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毒PLA2の膜栄養作用に及ぼすホスファチジルイノシトールリン酸基の影響を調べるためのリポソーム膜透過性アッセイ

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DOI：

10.3791/68594

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2025年9月26日

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1Advanced STEM Research Center, Beijing Chaoyang KaiWen Academy, 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Department of Pharmacology, University of Nevada Reno, 4Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, M. V. Lomonosov Moscow State University

この記事について

サマリー

従来の技術よりも優れた感度と分解能でリポソーム膜透過性を評価するための費用対効果の高い方法を紹介します。この技術は、新しいカプセル化されたリガンド置換反応を使用して、モデル膜のホスホリパーゼA 2 誘発性変化を検出します。標準的な分析と簡単に統合できるこのアクセスしやすいアプローチは、膜生物物理学と毒素相互作用を研究するための解像度を高めます。

要約

私たちは、リポソームの内部容積にカプセル化されたリガンドを含むリガンド置換反応に基づいてリポソーム膜透過性を評価するための新規で費用対効果が高く、高感度のアッセイを開発し、加水分解活性アッセイ(補酵素Aアシル化を使用)および分子モデリングシミュレーションと組み合わせて、ホスファチジルイノシトール中のイノシトール環のリン酸が異常に発現した酵素の有害な影響から膜を保護するかどうかを調査しました。ホスホリパーゼ A2 (PLA2) の異常な発現は、多発性硬化症やアルツハイマー病の発症を引き起こす軸索の脱髄につながります。異常に発現したPLA₂の効果を模倣するために、毒蛇毒PLA₂の塩基性サブユニットであるHDP-2Pを使用しました。HDP-2Pは、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルイノシトール-4-リン酸(PI-4-P)、またはホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸(PI-4,5-P2)が豊富なホスファチジルコリン(PC)リポソームでテストされました。HDP-2Pは、PCリポソームにおいて最小限の加水分解活性を示し、透過性をわずかに増加させるだけでしたが、PIによるPCリポソームの濃縮は、加水分解と透過性の両方を高めました。驚くべきことに、PI-4-PとPI-4,5-P₂はHDP-2Pの加水分解活性を劇的に阻害し、透過性を完全に低下させました。分子モデリングシミュレーションにより、ホスファチジルイノシトール中のイノシトール環のリン酸がHDP-2Pの活性部位へのリン脂質のアクセスを立体的にブロックし、加水分解を防ぐことが明らかになりました。 in vitro データと in silico データの両方で、リン酸化ホスファチジルイノシトールが PLA₂ 活性の低下と関連していることが示唆されており、おそらく細胞膜を変性から保護する手段として、過剰な PLA2 活性を軽減する潜在的なメカニズムが示唆されています。

概要

ホスファチジルイノシトール (PI) は、リン酸基を介してヘキサヒドロキシ 6 炭素環であるイノシトールに結合したホスファチジン酸骨格からなる陰イオン性リン脂質です。イノシトールは、炭素2、3、4、5、および6位1でのリン酸化により、可逆的にホスホイノシチドに変換できます1。PIとホスホイノシチドは、動物、植物、微生物のさまざまな細胞の原形質膜や細胞小器官に含まれています。MableとLowell Hokinによる発見から70年後2,3,4、PIとホスホイノシチドは、その分子メカニズムと人間の健康との関連性を理解することを目的とした広範な研究の対象であり続けています5,6,7。

脳組織とは別に、ホスホイノシチドは通常低濃度で存在し、原形質膜の内側のリーフレット中の総脂質の約0.5〜1%を占めます。公開されたデータは、PI が生理学的条件下で主要な構造的役割を果たす可能性は低いことを示しています1。しかし、病態の間、PIとホスホイノシチドのレベルが上昇し、それらは原形質膜の外側のリーフレットにフリップフロップし、これらのリン脂質が耐病性に関連している可能性があることを示しています1。PI はホスホイノシチドに比べて生理学的役割がそれほど重要ではないと考えられてきましたが、新たな証拠は、さまざまな生理学的プロセスにおける PI-4-P および PI-4,5-P2 の重要性を強調しています1。これらのプロセスには、細胞内シグナル伝達、細胞間シグナル伝達8、9、10、膜輸送11、12、13、遺伝子発現の調節1、ならびに細胞増殖14および生存1が含まれます。それにもかかわらず、PIとホスホイノシチドがこれらのプロセスを駆動する分子メカニズムは、まだよくわかっていません。

PIおよびホスホイノシチドは脳組織細胞に豊富に存在し、総リン脂質の約10%を占めているが、それらのレベルは脳疾患の初期段階で一時的に増加する可能性があり、ホスホイノシチドが神経学的病状の発症を打ち消す可能性があることを示唆している 多発性硬化症やアルツハイマー病などの異常なPLA2s活性によって引き起こされる軸索脱髄によって引き起こされる15、16,17。これらの酵素は、グループIIA分泌性ホスホリパーゼA2(sPLA2)15を含むさまざまなクラスおよびグループに属します。このグループの酵素のレベルの上昇は、多発性硬化症およびアルツハイマー病患者の脳脊髄液に見られ、そこでミエリン膜の破壊に寄与し、脱髄を引き起こします15。また、ヘビ毒からのsPLA2sは、神経筋シナプス18,19での伝達を阻害し、中枢神経系障害を引き起こし、末梢神経筋系に悪影響を与えることも報告されています20。

本研究では、PIとホスホイノシチドが異常に発現したsPLA2酵素の影響からモデルリン脂質膜を保護できるかどうかを調べました。モデル膜は、すべての哺乳類細胞膜で最も豊富なリン脂質であるホスファチジルコリン(PC)21でできており、PI、PI-4-P、またはPI-4,5-Pのいずれかのモル比が20%で濃縮されています2。モデル膜に対する異常に発現したsPLA2酵素の影響を模倣するために、モデルミエリン膜23で加水分解活性が以前に研究されているグループIIA分泌性毒蛇毒神経毒性PLA2酵素22の塩基性サブユニットHDP-2Pを使用しました。

この研究のために、HDP-2Pの影響を受けるリポソーム膜の透過性の変化を調査するための新しいアプローチを開発しました。この新しい方法は、リポソームの外側にあるCuSO4溶液中のリガンド置換反応に基づいており、リポソーム内に閉じ込められたNH3リガンドが関与しています。HDP-2P誘導膜透過性がリポソームからのNH3漏出を可能にする場合、放出されたアンモニアは反応を介して水和銅イオン中の4つの水分子を定量的に置換します:[Cu(H2O)6]2+(aq)+ 4NH3(aq)figure-introduction-1[Cu(H2O)2(NH3)4]2+(aq)+ 4H2O(l)。このリガンド交換は、分光光度法(λ = 600 nm)で測定可能な溶液の光学密度の特徴的な増加を生み出し、膜透過性変化の定量的読み出しとして機能します。当社のリガンド置換ベースのアプローチは、1H-NMR 23,24,25,26,27,28やイオン輸送アッセイ29などの従来の技術と比較して、膜透過性を評価するための優れた感度を示し、高価な機器を必要としないという追加の利点を提供します。HDP-2P加水分解活性測定およびHDP-2Pの分子表面に結合するPI、PI-4-P、およびPI-4,5-P2のインシリコシミュレーションと組み合わせて適用されたこのシンプルで費用対効果の高い方法は、PIのイノシトール環のリン酸塩がPI-4-PまたはPI-4が豊富なPC膜に対するHDP-2Pの破壊的な効果を排除すると結論付けることができました。5-P2.この発見がさらなる研究で確認されれば、PI中のイノシトールリン酸環が異常に作用する細胞タンパク質の有害な影響から保護する能力は、異常なタンパク質活性を伴う疾患状態における膜の安定性に寄与する可能性があり、アルツハイマー病や多発性硬化症などの神経疾患の治療のための新規医薬品の開発への道を開く可能性があります。

プロトコル

1. 分子モデリングソフトウェアを用いたHDP-2PとPIおよびホスホイノシチドとの相互作用の インシリコ シミュレーション

  1. ソフトウェアのインストールと準備
    1. 補足ファイル1-補足図S1Aに示すように、リガンド分子を構築するための参照化学図面エディタをインストールします。
    2. リガンドと受容体の分子ドッキングのための分子モデリングソフトウェアをインストールします。
    3. リガンドおよび受容体の調製用の自動ドッキングツールをインストールします。
    4. 分子モデリングシミュレーションソフトはPython環境に依存しているため、Pythonをインストールしてください。
  2. リガンドの調製
    1. まず、化学描画エディターを使用して、PI、PI-4-P、PI-4,5-P2、カルジオリピン、およびホスファチジルセリンの分子構造の原子座標を作成します。
      注:リガンド調製の次のステップのサンプルプロトコルは、PIのみのステップについて説明しています。
    2. 補足ファイル1-補足図S1Bに示すように、化学図エディタを使用してPIの分子構造を構築し、補足ファイル1-補足図S2に示すようにPDB形式でファイルを保存します。
    3. 補足ファイル1-補足図S3Aに示すように、自動ドッキングツールソフトウェアでPDBファイルを開きます。
    4. 補足ファイル1-補足図S3Bに示すように水素原子を追加し、補足ファイル1-補足図S4Aに示すように極性またはすべての水素原子のいずれかを選択します。
      注:HDP-2PとのPIドッキングが完了したら、極性水素原子のみを選択して、極性または水素結合の視覚化を簡素化します。
    5. 補 足ファイル1-補足図S4Bに示すように、PI分子を自動ドッキングツールソフトウェアのリガンドとして設定します。
    6. 補足ファイル1-補足図S5Aに示すように、リガンドをPDBQTファイルとして保存します。すべてのボンドを回転可能にしてください。
  3. 受容体の準備
    1. ホスホリパーゼA2 HDP-2(PDBコード2I0U)のPDBファイルをダウンロードし、2つのモノマー(1つは酸性で酵素的に不活性なA、もう1つは塩基性で酵素的に活性なE)で構成されています。酵素的に不活性なモノマーAを削除するには、2I0Uファイルを分子モデリングソフトウェアにインポートし(補足ファイル1-補足図S5B)、モノマーAのすべての原子を選択し(補足ファイル1-補足図S6A)、モノマーAのすべての原子を 編集 して削除します(補足ファイル1-補足図S6B)。酵素活性なモノマーEを保持し、現在受容体として指定されています。
    2. 補足ファイル1-補足図S7に示すように、自動ドッキングツールソフトウェアでHDP-2P受容体PDBファイルを開きます。
    3. 補足ファイル1-補足図S8Aに示すように、すべての水分子を除去します。
    4. 補足ファイル1-補足図S8Bに示すように水素原子を追加します。PIとのHDP-2Pドッキングの完了後は、極性水素と水素結合の視覚化を簡素化するために、極性水素のみを選択する必要があることに注意してください。
    5. 補足ファイル1-補足図S9Aに示すように、HDP-2Pを受容体として設定し、PDBQTファイルとして保存します。受容体が回転可能な結合なしで設定されていることを確認してください。
  4. ドッキングパラメータ設定
    1. リガンドファイルと受容体PDBQTファイルの両方を開きます。
    2. 補足ファイル1-補足図S9Bに示すように、グリッドボックスセットアップインターフェイスに入り、グリッドボックスサイズ(サイズx = 44.644、サイズy = 74.939、サイズz = 43.050)および中心(中心x = 25.626、中心y = 9.582、中心z = 41.825)座標を定義し、補足ファイル1-補足図S10Aに示すように、受容体分子の表面全体を完全に囲みます。
    3. 補足ファイル1-補足図S10Bに示すように、現在の設定でグリッドボックスセットアップインターフェイスを閉じ、補足ファイル1-補足図S11Aに示すようにドッキングパラメータをconfig.txtファイルに保存します。
  5. 分子ドッキングソフトウェアの実行
    1. 補足ファイル1-補足図S11Bに示すように、config.txtファイルを使用して分子ドッキングソフトウェアを起動します。
    2. ドッキング計算を実行します(~30〜90分; 補足ファイル1-補足図S12)。
    3. docking_log.txt ファイルをチェックして、ドッキング スコア (バインディング アフィニティー) を確認します。
    4. エネルギーコンフォメーションが最も低いドッキング結果を選択します。
  6. ドッキングデータの分析
    1. 自動ドッキングツールソフトウェアを使用して、ドッキング結果のPDBQTファイルを開きます。
    2. リガンド-受容体結合部位を分析し、受容体の活性中心と分子間相互作用(イオン結合、イオン極性相互作用、極性相互作用、水素結合相互作用など)に焦点を当てます。受容体の活性部位と相互作用するPIとホスホイノシチドの表を作成し、kcal/mol単位の結合部位親和性、PI/ホスホイノシチド極性頭部の荷電部分と極性部分、分子間結合に関与するHDP-2P残基、および 表1 および 表2に示す結合の種類を記述します。各受容体-リガンドペアのドッキングを3回繰り返して、結合部位、結合親和性、PI/ホスホイノシチドおよびHDP-2P残基の荷電部分と極性部分、および結合の種類に偏差がないことを確認します。

2. 遊離脂肪酸でアシル化した補酵素Aを使用して監視されたPI、PI-4-P、PI-4,5-P2 、PS、またはCLが豊富なPCリポソームにおけるHDP-2Pの加水分解活性

注:クロロホルム、メタノール、NH3、およびCuSO4 は危険です。常にニトリル手袋、ゴーグル、白衣を使用してください。ヒュームフードの下でこれらの試薬を使用してすべてのプロトコルを処理します。クロロホルムを琥珀色のガラス瓶に保管してください。メタノールは、酸化剤から離れた可燃性のキャビネットに保管してください。メタノールを炎や火花から遠ざけてください。これらの試薬のすべての廃棄物容器にラベルを付け、地域の有害廃棄物処理規制に従って廃棄します。

  1. 5.55 mgのCaCl2 を0.10 M Tris-HCl緩衝液(pH 7.4)に溶解することにより、HDP-2P触媒リン脂質加水分解用の緩衝液100 mLを調製します。
  2. 7.31 gのEDTAを脱イオン蒸留水(ddH20)に溶解して、50 mLの1.0 M EDTAストック溶液を調製します。
  3. 0.10 M Tris-HClバッファー(pH 7.4)で0.54 mM HDP-2Pストック溶液を調製します。HDP-2Pのモル質量は13.827kDaです。
  4. クロロホルム/メタノール混合物(2〜1体積)中の濃度10.0 Mのリン脂質の次のストック溶液を調製します:卵黄L-α-ホスファチジルコリン(PC)、ウシ心臓カルジオリピン(CL)、ウシ脳L-α-ホスファチジル-L-セリン(PS)、PI、PI-4-P、およびPI-4,5-P2。PC、CL、PS、PI、PI-4-P、およびPI-4,5-P2のモル質量は、以下でさらに説明するように、それぞれ768 Da、1,466 Da、792 Da、867 Da、962 Da、および1,057 Daである。
  5. PCリポソームの5つのサンプルを準備します。PCリポソームのサンプルを調製するには、75 μLのPCのクロロホルム/メタノール原液をガラス試験管に加え、脂質膜が形成されるまで脂質を10Pa真空下で25°Cで1時間乾燥させます。サーモスタットで25°Cでリン脂質加水分解用の緩衝液15 mLで脂質膜を1時間水和させます。次に、100〜150 Wの超音波ディスペンサーのチタンピストルを、氷浴に入れたガラス試験管の脂質懸濁液に挿入し、最大出力の50%を超えないように、22 kHzの周波数で10分間懸濁液を超音波処理します。チタンの「ダスト」粒子を除去するには、リポソームを室温で200 × g (10 cmローターで1,270 rpm)で10分間遠心分離します。
  6. クロロホルム/メタノールリン脂質原液-60 μLのPCと15 μLのCL、PS、PI、PI-4-P、またはPI-4,5-P2をガラス管で混合することにより、PCおよび他の脂質モル比4:1でCL、PS、PI、PI-4-P、またはPI-4,5-P2のいずれかを濃縮したPCリポソームのサンプルを調製します。次に、脂質を10Pa真空中または室温で3時間乾燥させ、リン脂質加水分解用の緩衝液中で脂質膜を水和させ、上記のように超音波で超音波処理する。
    注:リポソームの種類ごとに、5つのサンプルを調製します。
  7. 上記の各タイプのリポソームから5つのサンプルから1.0 mLを別々のチューブに入れ、NEFAキットから10 μLの無色補酵素A溶液を各チューブに加え、0.00、0.93、1.86、2.79、または3.72 μLの0.54 mM HDP-2Pストック溶液を別々のチューブに加え、リポソームサンプルでHDP-2P /リン脂質モル比0.000を得る。 それぞれ0.001、0.002、0.003、0.004です。
  8. HDP-2Pをリポソームに添加した直後に、リポソームサンプルをサーモスタットで37°Cで15分間インキュベートし、100 μLのストックEDTA溶液を添加することにより、HDP-2Pによって誘発されるリン脂質加水分解を停止します。その後、サンプルを1分間渦巻きします。
  9. 無色の補酵素A溶液が遊離脂肪酸でアシル化されたときに紫色に変わる程度を測定する分光光度計を使用して、リポソームサンプルの光学密度を550nmで測定することにより、HDP-2Pの加水分解活性を定量します。
  10. 上記の手順をさらに 2 回繰り返して、平均光学密度値が 3 つの独立した試行から導き出されるようにします。
    注:この実験試験で得られた各データポイントは、光学密度の平均値です。理想的には、実験データポイントの標準偏差は平均の±5%以内にある必要があります。

3. リポソーム内に閉じ込められたNH3リガンドを含むCuSO4溶液中のリガンド置換反応により測定したPI、PI-4-P、PI-4,5-P2、PS、またはCLに富むPCリポソーム膜の透過性に及ぼすHDP-2Pの影響

注:クロロホルム、メタノール、NH3、およびCuSO4 は危険です。常にニトリル手袋、ゴーグル、白衣を使用してください。ヒュームフードの下でこれらの試薬を使用してすべてのプロトコルを処理します。クロロホルムを琥珀色のガラス瓶に保管してください。メタノールは、酸化剤から離れた可燃性のキャビネットに保管してください。メタノールを炎や火花から遠ざけてください。これらの試薬のすべての廃棄物容器にラベルを付け、地域の有害廃棄物処理規制に従って廃棄します。

  1. クロロホルム/メタノール(2〜1容量)で、6つのリン脂質(PC、CL、PS、PI、PI-4-P、PI-4,5-P2)のそれぞれについて、20 mLの0.03 Mストック溶液を調製します。PC、CL、PS、PI、PI-4-P、PI-4,5-P2 の分子量は、それぞれ768、1466、792、867、962、および1057 Daです。
  2. 最終濃度0.05 M CuSO4で100 mLの0.10 M Tris-HCl(pH 7.4)バッファーを調製します。
  3. 4 mLの1.5 × 10-3 M HDP-2Pストックを0.05 M CuSO4、0.10 M Tris-HCl(pH 7.4)バッファーで調製します。HDP-2Pのモル質量は13.827kDaです。
  4. 100 mLの0.5 M NH3 溶液を調製するには、25%NH3 溶液(密度905 g / L30、13.30 M [905 g / L × 0.25 M ÷ 17.00 g / L = 13.30 M]に等しい)を使用します。したがって、100 mLの0.5 M NH3を調製するには、3.76 mLの25%NH3 溶液を使用します:(0.5 M × 1,000 mL ÷ 13.30 M)÷10 = 3.76 mLの25%NH3 溶液。3.76 mLの25%NH3 溶液を100 mLメスフラスコに入れ、0.10 M Tris-HCl(pH 7.4)バッファーで容量を100 mLにします。
  5. リポソームの内容積にNH3 を含むリポソームを調製するには、12.5 mLの0.03 Mストックリン脂質溶液をクロロホルム/メタノール中のチューブに入れ、リン脂質を10 Pa真空中または室温で3時間乾燥させます。サーモスタット中で12.5 mLの0.5 M NH3、0.10 M Tris-HCl(pH 7.4)を25°Cで1時間水和します。次に、ステップ2.5で説明したように脂質懸濁液を22kHzの周波数で超音波処理して、超音波処理されたリポソームを生成します。
    注:超音波処理されたリポソームを含む溶液では、NH3 はリポソームの内側と外側にあります。
  6. リポソームの外側でNH3 を除去するには、マグネチックスターラーを使用して、0.10 M Tris-HCl(pH 7.4)に対して5ハット室温の透析膜(分子カットオフ1.0 kDa)を使用してリポソームを透析します。
    注:0.10 M Tris-HCl、0.05 M CuSO4バッファーの0.5 mLに0.5 mLの透析リポソームを添加すると、NH3を使用せずに調製し、同じバッファーと混合したリポソームの光学密度を600 nmで得たため、5時間の透析でNH3を完全に除去するのに十分でした。
  7. 透析後、ステップ2.5で説明するように、リポソームを200× g で90分間遠心分離して、リポソームをペレット化する。上清を廃棄し、リポソームを5.0 mLの0.10 M Tris-HCl、0.05 M CuSO4 (pH 7.4)バッファーで再懸濁し、再懸濁したリポソームをそれぞれ1.0 mLの5つのサンプルに分割します。これら5つの1.0 mLサンプルに、60、40、20、および0 μLの0.10 M Tris-HCl、0.05 M CuSO4 (pH 7.4)バッファー、次に0、20、40、60、80 μLのHDP-2Pストックバッファーを別々に加えて、リポソームサンプルでHDP-2P/リン脂質モル比をそれぞれ0.000、0.001、0.002、0.003、および0.004調整します。
  8. リポソームサンプルを37°Cのサーモスタットで30分間インキュベートします。次に、分光光度計を使用して600nmでリポソームサンプルの光学密度を測定します。6つのリポソームサンプルすべてについてセクション3で説明されている手順に従い、3回繰り返して、各データポイントの光学密度を3回読み取るようにします。
    注:実験データポイントの標準偏差は、常に平均の±5%以内である必要があります。

結果

HDP‐2Pの分子モデリングシミュレーションPIおよびホスホイノシチドとの相互作用
分子モデリングプログラムは、リガンド(小さな分子)の標的となる受容体(大きな分子)の分子表面にある最良の9つの結合部位を計算します。これらの部位は、結合親和性が最も高い部位を指定する9つの最も高いエンタルピーの放出によって決定されます。結合親和性は負の値として表され、分子間結合が発熱プロセスであることを示します。HDP-2PがPIと相互作用する場合、シミュレーションでは、活性中心内のHDP-2Pの分子表面にあるPIの4つの結合部位(#3、#6、#7、および#8)が予測されました(表1)。さらに、PIの5つの結合部位は、HDP-2Pの活性中心の外側に見られました。PIの極性ヘッドの荷電部分と極性部分の表記を 図1に示します。

HDP-2P の活性中心は、Gly30、Gly32、His48、Asp49、および Lys69 の 5 つの主要なアミノ酸残基で構成されており、活性中心におけるリン脂質基質の適切な配列を促進し、接触加水分解を確実にします。いくつかの代表的なドッキング構造は、PIが活性中心のいくつかのアミノ酸残基に結合していることを示していますが、結合部位#6では、PIはイオン結合、イオン極性結合、および水素結合を介して活性中心の5つの主要なアミノ酸残基すべてと結合します(表1)。 図2 は、PIが結合部位#6内のHDP-2Pの活性中心にある5つの主要なアミノ酸残基すべてとどのように相互作用するかを示しています。

イノシトール環の位置4にリン酸基を含むHDP-2PとPI-4-Pの間の相互作用のドッキングシミュレーションでは、PI-4-PがHDP-2Pの活性中心に結合する場所として結合部位#1のみが予測されました。具体的には、この部位では、PI-4-Pは、イオン結合、イオン極性結合、および水素結合を介して、活性中心の3つの主要なアミノ酸残基(Gly30、Gly32、およびLys69)と相互作用します(表2)。 図3 は、PI-4-PとHDP-2Pの活性中心との相互作用を示しています。HDP-2Pの分子表面の残りの8つの結合部位では、PI-4-Pは活性中心の外側の位置に結合します。

HDP-2PとPI-4,5-P₂(イノシトール環の4位と5位にリン酸基を含む)との相互作用の分子ドッキングシミュレーションでは、予測された9つの結合部位すべてにわたって酵素の活性中心への結合がないことが明らかになりました。代わりに、PI-4,5-P₂は活性中心に隣接する溝状の空洞に一貫して結合し(図4)、3つのHDP-2P残基、Trp31、Gly33、およびGln34とイオン極性および水素結合を形成します)。

細胞または毒PLA2sの活性中心近くの溝状空洞へのPI-4,5-P₂の結合はこれまで文書化されていませんが、構造的に類似した特徴は、プレクストリン相同性31(PH)およびエプシンN末端相同性32(ENTH)ドメインで十分に確立されています。これらのシグナル伝達ドメインは、非酵素的性質にもかかわらず、特定のPI-4,5-P2認識31,32に同様の疎水性極性カチオン性溝構造を利用します。HDP-2Pに同等の構造モチーフが存在することは、HDP-2Pによる膜ドメイン認識を促進する進化的模倣または収束進化のいずれかの興味深い可能性を高めます。他の方法でさらに検証されれば、この研究は、ホスホイノシチド認識にそのようなメカニズムを利用した毒 PLA2 の最初の報告例となる可能性があります。

興味深いことに、HDP-2Pと相互作用するCLおよびPSの分子ドッキングシミュレーションでは、9つの結合部位のうち8つのHDP-2Pの活性中心への両方のリン脂質の結合が予測されましたが、活性中心の外側にあるCLおよびPSの唯一の結合部位は溝状の空洞に位置しませんでした(データは示していません)。また、PIと同様に、PCは9つの結合部位のうち4つでHDP-2Pの活性中心に結合し、CLやPSのようにPIとPCの両方が溝状の空洞に結合しないことも注目に値します(データは示していません)。これらの発見は、PIのイノシトール環上のリン酸基が、活性中心に隣接する溝状空洞に対して高い結合親和性を有することを示唆しています。構造解析により、細胞33 および毒34 PLA2 酵素の両方において、触媒中心付近に疎水性極性カチオン性表面パッチを持つ類似の溝状空洞が同定されました。これらの空洞へのホスホイノシチドの結合は、生理学的に重要なコンフォメーション変化を誘発し、酵素活性を阻害する可能性があります。特に、ホスホイノシチドの中で、PI-4,5-P2は特に貧弱な基質特性を示し、ヒトPLA2アイソフォーム(細胞質、カルシウム非依存性、および分泌型)は、PI-4,5-Pに対して最小限または検出不能な加水分解活性を示します2 35。これは、これらの保存された構造的特徴へのホスホイノシチド結合が、PLA2スーパーファミリー全体で触媒機能ではなく、明確な生理学的機能(アロステリック阻害など)を果たす可能性があることを示唆しており、将来の実験的検証が必要です。

遊離脂肪酸でアシル化した補酵素Aを用いてモニタリングしたPI、PI-4-P、PI-4,5-P2、PS、またはCLを富むPCリポソームにおけるHDP-2Pの加水分解活性
リポソームサンプルにおけるHDP-2Pの加水分解活性は、コエンザイムA溶液を用いて評価した。補酵素A溶液は無色ですが、HDP-2Pによって触媒されるリン脂質加水分解中に放出される遊離脂肪酸によるアシル化により紫色に変わります。コエンザイムAのアシル化の程度に対応する光学密度の増加を、550 nmで分光光度法で測定しました。したがって、コエンザイムAおよびHDP-2Pで処理されたリポソームサンプルの光学密度の増加は、HDP-2Pの加水分解活性に正比例します。

図5は、さまざまなリポソームサンプルにおけるHDP-2P /リン脂質モル比の関数としての加水分解活性曲線を示しています。HDP-2Pの加水分解活性は、550nmで測定された光学密度(OD)の任意の単位(a.u.)で表されます。有機溶媒中の脂肪酸をコエンザイムAおよびアシル補酵素Aシンテターゼを含む水溶液に添加した場合、550nmで検出可能なOD変化を生じないことが示されたため、有機溶媒中の脂肪酸を遊離脂肪酸のモル濃度に関連付ける検量線は構築しませんでした。これは、そのような脂肪酸が補酵素Aに結合するのではなく、ミセルを形成することを示しています。対照的に、膜生成脂肪酸(PLA2 活性によって生成される)のみが膜関連補酵素Aに結合し、測定可能なOD変化をもたらします。コエンザイムAの両親媒性は、その分子表面に疎水性と親水性の両方の領域を持ち、膜と水の界面に優先的に局在し、PLA2 活性によって生成された脂肪酸の補酵素Aへの結合を促進します。ただし、これらのアッセイ条件下では、脂肪酸のモル濃度を決定することはできません。このため、補酵素Aアッセイを使用する研究者は、PLA2 の加水分解活性を550 nmで測定されたODの任意の単位で表します20。

HDP-2Pの最大の加水分解活性に対応する光学密度の最大の増加は、CLまたはPSが豊富なPCリポソームで観察されました。この発見は、HDP-2Pの活性中心にあるCLおよびPSの結合部位の数が最も多いこととよく一致しています。PIが豊富なPCリポソームにおけるHDP-2Pの加水分解活性は、CLまたはPSが豊富なリポソームよりもそれぞれ3.0倍および2.5倍低かったが、純粋なPCリポソームよりも高かった。これは、両方の脂質が活性中心に同じ数の結合部位を持っているにもかかわらず、PIのHDP-2Pの活性中心への結合親和性がPCの結合親和性よりも高いことを示唆しています。

この明らかな不一致は、PIとPCの極性ヘッドグループの構造の違いによって説明される可能性があります。PCは中性分子ですが、そのカチオン性トリメチルアンモニウム基は溶液の外側に伸びますが、その陰イオン性リン酸基は膜の疎水性領域の近くに配置されます。PCヘッドグループにおけるこの電荷分布は、塩基性HDP-2Pに対して静電反発力を生じさせ、その結合親和性を低下させる可能性がある。対照的に、PIの酸性の性質は、塩基性HDP-2Pとの相互作用にとってより魅力的な脂質種であり、純粋なPCリポソームと比較して高い加水分解活性を説明できる可能性があります。

図5に示すように、PI-4-Pが豊富なPCリポソームにおけるHDP-2Pの加水分解活性は、リン脂質の触媒加水分解が最小限であることを示唆しています。驚くべきことに、PI-4,5-Pが豊富なPCリポソームから得られた光学密度曲線は、このリポソームサンプルにおけるHDP-2Pによる加水分解活性の完全な消失を示しています。これらの発見は、HDP-2Pの活性中心にあるPI-4-Pの1つの結合部位を予測するドッキングシミュレーションとよく一致していますが、PI-4,5-P2は活性中心への結合親和性をまったく示しません。これは、イノシトール環に結合したリン酸基が、HDP-2Pの活性中心へのリン脂質の結合を妨げることを示唆しています。イノシトール環上のリン酸基が溶液中に外側に伸び、イオンおよびイオン極性分子間相互作用を介してHDP-2Pに結合することにより、HDP-2Pを膜表面から距離を保ち、それによってHDP-2Pの加水分解活性から膜を保護することを提案します。これは、ヒト細胞質、カルシウム非依存性、および分泌されたPLA2酵素が、PI-4-PおよびPI-4,5-P2基質に対してほとんど検出できないか、加水分解活性を示さなかったことを明らかにした最近の発見と一致しています35。

PI,PI‐4‐P,PI‐4,5‐P2,PS,またはCLを豊富に含むPCリポソーム膜におけるHDP‐2P誘発透過性変化:カプセル化されたNH₃を含むCuSO4溶液中の配位子置換反応による評価

PI、PI-4-P、PI-4,5-P2、PS、またはCLが豊富なPCリポソームの膜透過性に対するHDP-2P加水分解活性の影響は、置換リガンドがリポソームの内部容積内にカプセル化された錯イオン系でのリガンド置換反応を用いて調査されました。このシンプルで信頼性の高い方法は、錯イオン[Cu(H2O)6]2+の配位子として作用する4つの水分子をNH3によって置換することに基づいています

[Cu(H2O)6]2+ (水力)+ 4NH3 (水力) figure-results-1 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (水力) + 4H2O(l)

錯イオン[Cu(H2O)6]2+のNH3が水分子を置換する過程で、[Cu(H2O)6]2+の淡い青色が[Cu(H2O)2(NH3)4]2+の濃い青色に遷移する。NH3がリポソームの内部体積内にカプセル化され、[Cu(H2O)6]2+が外部溶液中に存在するシステムでは、この色の変化(分光光度法で監視)は、NH3に対するリポソーム膜透過性の増加を示します。

このようなシステムを確立するために、NH3を含むTris-HClバッファーにリン脂質分散液を超音波処理し、リポソームの内側と外側にNH₃を持つ超音波処理リポソームを形成しました。外部NH3 を透析によって除去し、その後、CuSO4 溶液を内部容積にNH3 を含むリポソームサンプルに添加しました。次に、リポソームをHDP-2Pで処理し、光学密度分光光度法で変化をモニタリングしました。

光学密度変化を測定するための最適な波長を決定するために、500 nmから900 nmの範囲の可視光を使用して、0.025 M CuSO4、0.100 M NH3溶液中の[Cu(H2O)2(NH3)4]2+、および0.025 M CuSO4溶液中の[Cu(H2O)6]2+の吸光度スペクトルを記録しました。図6に示すように、600 nmでの照射では、[Cu(H2O)2(NH3)4]2+の吸光度が最大、[Cu(H2O)6]2+の吸光度が最小になったため、膜透過性実験の最適な波長として600 nmを選択しました。

図7は、NH₃に対する膜透過性が、陰イオン性CLおよびPSが豊富なPCリポソームで最も高いことを示しています。この観察は、グループIIA PLA2であるHDP-2Pが陰イオン性リン脂質パルミトイルオレオイル-グリセロホスホグリセロールと効率的に相互作用し、基質加水分解を引き起こすことを示す以前に報告されたデータと一致しています-中性リン脂質パルミトイルオレオイルグリセロホスホコリン36では観察されない効果。一般に、ほとんどのグループIIA PLA2酵素は、陰イオン性リン脂質に対して有意に高い加水分解活性を示します33,37,38。PC + PIリポソームの透過性は、PC + CLおよびPC + PSリポソームの透過性よりも低いですが、純粋なPCリポソームの透過性よりも高いままです。これらの発見は、ドッキングシミュレーションおよびHDP-2P加水分解活性アッセイの結果とよく一致しています。言い換えれば、分子ドッキングデータで予測されるように、HDP-2Pがリン脂質を加水分解できないこと、およびHDP-2がPIおよびホスホイノシチドに結合する親和性が低いため、透過性が低いリポソームサンプルは構造的に安定していると予想されます(図2、図3、および図4)。したがって、HDP-2Pによる酵素加水分解活性(図5)と膜透過性は、図7に示すように正の相関関係があるはずです。

しかし、PC+PI-4-PおよびPC+PI-4,5-P2 リポソームでは、HDP-2Pで処理しても透過性は増加しませんでした。PC+PI-4,5-P2 リポソームの透過性の結果は、同じリポソームのドッキングシミュレーションおよびHDP-2P加水分解活性データとよく相関していますが、PC+PI-4-Pリポソームの透過性の増加がないことは、これらのリポソームでわずかな程度の加水分解活性が記録されたため、加水分解活性の結果と完全には一致しません。これらの発見は、PC+PI-4-Pリポソームにおける加水分解活性のわずかな局所的な増加が、NH3への膜透過性を変化させる程度までリン脂質の二重層充填を妨げないことを示唆しています。

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図1:ホスファチジルイノシトールの極性頭部の荷電部分と極性部分の表記。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:分子ドッキングソフトウェアによって結合部位#6について予測されたHDP-2Pの活性中心とのPIとの相互作用。 PIはスティック表現で、HDP-2Pは線(左図)と分子表面(右図)で表現します。スティック表現の場合、エメラルドは炭素、オレンジはリン、赤は酸素、白は水素を表します。分子表面と線の場合、緑は炭素、青は窒素、赤は酸素、白は水素、黄色は硫黄です。黄色の破線は分子間結合を識別します。矢印は、活性中心のアミノ酸残基を指します。略語:PI =ホスファチジルイノシトール;HDP-2P = 毒蛇毒ホスホリパーゼの塩基性サブユニット。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:PI-4-Pと結合部位#1の活性中心との相互作用 分子ドッキングソフトウェアによって結合部位#1について予測されました。 PI-4-Pはスティック表現で、HDP-2Pは線(左図)と分子表面(右図)で表現します。スティックの場合、エメラルドは炭素、オレンジはリン、赤は酸素、白は水素を表します。分子表面と線の場合、緑は炭素、青は窒素、赤は酸素、白は水素、黄色は硫黄です。黄色の破線は分子間結合を識別します。矢印は、活性中心のアミノ酸残基を指します。略語:PI-4-P =ホスファチジルイノシトール-4-リン酸;HDP-2P = 毒蛇毒ホスホリパーゼの塩基性サブユニット。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:PI-4,5-P2 と、分子ドッキングソフトウェアによって結合部位#6について予測されたHDP-2Pの分子表面との相互作用。 PI-4,5-P2 は、HDP-2Pの活性中心の下にある溝状の洞窟に結合します。活性中心にある5つの主要なアミノ酸残基は、3文字の表記で示されています。PI-4,5-P2 はスティック表現で、HDP-2Pは線(左図)と分子表面(右図)で表現されています。スティックの場合、エメラルドは炭素、オレンジはリン、赤は酸素、白は水素を表します。分子表面と線の場合、緑は炭素、青は窒素、赤は酸素、白は水素、黄色は硫黄です。略語:PI-4,5-P2 =ホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸;HDP-2P = 毒蛇毒ホスホリパーゼの塩基性サブユニット。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:さまざまなHDP-2P/リン脂質モル比でのリポソームのサンプルからの加水分解活性曲線。 PC+CL(濃い緑色)、PC+PS(オレンジ)、PC+PI(濃い青)、PC+PI-4-P(青)、PC+PI-4,5-P2 (緑)、PC(紫)からなるリポソーム。任意の単位の光学密度値は、550 nmでの3回の読み取り値の平均を表します。エラーバーは、3 つの読み取り値の SD を示します。リポソームサンプル間の光学密度値の差の統計的有意性は、ANOVAを使用して評価され、すべての p値は0.05をはるかに下回っていることがわかりました。略語:PC =ホスファチジルコリン;CL = ウシ心臓カル ジオリピン;PS =ホスファチジルセリン;PI = ホスファチジルイノシトール;PI-4-P = ホスファチジルイノシトール-4-リン酸;PI-4,5-P2 = ホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸;AU = 任意の単位;HDP-2P = 毒蛇毒ホスホリパーゼの塩基性サブユニット。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:銅錯体の水溶液の吸光度スペクトル。 銅錯体[Cu(H2O)6]2+ (オレンジ色の線)および[Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (青色の線)を、500 nmから900 nmの範囲の可視光で照射します。銅錯体[Cu(H2O)6]2+ は0.025 M CuSO4 の溶液中で作られ、銅錯体[Cu(H2O)2(NH3)4]2+ は0.100 M NH3を含む0.025 M CuSO4の溶液で作られました。各データポイントのこの図の吸光度値は、3回に分けて行われた吸光度読み取り値の平均です。エラーバーは、3 つの読み取り値からの SD を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図7:リポソームのサンプルからの膜透過性曲線。 PC+CL(紫)、PC+PS(青)、PC+PI(濃い青)、PC+PI-4-P(濃い緑色)、PC+PI-4,5-P2 (オレンジ)、およびPC(緑)で作られたリポソームを、さまざまなHDP-2P/リン脂質モル比で。膜透過率の値は、600 nmで測定された任意の単位(a.u.)の光学密度値として表されます。各データポイントは、3 回の読み取り値の平均を表します。エラーバーは、3 つの読み取り値の SD を示します。リポソームサンプル間の光学密度値の差の統計的有意性は、ANOVAを使用して評価され、すべての p値は0.05をはるかに下回っていることがわかりました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:HDP-2PとPIの候補分子複合体の予測親和性結合エネルギー。 分子モデリングシミュレーションを使用して、結合の種類と結合部位親和性、ならびにホスファチジルイノシトールヘッドグループとそれらの分子間相互作用に関与するHDP2Pアミノ酸残基の両方の荷電部分と極性部分を予測しました。ホスファチジルイノシトールの荷電基と極性基を 図1に示します。NHpbδ+ の Pb はペプチド結合を示すことに注意してください。略語:PI =ホスファチジルイノシトール;HDP-2P = 毒蛇毒ホスホリパーゼの塩基性サブユニット。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:HDP-2PとPI-4-Pの候補分子複合体の予測アフィニティー結合エネルギー。 分子モデリングシミュレーションを使用して、結合の種類と結合部位親和性、ならびにホスファチジル-イノシトール-4-リン酸(PI-4-P)ヘッドグループとそれらの分子間相互作用に関与するHDP2Pアミノ酸残基の両方の荷電部分と極性部分を予測しました。NHpbδ+ の Pb はペプチド結合を示すことに注意してください。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:分子ドッキングワークフロー。 リガンドの構築、受容体の調製、グリッドボックスのセットアップ、PI-HDP-2P相互作用を予測するためのドッキングシミュレーションの実行など、AutoDockを使用した分子ドッキング手順の概要。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

本研究では、ホスファチジルイノシトール(PI)のイノシトール環に共有結合したリン酸基が、ホスホリパーゼA2 (PLA2)酵素によるリン脂質膜の分解を防げるかどうかを調べました。PLA2の加水分解活性によって引き起こされるリン脂質膜分解の進行を評価するために、構造劣化が進行するにつれて増加するはずの膜透過性の変化を測定するためのシンプルでありながら高感度で正確な方法を設計しました。

この方法は、リン脂質リポソームの外側の水性環境に懸濁したヘキサアクア銅(II)錯体[Cu(H2O)6]2+を含む配位子置換反応に基づいており、アンモニア(NH3)はリポソームの内部にカプセル化されています。アンモニアは水分子よりもCu2+ に対する親和性が高いですが、NH3 はリポソーム膜を通過して外部水相にアクセスし、そこでH2O分子を[Cu(H2O)6]2+に置換する必要があります。PLA2触媒によるリン脂質加水分解によりリポソーム膜の構造的完全性が損なわれると、NH3 への膜透過性が増加するとリガンド置換が促進され、[Cu(H2O)6]2+ の淡い青色から[Cu(H2O)2(NH3)4]2+の濃い青色への色の変化につながります.この変態を分光光度法を用いて600nmでの光学密度の変化を定量的にモニタリングしました。

我々は以前に、常磁性イオンフェロシアン化物[Fe(CN)6]3-を含む1H-NMRを使用して、HDP-2P24およびコブラ毒の心臓毒素24、25、26、27、28、39によって影響を受ける膜透過性の変化を研究しました。また、さまざまな蛍光および燐光プローブを使用して、リポソーム膜の透過性に対するコブラ毒の心臓毒素の影響を研究しました20,23,40。ただし、フェロシアン化物および蛍光/燐光プローブは、膜の完全性が著しく損なわれると脂質膜を透過する大きな非生理学的分子実体です。対照的に、当社の新しいリガンド置換アッセイは、微妙な脂質充填摂動で脂質膜に浸透できる小さな天然の細胞代謝産物であるNH₃を利用しています。当社の新しい膜透過性法のこの感度の向上は、¹H-NMR/フェロシアン化物検出に必要な0.004と比較して、HDP-2P/脂質モル比0.001で膜透過性の変化を検出する能力によって証明されています23。

同じ研究では、フェロセンによるエリスロシンリン光消光を使用して、膜間脂質交換に対するHDP-2Pの効果を調べ、試験サンプル(τn)と対照サンプル(τ0)23のエリスロシン寿命の比率の変化によって評価しました。HDP-2P/脂質モル比が0.004の場合、τn/τ0値は0.423に減少し、二価陽イオン24を透過できる膜流動性の状態を示している。したがって、当社のNH₃ベースのリガンド置換アッセイは、HDP-2P/脂質モル比0.001で膜透過性を検出しますが、従来のアッセイ(1H-NMR/フェロシアン化物およびリン光プローブ消光)は、モル比0.004でのみ膜透過性を検出します。これは、当社のNH3ベースのアッセイが従来のアッセイの4倍の感度であることを示しています。

NH3ベースのアッセイの並外れた感度により、加水分解活性測定と密接に相関する透過性データが得られ、明らかな不一致は1つだけあった:PC+PI-4-Pリポソームは、透過性の変化なしにわずかな加水分解を示し、局所的なリゾリン脂質/脂肪酸産生が全体的な脂質パッキングに影響を与えず、膜の構造的完全性と透過性に影響を与えないことを示唆している。このように、本研究は、リポソームの内部容積内にカプセル化されたリガンドを含む錯イオン系におけるリガンド置換反応が、HDP-2Pの加水分解活性データと見事に一致する結果をもたらすことを実証しました。これらの発見は、HDP-2Pの分子表面へのPIおよびホスホイノシチドの結合に関する インシリコ 研究と強く一致していました。

全体として、本研究のAutoDockシミュレーションは、PIが同定された9つの結合部位のうち4つで活性中心に結合するのに対し、PI-4-Pは9つの予測部位のうち1つでのみ活性中心に結合することが明らかになりました。PC+PI-4-PリポソームにおけるHDP-2Pの加水分解活性は、PC+PIリポソームよりも約5倍低かった。さらに、インシリコ研究では、PI-4,5-P2 が HDP-2P の活性中心に結合しないことが予測されました。一貫して、PLA2活性アッセイとリガンド置換反応実験は、PI-4,5-P2がリン脂質加水分解と膜透過性の増加の両方を完全に阻害するのに対し、PI-4-Pはより少ない有意な加水分解活性を示し、膜透過性の変化を完全に防いでいることを示しました。これらの観察結果は、PI、PI-4-P、およびPI-4,5-Pに対するヒト細胞質ゾル、カルシウム非依存性、および分泌されたPLA2酵素のin vitro活性研究とよく一致しています2 35。これらの研究は、グループIVA細胞質ゾルPLA2のみがPIおよびPI-4-Pに対して比較的高い触媒活性を示し、PI-4,5-P2に対する活性はほとんど検出できないことを示しました。他のすべての試験されたPLA2酵素は、PI-4,5-P2 35に対して活性を示さなかった。この活性の欠如は、イノシトール環上の親水性の高いリン酸基に起因しており、膜表面とPLA2酵素との間の生産的な相互作用を妨げます35。イノシトール環上のリン酸基が溶液中に外側に伸び、HDP-2Pの溝状空洞の残基とイオン極性および水素結合を形成する能力により、HDP-2Pが膜表面に近づき、加水分解活性を発揮することができず、それによって膜を安定させ、細胞死経路を活性化することで細胞に有害となる可能性のあるHDP-2Pによるリン脂質膜の分解を抑制する可能性が高いと示唆しています。このメカニズムは、異常な酵素活性を伴う疾患状態におけるホスホイノシチドの潜在的な保護的役割と一致しているようです。

膜透過性アッセイ、加水分解活性測定、 およびインシリコ 分子ドッキング研究から得られた結果の間に強い相関関係があることは、リガンド置換反応法の信頼性を浮き彫りにしています。リポソーム内にカプセル化されたリガンドを利用したこのアプローチは、リン脂質の安定した二重層組織における構造摂動によって引き起こされる膜透過性の変化を評価するための正確かつ効果的なツールであることが証明されています。本論文で紹介したAutoDockを用いた分子ドッキング研究では、リン脂質がHDP-2Pとどのように動的かつ縦断的に相互作用するかを完全には理解できないことは認めますが、HDP-2がさまざまなリン脂質で構成されるリン脂質二重層をどのように透過させることができるかについての追加の分子メカニズムを特定するために、分子動力学研究を将来実施する必要があります。分子動力学研究を実行するには、高性能コンピューターやクラスターなどの高度な計算リソースが必要であり、リソースと研究資金が限られている多くの学術機関では利用できないことに注意することが重要です。最後に、本技術論文における硬質受容体(HDP-2P)の使用と、溶媒/膜環境の欠如を認めます。ただし、硬い受容体を使用してHDP-2Pとさまざまなリン脂質の分子ドッキングを実行することは、ドッキングされた候補構造の最初のパスを特定するための初期ドッキング研究を行うための従来のアプローチであり、基質に結合する触媒側内の重要なアミノ酸残基が特定され、柔軟にすることができる分子領域に焦点を当てると、将来的に柔軟な受容体でフォローアップできる従来のアプローチであることを強調したいと思います。分子ドッキング研究に従い、溶媒和環境で行います。したがって、より多くのリソースを持つ他の機関とのコラボレーションを活用することは、AutoDockによって提供された最初の発見のいくつかを裏付け、基質と酵素の相互作用の追加の分子メカニズムを特定するのに役立つ方法となり得ます。

結論として、この研究の結果は、リポソーム内にカプセル化されたリガンドを利用したリガンド置換反応法が、さまざまな膜媒介プロセスにおける膜透過性の研究に効果的に適用できることを示しています。これらには、リガンド-受容体相互作用、脂質-タンパク質相互作用、膜間交換、膜融合と分裂、神経筋収縮などが含まれます。さらに、このアプローチは膜膜栄養薬の研究に大きな可能性を秘めています。同時に、モデル膜における新しい方法は、膜相互作用の特定のメカニズムを分析するのに非常に貴重ですが、その固有の単純化により、生体膜の構造的、組成的、および機能的複雑さをin vivoで完全に再現する能力が制限されていることを認識しています。したがって、モデルシステムからのデータを慎重に解釈し、可能な限り細胞モデルまたは生物モデルを使用して調査結果を検証することが不可欠です。

開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この記事の研究は、北京朝陽開文学院 (E.S.G.) からのスタートアップ助成金と SEPA 賞、NIH 5R25MD019151-03 (R.K.D.) によって支援されています。HDP-2の調製に関する作業は、ロシア科学財団No.24-15-00280(YNU)からの助成金によって支援されました。著者らは、この研究論文の出版後に作成された分子ドッキングシミュレーションの応用に関するスクリプトの作成とビデオの開発にMaryam Barancheshmeh博士に感謝したいと思います。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
V. nikolskiiバイパーの毒PLA2の基本サブユニットHDP-2P、HDP-2、純度98.5%およびnbsp;モスクワ生物有機化学研究所PMID:18083205のポトコールによるHDP-2の単離。HDP-2PはDEAE Sephadex A-50 によってHDP-2から精製されました。 
カルジオリピン(心臓、牛)(ナトリウム塩)、>99%マックリンC916138
コエンザイムA、フジフィルム和光s NEFAキット アメリカ合衆国マサチューセッツ州レキシントン
透析チューブセルロース膜分子量カットオフ1.0 kDaシグマ・オルドリッチ・トレーディング株式会社(中国・上海)および
デジタル制御の水タンクサーモスタット 楊光明医療機器有限公司(北京、中国)およびnbsp;
電子高精度分析天秤 FA2004 上海邁夷有限公司、中国
景華752 紫外線可視光レンジ分光光度計上海景華インスツルメンツ有限公司、上海、中国
L-&α;-ホスファチジルコリン(卵、鶏肉)≥95%マックリンL799415
L-&α;-ホスファチジルノシトール(肝臓、牛)(ナトリウム塩)≥99%マックリンL780292
L-&α;-ホスファジジルノシトール-4,5-ビスリン酸(脳、豚)(アンモニウム塩)、≥99%マックリンL996223
L-&α;-ホスファチジルノシトール-4-リン酸(脳、豚)(アンモニウム塩)、99%マックリンL970250
L-&アルファ;-ホスファチジルセリン(脳、豚)(ナトリウム塩)、>99%マックリンL864755
磁気攪拌器 JB-3 上海レイチ JB-3
pHメーター PHS-3C 上海INESA科学機器有限公司、中国
TGL-16Bマイクロ遠心分離機 上海3安亭社、上海、中国
超音波ディスペンサー Yt-JY96-IIN 上海イェトゥオ技術有限公司、中国
真空ポンプ TW-1M廷威有限公司、中国・文嶺

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