ここでは、変形性関節症ラットモデルの確立と評価方法を比較を通じて体系的に概説するプロトコルを提示し、急性機械的損傷誘発性変形性関節症と慢性代謝/環境因子誘発性変形性関節症の病因の違いに関する科学的証拠を提供します。ACLT モデルが主な焦点であり、EP4-Ca2+-ミトコンドリア機能不全シグナル伝達経路の変化を強調しています。
この記事について
サマリー
要約
外傷後変形性関節症 (PTOA) は、外傷や激しい機械的ストレスによって引き起こされる変性関節疾患であり、関節軟骨の変性や機能障害を引き起こします。プロスタグランジン E2 (PGE2) は、軟骨細胞膜上の受容体であるプロスタグランジン E 受容体 4 (EP4) を活性化することにより、機械的損傷後の軟骨の劣化に大きく寄与します。関節軟骨の恒常性は主に軟骨の劣化と修復の間の動的バランスに依存しており、このプロセスは軟骨細胞によって細かく調節されています。Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ II (CAMKII) シグナル伝達経路は、軟骨細胞機能の回復を媒介する上で重要な役割を果たすことが示されています。この研究では、インターロイキン-1ベータ(IL-1β)刺激軟骨細胞におけるEP4、イノシトール1,4,5-トリスリン酸受容体(IP3R)、リン酸化CaMKIIの発現の増加が観察され、EP4シグナル伝達とカルシウム調節不全との関連の可能性が示唆されました。ただし、PTOA における EP4-Ca2+/CaMKII 軸の関与を確認する直接的な証拠はまだ不足しています。この潜在的なメカニズムを明らかにするには、遺伝的または薬理学的介入を使用したさらなる調査が必要です。これらの発見は、PTOA 治療の標的としてカルシウム恒常性と EP4 シグナル伝達を調査するための予備的な基礎を提供します。
概要
身体活動は健康上の利点のために広く推進されていますが、依然として下肢の筋骨格系損傷の主な原因であり、さまざまな有害な結果につながる可能性があります1。これらの中で、PTOA は、若い年齢で関節損傷を経験する青年や若年成人にとってますます大きな負担となっています2。驚くべきことに、スポーツ関連の関節損傷を負った人の約 48-52% が 11-17 年以内に PTOA を発症します 3,4。膝関節は、青少年のスポーツやレクリエーション活動で最も頻繁に損傷する関節の 1 つであり、関節損傷から PTOA への進行において特に脆弱です。前向き研究では、膝に損傷を負った人は、損傷後 12-20 年で損傷後 12 年から 20 年後に変形性膝関節症を発症するリスクが 10 倍高いことが報告されています5。さらに、若年成人では、前十字靱帯切断 (ACLT) 損傷を負った女子サッカー選手は 12 年以内に PTOA を発症するリスクが 51% であるのに対し、男性選手は 14 年以内に 41% のリスクがあることが X 線写真による評価で示されています5。これらの発見は、スポーツ関連の関節損傷が筋骨格系の健康に及ぼす長期的な悪影響を浮き彫りにしています。したがって、PTOA 発症の根底にある不可逆的な病理学的メカニズムを理解することは、疾患の進行を緩和することを目的とした適切な介入戦略を特定するために非常に重要です。
Ca2+ 恒常性の早期調節不全は、PTOA 開始の重要な指標の 1 つです6。Ca2+ はカルモジュリン (CaM) に結合して CaMKII と相互作用できる Ca2+/CaM 複合体を形成し、その自己抑制性コンフォメーションを緩和し、キナーゼ活性を調節します7。ヒトとマウスの両方のOAでは、リン酸化CaMKII(CaMKIIの活性化型)の発現が増加しますが、CaMKII阻害剤の使用はリン酸化レベルのこの上昇をブロックし、関節軟骨の破壊につながります8、OA軟骨の恒常性を媒介するCa2+ / CaMKIIの重要な調節的役割を示しています。通常、これらの変化は、PTOA 発生における炎症メカニズムの活性化によって決定的に影響されます。重要な炎症誘発性疼痛メディエーターとしての高レベルの PGE2 は、EP4 受容体を活性化することにより OA の進行に影響を与えます。具体的には、関節軟骨における EP4 の条件付きノックアウトは、軟骨形成と同化代謝を促進し、軟骨細胞の肥大と異化作用を阻害し、それによって線維軟骨の代わりに安定した成熟した関節軟骨の再生を促進し、関節痛を軽減します9。軟骨細胞の生理学における Ca2+/CaMKII シグナル伝達経路の重要な役割と、変形性関節症の進行における EP4 受容体の関与が認識されていることを考慮して、この研究は、EP4 活性化が PTOA 発生中のカルシウムシグナル伝達およびミトコンドリア機能障害の変化と関連しているかどうかを調査することを目的としました。EP4とCa²⁺調節不全の因果関係はまだ決定されていませんが、ここでのデータは、さらなる調査を正当化する可能性のあるメカニズムの関連性を示唆しています。
この研究は、PTOA 発生中の EP4 受容体の活性化と Ca²⁺ シグナル伝達およびミトコンドリア機能障害を結び付ける潜在的なメカニズムに焦点を当てています。PTOA の進行を検出する画像技術などの従来の診断方法や、症状緩和のための非ステロイド性抗炎症薬 (NSAID) などの現在の治療アプローチと比較して、私たちのアプローチは、PTOA 病因における細胞内シグナル伝達障害を早期に明らかにすることを目的としています。このメカニズムの洞察により、病気の発症と進行をより正確に理解できるようになり、早期診断と的を絞った介入のための新しい手段が提供されます。したがって、この研究では、急性または慢性の身体活動中に運動制御障害のあるアスリートに一般的に見られる機械的損傷を模倣するために、前十字靱帯切断 (ACLT) によって誘発される PTOA ラット モデルを確立しました。このモデルは、外傷後の機械的関節損傷の最適な表現として機能し、組織病理学的変化とその根底にある分子メカニズムの両方を調査するための再現性のあるプラットフォームを提供します。高脂肪食と湿った環境曝露 (FD) グループは、慢性変形性関節症に関連する代謝および環境の危険因子をシミュレートすることを目的としたポジティブ コントロールとして機能します。前者は機械的外傷によって引き起こされる急性損傷をモデル化し、後者は代謝障害と環境要因によって引き起こされる自然に発生する疾患モデルを表しますが、このグループの最終的な病因は EP4-Ca²-ミトコンドリア軸に従わない可能性があります。
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プロトコル
動物を含むすべての実験手順は、広東省中医病院の動物倫理委員会によって審査され、承認されました(倫理承認番号:2024014-2)。この研究は、中華人民共和国国務院が定めた実験動物の倫理的使用に関する規則に従って実施されました。
1. 動物
- Sprague-Dawley(SD)近交系SPFラットを使用して、発情周期に関連する潜在的な交絡効果を減らします。この実験のために、生後4週、体重90gから100gの合計9匹の雄SDラットを選択します。
注:これらのラットは、中国の認可された実験動物サプライヤーから調達されました(証明書番号:20240410Aazz0619000774)。 - すべての動物を特定の病原体のない(SPF)環境に維持します。平均湿度 24 ± 2 °C、平均湿度 60 ± 1%、明暗サイクル 12 時間の制御された環境を維持します。
- ラットが酸性水と標準的なげっ歯類の餌を自由に利用できるようにします。
2. 動物モデルの構築と介入
- 給餌センターで2週間ラットを順応させます。ラットを6週齢でランダムに3つのグループに分けます:対照群、PTOA群、およびFD群、各グループに3匹のラット。
- 標準条件下でコントロールグループを維持します。
- PTOA群をイソフルランで麻酔します(導入には4%、維持には1%〜2%)。
- 内側傍膝蓋骨アプローチを使用して、縦方向の皮膚切開を介して両側膝関節を外科的に露出させます。
- メスを使用して ACLT を実行し、前引き出しテスト陽性を実行して完全な切断を確認します。
注:両側ACL切断は、モデルの一貫性を確保し、個人差を減らすために実行されました。両膝のデータを平均して、分析のために動物ごとに 1 つの値を取得しました。 - FDグループのラットを、同じ施設にある気候制御されたチャンバーに定期的に移します。これらのラットに高脂肪食を与えます。
注:高脂肪食には、20%のショ糖、15%のラード、1.2%のコレステロール、0.2%のコール酸ナトリウム、10%のカゼイン、0.6%のリン酸水素カルシウム、0.4%の石灰石粉末、0.4%のプレミックス、および52.2%の基礎飼料が含まれていました。対照飼料の栄養プロファイルは、タンパク質 19%、脂肪 31%、炭水化物 50%、カロリー比はタンパク質 17%、脂肪 37%、炭水化物 46% でした。 - 気候室内の環境条件を温度 24 ± 2 °C、湿度レベル 90 ± 4%、毎日 12 時間の光サイクルに維持します。
注:このような高温多湿の環境では細菌の増殖のリスクが高まるため、汚染を最小限に抑えるために、飲料水と食品を滅菌し、毎日補充してください。実験的介入の合計期間は 12 週間でした。
3. 歩行分析(足跡)
- モデルラットの治療開始から12週間後に、前述の方法を使用してフットプリント分析を実施します10。
- ネズミの後足の腹面に赤インクを塗り、白い紙で覆われた長さ100cm、幅8cmの道を歩かせました。
- ネズミの動きを促すには、道の端に暗い部屋を配置して前進を促します。
- 不規則性を評価するために使用した歩幅や歩幅など、各パラメータの平均値を 3 回連続して測定します。
- 歩幅 (cm) は、同じ後足が 2 つの連続したステップ間の移動距離を測定することによって決定されます。
- ステップの長さ (cm) を、左右の後ろ足の間の水平距離として定義します。
- 足の角度(°)は、水平線11を基準にして、2番目のつま先と踵骨の間の角度として測定します。
- Image-Pro Plusソフトウェア(バージョン6.0)を使用して、内蔵の距離および角度測定ツールを利用して、スキャンしたフットプリント画像で歩幅、歩幅、および足の角度を直接測定します。
注: これらの歩行パラメータは、変形性関節症の初期段階で微妙な機能障害を特定するために重要です。患者は、痛みを伴う関節を保護するために歩幅と歩幅の減少を示すことがありますが、痛みによって引き起こされる関節の不安定性に対する代償反応として、つま先の出くさと歩行の非対称性の増加がしばしば発生します。
4. 接合部径測定
- 各グループでモデリングした後、校正されたスパイラルマイクロメーター(mm)を使用して関節の直径を測定します。
注: 変形性関節症が進行すると、患者は通常、関節の腫れと痛みを示します。腫れの程度が高いほど、病気のより深刻な段階を示している可能性があります。
5.握力測定
- トラクショングリッドを備えたデジタル握力計、トラクショングリッドを備えた筋力計(90mm×90mm)を使用して、後肢の握力を測定します。
- ネズミの尻尾と首の後ろの皮膚をそっと押さえます。
- 後肢がグリッドをしっかりとつかむまで動物を下げ、グリップを解除するまでフォースセンサーの軸に沿って動物を水平に着実に引っ張ります。
- 動物ごとに3回テストを繰り返します。最大握力として最高値を記録する。
注: 後肢の握力テスト中は、前肢がトラクショングリッドに誤ってかみ合わないように、前肢を段ボールの表面にテープで固定して固定します。握力の低下は、変形性関節症の進行に関連する筋機能の低下と潜在的な痛み関連の運動障害を示しています。
6.初代軟骨細胞の単離と培養
- 生後6週齢の雄スSprague-Dawleyラットから初代軟骨細胞を単離します。
- 大腿骨頭と脛骨プラトーを解剖して、約100〜150mgの軟骨組織を収集します。
- 1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むPBSで組織を2回洗浄します。
- 軟骨を5mLの0.25%トリプシン-EDTAで3°Cで30分間消化します。
- 軟骨を1〜2 mmの3 個に切断し、さらに10 mLの0.2%コラゲナーゼIIを37°Cで恒温シェーカーで4時間消化します。
- 細胞懸濁液を70μmの細胞ストレーナーでろ過し、300× g で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
- 10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEM / F12培地に細胞ペレットを再懸濁します。
- 細胞を5%CO2を含む加湿雰囲気中で3°Cでインキュベートします。
7.細胞処理
- 血球計算盤を使用して単離された軟骨細胞をカウントします。
- 軟骨細胞を0.1 mLの完全培地(10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEM / F12)にウェルあたり2×105 細胞の密度で6ウェルプレートに播種します。
- 細胞を37°Cで5%CO₂インキュベーターで24時間インキュベートし、接着させます。
- in vitro 炎症性 PTOA モデルを確立するには、細胞合流が約 80% に達したら、接着軟骨細胞を IL-1β (10 ng/mL) で 48 時間処理します。
- FDポジティブコントロールの場合、パルミチン酸(PA、CAS No. 57-11-4)をクロロホルムに1:1000希釈して500 μMのストック溶液を調製します。
- 細胞のコンフルエンスが約80%に達したら、培地1 mLあたり1 μLのPAストック溶液を加えて、最終的なPA濃度500 nMに達します。軟骨細胞をこの溶液で48時間処理します。
- 培地1 mLあたり1 μLのクロロホルム(ビヒクルコントロール)を添加して、PAを含まない対照細胞に投与します。
8. サンプルの採取、脱灰、包埋の準備
- 介入後12週間で、密閉チャンバー内でイソフルラン(≥5%)の過剰摂取を少なくとも5分間吸入することにより、動物を安楽死させ、呼吸と心拍の完全な停止を確認します。
注:この方法は動物倫理委員会によって承認され、実験動物の人道的安楽死に関する国家ガイドラインに準拠しています。 - 組織学的評価のために、グループごとに3匹のラット(n = 3、合計= 6膝)から両方の膝関節を収集します。
- サンプルを4%パラホルムアルデヒド(PFA)で、組織と固定剤の体積比を1:20を超えるで、°Cのシェーカーで48時間以上固定します。
- 流水水でティッシュを1〜2時間すすぎ、残留固定液を除去します。
- 0.5 M EDTA溶液(pH 7.4、~15%)で組織と溶液の比率を1:20で3°Cで21日間脱灰し、3日ごとに新鮮な溶液と交換します。
- 軟化のために針で骨を探ることにより、脱灰の完了を評価します。
- 脱灰した組織を流水水で2時間洗浄し、包埋カセットに入れます。
- 段階的なエタノールシリーズでサンプルを脱水します:75%エタノールを2時間(または一晩)、80%エタノールを2時間、95%エタノールを0.5時間、無水エタノールを2回60分間。次に、1:1キシレン:エタノールに20分間浸漬します。
- キシレン中の組織を2回(10分と60分)透明にします。
- キシレン:パラフィン(1:1)を15分間、軟質パラフィンを52〜5°Cで1時間(2回)、次に硬質パラフィンを56〜5°Cで30分間の順序で組織に浸潤させます。
- パラフィン包埋システム(ライカなど、6°Cに設定)を使用して組織を包埋し、ブロックを-2°Cのコールドプレートに2時間移します。
- パラフィンをミクロトームを用いてμmの厚さで矢状にブロックする切片
- リボンを4°Cの水浴に浮かせ、きれいなスライドガラスに取り付けます。
- マウントされた切片を風乾させ、60°Cのオーブンで2時間焼き、残留パラフィンを除去します。
- キシレン(10分)、フレッシュキシレン(10分)、無水エタノール(5分)、フレッシュ無水エタノール(5分)、90%エタノール(5分)、75%エタノール(5分)に順次浸漬して切片を脱パラフィンし、染色前に水道水ですすいでください。
9.ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色
- 浸漬脱パラフィン化および再水和した組織切片を、室温(RT;~2°C)で0.5%ヘマトキシリン染色液に3〜5分間浸漬し、続いて流水道水で完全にすすいだ。
- ヘマトキシリン分化溶液で切片を2〜5秒間短時間処理し、流水道水ですすいでください。
- 切片をヘマトキシリンブルーイング溶液に2〜5秒間浸漬し、その後すすぎてブルーイングを実行します。
- 切片を85%および95%エタノールでそれぞれ5分間脱水し、次に0.05%エオシンY(アルコール)で5分間染色します。
- 無水エタノールで2回脱水し(各5分)、次にキシレンで透明化(5分)、続いて新鮮なキシレン(5分)で脱水します。
- 中性バルサムでセクションを取り付け、カバーガラスで覆います。
注:保存状態の良い軟骨では、ヘマトキシリンは核を青色に染色し、エオシンはマトリックスをピンク色に染色します。損傷した軟骨は、軟骨細胞の喪失、細動、および無秩序なマトリックスを示します。
10.サフラニンO-ファストグリーン(SOFG)染色
- 2%ファストグリーン溶液でRTで1〜5分間切片を染色します。軟骨が無色になるまで流水道水で洗浄します。
- 1%塩酸で10〜15秒間切片を簡単に区別し、流水で完全にすすいでください。
- 0.2%サフラニンO溶液で切片を5〜10秒間染色し、無水エタノールの4回の交換(各3〜5秒)で急速に脱水します。
- キシレンで切片をクリアし(5分)、続いて新鮮なキシレン(5分)で切り片を除去します。
- スライドをニュートラルバルサムで取り付け、カバーガラスで覆います。
注:サフラニンOは軟骨プロテオグリカンを赤く染色し、ファストグリーンは骨/線維組織を緑色に染色します。赤の喪失は、プロテオグリカンの枯渇と変性を示します。 - 変形性関節症研究会国際 (OARSI) スコアリング システムを使用して組織学的変化を評価します。関節腔の幅と軟骨の厚さを測定して、構造変性を評価します。光学顕微鏡(ECLIPSE Ti2-Eなど)で4×(スケールバー= 50 μm)および20倍(スケールバー= 10 μm)で画像をキャプチャします。
注:画像キャプチャにはシステムのイメージングソフトウェアを使用し、分析にはImageJ(v1.48v)を使用してください。マイクロメーターで Analyze > Set Scale で画像を校正します。各関節について、3 人の独立した観察者による盲検分析を使用して、3 つの矢状切片から 5 つのランダム フィールドを定量化します。
11.マイクロμ CT
- 介入後12週間でラットの膝関節を解剖し、組織の形態を維持するために、RTで24時間4%パラホルムアルデヒドで直ちに固定します。
- 固定サンプルをPBSですすぎ、スキャンするまで70%エタノールに保管します。
- スキャンする前に、各膝関節標本を専用のサンプルホルダーに取り付けます。ジョイントを長軸に沿って整列させて、モーションのアーティファクトを最小限に抑えます。
- X線電圧70 kV、電流100 μA、電力7 Wのスキャンパラメータを持つマイクロμCTシステムを使用してマイクロμCTスキャンを実行します。
- 投影ごとに 4 つのフレームを取得し、それらを積み重ねて画質を向上させ、0.72° の回転ステップ サイズで 360° のフル回転を完了します。
- 得られたボクセルサイズ(スライスの厚さ)を15μmに設定し、小柱骨解析に適した高解像度画像を提供します。
- 大腿骨と脛骨の両方の軟骨下骨に焦点を当てて、近位脛骨成長プレートと脛骨プラトーの間の関心領域(ROI)を定義します。
- 再構成ソフトウェアを使用して、生のスキャンデータを断面画像に再構成します。
- 再構成された画像スタックを適切なソフトウェアにインポートして、定量的形態計測分析を行います。
- 骨体積分率 (BV/TV、%)、骨密度 (BMD、g/cm³)、小柱分離 (Tb.Sp、mm) などの主要なパラメーターを評価します。
- 定性的および3次元の視覚化のために、3D視覚化ソフトウェアを使用して、骨のマイクロアーキテクチャの体積レンダリングを生成します。
- 目視評価を行い、定量データで観察された構造的完全性と形態学的変化を確認します。
注:すべての画像処理と分析は、偏りのない結果を保証するために、盲検化されたオペレーターによって実施されました。
12.エリサ
- 介入の12週間後にラットを麻酔します。腹部大動脈を注意深く露出させて解剖し、血液サンプルを採取します。
- 採取した血液をRTで30分間凝固させた後、755 × g (ローター半径7.5 cmの遠心分離機を使用して3000 rpmに相当)で°Cで15分間遠心分離します。
- 市販のELISAキットを使用して、その後のPGE₂レベル測定のために血清を分離して保管します。
- 並行して、初代軟骨細胞をシードし、それらを24時間培養し、続いて確立された細胞処理プロトコルに従って、IL-1βおよびPAで48時間処理します。介入後、同じELISAキットを使用して、培養上清を収集し、PGE₂濃度を分析します。
13. 定量的RT-PCR
- 市販のRNA抽出試薬(TRIzol)を使用して、細胞サンプルからトータルRNAを抽出します。
- 逆転写キット(gDNAリムーバー付き)を使用してcDNAを合成し、得られたcDNAを-8°Cで保存してその後の分析を行います。
- SYBR Greenを用いて定量PCRを行い、2−ΔΔCt法を用いて相対発現量を算出します。
注:使用されたプライマー配列は次のとおりです。β-アクチンフォワード:ACAACCTTCTTGCAGCTCCTC;β-アクチン逆:CTGACCCATACCCACCATCAC;EP4 フォワード: GGCACATTGTTGGTAAGCCC;EP4 フォワード: GGCTGTAGAAGTAGGCGTGG;COX-2フォワード:GATGACGAGCGACTGTTCCA;COX-2 リバース: TGGTAACCGCTCAGGTGTTG。
14. ウェスタンブロッティング分析
- 氷上でRIPAバッファーで細胞を30分間溶解します。
- タンパク質サンプルをSDS-PAGEで90分間分離し、ニトロセルロース膜に2時間移します。
- 5%BSAで膜をブロックし、リン酸緩衝液で洗浄します。
- 特異的抗体を用いてイムノブロッティングを行います。
注:抗体およびそれぞれの希釈液は、抗MMP9(1:1000)、抗コラーゲンII(1:1000)、抗COX2(1:1000)、抗CaMKII(1:1000)、抗p-CaMKII(1:1000)、抗IP3R(1:1000)、抗Cyt-C(1:1000)、および抗βアクチン(1:2000)であった。 - 一次抗体と一晩インキュベートした後、メンブレンをTBSTで洗浄し、二次抗体(マウス-HRP(1:2000)またはウサギ-HRP(1:2000)と暗所で1時間インキュベートします。
- TBSTで再度洗浄した後、強化された化学発光キットを使用してタンパク質検出を実行します。
- ImageJソフトウェア(バージョン1.48v)でデータを解析します。
15.免疫蛍光染色
- 軟骨細胞を12ウェルプレートのカバーガラス上で80%のコンフルエンスに達するまで培養します。
- IL-1βおよびPAで48時間処理した後、または対照として処理しなかった後、RTでPBS中の4%パラホルムアルデヒドで細胞を15分間固定します。
- 0.2%Triton X-100を含むPBSで細胞を15分間透過処理します。
- 細胞をPBSで3回(各5分)洗浄し、抗体希釈バッファー中で一次抗体(抗IP3R、1:200希釈)と一晩インキュベートします。
- 細胞を1:500希釈液のフルオレセインイソチオシアネート標識ヤギ抗ウサギIgG二次抗体に1時間さらします。
- 細胞を5 μg/mLのDAPI溶液で10分間対比染色します。
注:蛍光画像は、40倍の対物レンズ(スケールバー= 2 μm)を使用して取得しました。すべての画像はZENソフトウェアで処理され、一貫したキャリブレーション手順に従ってImageJ(バージョン1.48v)で定量化されました。
16. 統計分析
- GraphPad Prism(バージョン8.0.2)を使用して統計分析を実行します。
- パラメトリック検定を適用する前に、Shapiro-Wilk 検定を使用して正規分布を評価し、Brown-Forsythe 検定と Bartlett 検定を使用して分散の均一性についてデータを評価します。
- 複数のグループ間の比較には一元配置分散分析とそれに続くTukeyの事後検定を使用し、2つのグループ間の比較には両側対応のないスチューデントのt検定を適用します。
- 0.05未満のP値を統計的に有意であると考えます。
- すべてのデータを、少なくとも 3 つの独立した実験からの平均±標準偏差 (SD) として提示します。
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結果
ACLT誘発性PTOAは、FD誘発性慢性KOAと比較して、早期の軟骨破壊と行動障害を示します(図2および図3)
関節腔の狭窄と軟骨変性は、OA の主な結果です。以前の研究では、過体重と環境要因 (湿気の多い気候など) がOA 発症の潜在的な原因として特定されており 12,13、これは老化に直接関連し、後年の OA 発症につながる可能性があります。本研究では、スポーツ関連の外傷がOAの進行を加速する可能性があるかどうかを調査するために、PTOAモデルとしてACLT誘発性外傷群を、慢性OAの陽性対照としてFDモデルを確立しました。従来の行動評価、HE染色、SOFG染色、およびマイクロμCTを使用して、ラットの関節表面形態、組織病理学的変化、および軟骨下骨の微細構造を調べることにより、OAの進行を評価し...
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ディスカッション
環境要因や食事要因によって引き起こされる慢性 OA と比較して、ACLT 誘発性関節外傷は病気のより急速な進行につながります。関節の腫れ、後肢の握力、歩行分析などの行動評価に基づく結果は、環境要因や食事要因によって誘発された対照群、PTOA群、陽性対照群の間で有意差が明らかになりました。12週間の介入後、PTOA群では、後肢の握力の大幅な低下と不安定な歩行を伴う過度の関節腫脹が観察され、サンプル採取の適切な時点が示されました。両方の介入モデルにおける OA の進行のさらなる評価は、H&E 染色、SOFG 染色、およびマイクロ μCT 分析を通じて実施されました。組織学的検査により、PTOA グループはより顕著な関節腔の狭窄と軟骨の菲薄を示すことが示されました。対照的に、FD グループの OA 病理は、初期の行動の変化と比較して、この段階ではあまり明らかではありませんでした。さらに、組織学的所見との相関を強化するためにマイクロμCT分析を実施し、ほぼすべての測定パラメータがH&E染色およびSOFG染色の結果と一致していることが明らかになりました。具体的には、PTOA群は軟...
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、中国国家自然科学基金(第82205147号)からの助成金によって支援されました。No. 62472046);広東省体育局の科学研究プロジェクト(GDSS2024N038);広州中医薬大学(GZYFT2024G08)の大学病院共同基金プロジェクト。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.2%コラゲナーゼII | Sigma-Aldrich, アメリカ | CAS番号:9001-12-1 | 初代軟骨細胞の単離と培養 |
| 0.2% トリトン X-100 | Beyotime, 中国 | ST795 | 免疫蛍光 |
| 0.25%トリプシン-EDTA | 武漢ボスターバイオロジカルテクノロジー株式会社 | AR1071 | 脱 灰 |
| 0.25%トリプシン-EDTA | Gibco, アメリカ | 25200072 | 初代軟骨細胞の単離と培養 |
| 4%パラホルムアルデヒド固定液 | Biyuntian, 中国 | P0099-3L | 組織固定 |
| 抗CaMKII抗体 | Huabio, 中国 | ET1608-47 | ウェスタンブロット(1:1000) |
| 抗コラーゲンII抗体 | アブカム、英国 | AB34712 | ウェスタンブロット(1:1000) |
| 抗COX2抗体 | アブカム、英国 | AB179800 | ウェスタンブロット(1:1000) |
| 抗Cyt-C抗体 | Selleck, 中国 | F2534 | ウェスタンブロット(1:1000) |
| 抗IP3R抗体(B-2) | サンタクルーズ、アメリカ | SC-377518 | ウェスタンブロット(1:1000) |
| 抗MMP9抗体 | アブカム、英国 | AB76003 | ウェスタンブロット(1:1000) |
| 抗p-CaMKII抗体 | Selleck, 中国 | F0342 | ウェスタンブロット(1:1000) |
| 抗&β;-アクチン抗体 | Cell Signaling Technology (CST)、米国 | 8H10D10 | ウェスタンブロット (1:2000) |
| BSAブロッキングソリューション | シグマ・アルドリッチ(米国) | 該当なし | ウェスタンブロットブロッキング用の5%BSA |
| 遠心分離機(5424 R) | Eppendorf, ドイツ | 該当なし | 755 & 回;g 遠心分離速度 |
| クロロホルム | シグマ・アルドリッチ(米国) | 該当なし | PA用溶剤 |
| 空調チャンバー(RXZ-158A) | 国内メーカー、中国 | 該当なし | 湿度の高い環境モデル |
| カラー逆転写キット | Invitrogen、蘇州、中国 | 該当なし | cDNA合成 |
| CTAnソフトウェア | ブルカー | バージョン 1.9 および 4.1 | 定量的形態計測分析用 |
| CTVolソフトウェア | ブルカー | バージョン2.0 | 定性的および3次元的な視覚化のために |
| DAPI染色液 | Beyotime, 中国 | 該当なし | 核染色(5µg/mL) |
| デジタル握力計 | プシン機器 | 該当なし | 後肢の握力の測定 |
| DMEM/F12 ミディアム | コーニング、米国 | 該当なし | 細胞培養培地 |
| EDTA(エチレンジアミン四酢酸) | アラジン | 該当なし | 骨組織の脱灰 |
| PGE2用ELISAキット | Elabscience、武漢、中国 | PGE2E-EL-0034 | ELISA検出 |
| 強化化学発光キット | Millipore, アメリカ | WBKLS0500 | ウェスタンブロット検出 |
| エタノール | 広東広石試薬技術有限公司 | CAS:64-17-5 | 組織脱水 |
| ウシ胎児血清 (FBS) | コーニング、米国 | 該当なし | 培養用濃度10% |
| FITC 標識ヤギ抗ウサギ IgG | Beyotime, 中国 | P0179キット | 免疫蛍光(1:500) |
| GraphPadプリズム | GraphPad Software、米国 | バージョン 8.0.2 | データ分析 |
| ヘマトキシリンとエオシン (H&E) 染色キット | Servicebio、武漢 | G1005 | 組織学 |
| IL-1&ベータ; | PeproTech、米国 | 400-01B | 10 ng/mL(PTOA細胞モデルの場合) |
| イメージJ | NIH、米国 | バージョン 1.48v | 画像解析 |
| Image-Pro Plusソフトウェア | メディアサイバネティクス | バージョン 6.0 | スキャンした足跡からの定量的歩行分析 |
| イソフルラン | 上海ヤジバイオロジカル | YS1412C | 動物手術用麻酔 |
| ライカエンベディングセンター | ライカマイクロシステムズ | EG1160 | パラフィン包埋 |
| ライカミクロトーム | ライカマイクロシステムズ | 2235リンギット | パラフィン包埋組織の切片化 |
| ライカウォーターバス | ライカマイクロシステムズ | HI1210 | フローティングパラフィンセクション |
| 光学顕微鏡(ECLIPSE Ti2-E) | ニコン、日本 | 該当なし | 組織学的観察 |
| マイクロCTスキャナー(ZKKS-MCT-Sharp) | 国内メーカー、中国 | 該当なし | 骨イメージング |
| マウス-HRP二次抗体 | Cell Signaling Technology (CST)、米国 | 7076 | 1:2000希釈 |
| NIS-Elementsイメージングソフトウェア | ニコン | 該当なし | 顕微鏡画像のキャプチャと解析 |
| NReconソフトウェア | Bruker, ドイツ | バージョン 1.6 | CT再構成 |
| パルミチン酸(PA) | シグマ・アルドリッチ(米国) | P0500 | 500 & マイクロ;FDセルモデル用Mストック |
| セクショニング用パラフィンワックス、病理学グレード、融点52-54°C | 広東広石試薬技術有限公司 | Y258797-500g | 組織処理中のパラフィン包埋に使用 |
| セクショニング用パラフィンワックス、病理学グレード、融点56-58°C | 広東広石試薬技術有限公司 | Y258799-500g | 組織切片における最終的なハードワックス包埋に使用 |
| PBS(リン酸緩衝生理食塩水) | Gibco / サーモフィッシャー | C10010500BT | 細胞洗浄と組織洗浄 |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | コーニング、米国 | 該当なし | 細胞培養用1% |
| PVDFメンブレン(0.45µm) | Millipore, アメリカ | IPVH00010 | ウェスタンブロットメンブレン |
| Rabbit-HRP二次抗体 | Cell Signaling Technology (CST)、米国 | 7074 | 1:2000希釈 |
| 赤字 | ヒーロー | ヒーロー204 | 歩行分析における足跡追跡 |
| RIPA溶解バッファー | Keygen, 中国 | 該当なし | タンパク質抽出 |
| サフラニンO–高速グリーン染色キット | Servicebio、武漢 | G1053 | 組織学的染色 |
| スパイラルマイクロメータ(ノギス) | 黄山、中国 | 該当なし | 関節幅測定 |
| 軟骨下骨解析ソフトウェア(CTAn) | Bruker, ドイツ | バージョン 1.9 および 4.1 | 形態計測分析 |
| SYBR グリーンPCRマスターミックス | AG Scientific、中国 | 該当なし | qPCR分析 |
| ウェスタンブロット試薬(RIPAバッファー、SDS-PAGEゲル成分、ローディングバッファー、TBSTなど) | Beyotime Biotechnology(中国) | N/A(グループエントリとして使用) | ウェスタンブロッティング手順に使用されるすべてのルーチン試薬 |
| キシレン | 広東広石試薬技術有限公司 | CAS:1330-20-7 | 組織の透明化 |
参考文献
- Whittaker, J. L., Roos, E. M. A pragmatic approach to prevent post-traumatic osteoarthritis after sport or exercise-related joint injury. Best PractRes Clin Rheumatol. 33 (1), 158-171 (2019).
- Maia, C. R., et al. Post-traumatic osteoarthritis: The worst associated injuries and differences in patients' profile when compared with primary osteoarthritis. BMC Musculoskel Dis. 24 (1), 568(2023).
- Luc, B., Gribble, P. A., Pietrosimone, B. G. Osteoarthritis prevalence following anterior cruciate ligament reconstruction: A systematic review and numbers-needed-to-treat analysis. J Athl Train. 49 (6), 806-819 (2014).
- Chen, T., et al. Radiographic osteoarthritis prevalence over ten years after anterior cruciate ligament reconstruction. Int J Sports Med. 40 (11), 683-695 (2019).
- Roos, E. M. Joint injury causes knee osteoarthritis in young adults. Curr Opin Rheumatol. 17 (2), 195-200 (2005).
- Chery, D. R., et al. Early changes in cartilage pericellular matrix micromechanobiology portend the onset of post-traumatic osteoarthritis. Acta Biomater. 111, 267-278 (2020).
- Nguyen, B. V., et al. A domain-swapped camkii conformation facilitates linker-mediated allosteric regulation. bioRxiv. , (2024).
- Nalesso, G., et al. Calcium calmodulin kinase II activity is required for cartilage homeostasis in osteoarthritis. Sci Rep. 11 (1), 5682(2021).
- Jiang, W., et al. PGE2 activates EP4 in subchondral bone osteoclasts to regulate osteoarthritis. Bone Res. 10 (1), 27(2022).
- Nasiri, N., Hosseini, S., Reihani-Sabet, F., Baghaban Eslaminejad, M. Targeted mesenchymal stem cell therapy equipped with a cell-tissue nanomatchmaker attenuates osteoarthritis progression. Sci Rep. 12 (1), 4015(2022).
- Esmaeili, A., et al. Co-aggregation of MSC/chondrocyte in a dynamic 3D culture elevates the therapeutic effect of secreted extracellular vesicles on osteoarthritis in a rat model. Sci Rep. 12 (1), 19827(2022).
- Wang, L., Xu, Q., Chen, Y., Zhu, Z., Cao, Y. Associations between weather conditions and osteoarthritis pain: A systematic review and meta-analysis. Ann Med. 55 (1), 2196439(2023).
- Datta, P., et al. High-fat diet-induced acceleration of osteoarthritis is associated with a distinct and sustained plasma metabolite signature. Sci Rep. 7 (1), 8205(2017).
- Sun, Q., et al. Inhibition of PGE2 in subchondral bone attenuates osteoarthritis. Cells. 11 (17), 2760(2022).
- Wang, G., et al. Opposing effects of IL-1Β/COX-2/PGE2 pathway loop on islets in type 2 diabetes mellitus. Endocr J. 66 (8), 691-699 (2019).
- Curtis, E., et al. Safety of cyclooxygenase-2 inhibitors in osteoarthritis: Outcomes of a systematic review and meta-analysis. Drugs Aging. 36 (Suppl 1), 25-44 (2019).
- Jin, Y., et al. A novel prostaglandin E receptor 4 (EP4) small molecule antagonist induces articular cartilage regeneration. Cell Discov. 8 (1), 24(2022).
- Dupont, G., Goldbeter, A. Cam kinase ii as frequency decoder of Ca2+ oscillations. Bioessays. 20 (8), 607-610 (1998).
- Pritchard, S., Guilak, F. Effects of interleukin-1 on calcium signaling and the increase of filamentous actin in isolated and in situ articular chondrocytes. Arthritis Rheum. 54 (7), 2164-2174 (2006).
- Bartok, A., et al. IP3 receptor isoforms differently regulate ER-mitochondrial contacts and local calcium transfer. Nat Commun. 10 (1), 3726(2019).
- Katona, M., et al. Capture at the ER-mitochondrial contacts licenses IP3 receptors to stimulate local Ca2+ transfer and oxidative metabolism. Nat Commun. 13 (1), 6779(2022).
- Lin, F., et al. Positioning regulation of organelle network via Chinese microneedle. Sci Adv. 10 (16), eadl3063(2024).
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