観察された中間層リモデリングは、代謝ストレス誘発性の慢性炎症から生じる可能性があります。血管収縮性評価により、心不全患者の血漿および糞便代謝産物による治療後の腎動脈の収縮反応性の低下が明らかになり、炎症を介した血管機能障害が示唆されました。

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、中国国家重点研究開発プログラム (2021YFF0501401、2018YFA0800501 から Y. Z.、2021YFF0501404 から Y. L.)、中国国家自然科学基金 (82325004 年および 92168114 年 Y. Z.、82300286 年 J. Z.、92168113 年 E. D.、82170422 年 Y. L.)、細胞生態系イノベーション基金の海河研究所 (No.HH22KYZX0047からE.D.)、中国ポスドク科学財団(BX20220023、2022M720288からJ.Z.)、北京自然科学基金(7252157からJ.Z.へ)。北京市自然科学基金 (7232096 to Y. L.)、北京大学第三病院の血管恒常性とリモデリングの国家重点研究所の研究プロジェクト (北京大学、2024-VHR-SY-07 to Y.Z.)。図 1 は、承認されたライセンスを持つ Biorender.com で作成されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
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DMEM高グルコースギブコカタログ# 06-1055-57-1-ACS
PBSのソーラービオカタログ# P1010
ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシンBサーモフィッシャーサイエンティフィックカテゴリ# 15240062
フェニレフリンMCEのカタログ#HY-B0769
逆転写システムプロメガカタログ# A5001
実体顕微鏡システムライカM80
SYBRグリーンマスターミックスサーモフィッシャーサイエンティフィックカテゴリ# 4309155
血管張力測定システムDMTの620メートル

参考文献

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