方法論記事

タンデムアッセイにおける逐次タンパク質免疫蛍光によるRNA In situ ハイブリダイゼーション

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DOI：

10.3791/68615

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2025年10月10日

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1Department of Hematopoietic Biology & Malignancy, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Melanoma Medical Oncology Research, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 5Department of Veterinary Medicine & Surgery, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、標的細胞レベルの空間マルチオミクスを特徴付けるために、自動化されたプラットフォーム上の組織における逐次タンパク質免疫蛍光によるRNA in situ ハイブリダイゼーションを詳述します。

要約

宿主内の細胞の機能は、孤立した信号に依存しません。代わりに、最小の RNA 分子から最大のタンパク質に至るまで、すべての成分が人体内で調和して調整して機能する必要があります。そのため、複数のオミクスにわたる細胞レベルの空間調査を統合するアプローチの重要性は、細胞間相互作用と疾患の進行を理解するために最も重要です。同じ空間アッセイでプロテオームとトランスクリプトームを解剖することは、細胞が実行するように指示されていること(RNA)だけでなく、細胞が置かれている微小環境ニッチ(タンパク質)のコンテキストでそれらの指示をどのように実行しているかを理解するのに役立ちます。この原稿は、逐次免疫蛍光 (SeqIF) と RNA in situ ハイブリダイゼーション (ISH) を、空間コンテキストでのハイスループットタンパク質および RNA 調査のための組織内マイクロ流体駆動システム (seqRNA-ISH+seqIF) と統合することに焦点を当てており、1 回の実行で最大 12 の RNA と 24 のタンパク質ターゲットを可能にし、追加のタンパク質ターゲットを追加することができます順次実行。この方法は、蛍光色素の適合性や、より高いプレックス化のための広範な最適化を考慮する必要のないシーケンシャルターゲットマルチオミクスプラットフォームを提供します。これにより、細胞がどのようなメッセージをプライミングしているか、または微小環境に送信しているかを理解できます。この標的アプローチは、RNAとタンパク質間の相互作用をより正確に調べながら、トランスクリプトーム全体の方法を検証するのに役立ちます。

概要

人体内の細胞の複雑な機能は、小さなRNA分子から大きなタンパク質に至るまで、すべてが協調して機能するシグナルの複雑な相互作用に依存しています1。この相互作用は、さまざまなオミクス層にわたる細胞レベルの空間相互作用を調べる統合的アプローチの重要性を強調しています2,3。このような方法論は、細胞間相互作用と疾患の進行の複雑さを理解するために不可欠です。フローサイトメトリー4やシングルセルシーケンシング5などの多くの従来の方法では、細胞分離株を使用して、特定のサンプル内に存在する表現型のバルク比を特定するために、分解されたサンプルを調査します。ただし、分析のために細胞を単離すると、活性化または表現型の変化が誘発される可能性があり、その固有の生物学およびその場での機能を正確に反映していない可能性があります6。空間生物学における高度な方法は、組織構造のコンテキストと複数の分子タイプにわたる隣接細胞との空間的関係を損なうことなく、細胞とその微小環境を研究するための新しい戦略を提供します2,7。

個々の細胞を単離せずに、同じ空間アッセイ内にトランスクリプトーム分析とプロテオーム分析を統合することで、細胞機能の包括的なビューが得られます8。この方法は、単一分子RNA蛍光in situ ハイブリダイゼーション(FISH)法に基づいて構築されていますが、連続したタンパク質調査を複雑にするプロテイナーゼ消化は含まれていません8。単一のセクションで使用されるアプローチの柔軟性により、空間的に高解像度になり、セクションを統合および整列するための画像処理が少なくなります。このアプローチは、細胞が受け取る指示(RNA)と、その特定の微小環境ニッチ内でのそれらの実行(タンパク質)の両方についての洞察を提供します。これらの情報層を組み合わせることで、研究者は細胞の挙動とコミュニケーションについてより深い洞察を得ることができます。

手動の方法が存在しますが、空間オミクス技術の最近の進歩により、手動マルチプレックスを使用して調べられるより多くのプロテオミクスマーカーを使用したより複雑な分析が可能になりました9。これらのアプローチには、タンパク質とRNA-ISHアッセイ10、11、12、13、14の両方の進歩、およびシステム特異的結合抗体15、16、17、イメージングマスサイトメトリー(IMC)18、19、20を必要とする自動化された方法論が含まれますおよび、既製の一次および二次抗抗体を利用する他の自動蛍光逐次プロテオミクス方法論2,21,22。これらの技術は、プロテオミクス、または標的アプローチを使用したトランスクリプトミクスとプロテオミクスの組み合わせのいずれかを促進し、通常、プローブを介してRNAを視覚化し、同様の複合体に基づく抗体を介してタンパク質の両方を視覚化し、同じ方法論または機器を使用して同時または連続したRNAとタンパク質を同時検出できるようにします。これらのタイプのアプローチは、細胞活動の包括的なビューを提供することで、細胞とその微小環境との間の細胞コミュニケーションについての理解を深めることを目的としています。これは、細胞相互作用の複雑さを解読するための貴重なツールを提供し、正常な生理学的プロセスと疾患メカニズムについての新たな洞察を明らかにする可能性があります。

このプロトコルは、RNA in situ ハイブリダイゼーション(ISH)と逐次免疫蛍光(SeqIF)を組織上のマイクロ流体駆動システムと統合するためのガイダンスを提供します。これにより、RNAとタンパク質をネイティブの空間コンテキスト内で調査するためのハイスループットツールが提供されます。この方法(seqRNA-ISH+seqIF)は、1回の実行で最大12のRNAと24のタンパク質ターゲットを可能にし、追加のタンパク質ターゲットを連続実行 で 追加することができます。このプロトコルは1つの特定のマイクロ流体システムに焦点を当てていますが、提供されている組織ハンドリング、RNA品質保証、および抗体の選択と滴定のガイドラインは、他の方法論に適応できます。ただし、この方法は、pH 9.0抗原検索を使用して、プロテアーゼを含まない効率的なエピトープ検索を行い、プロテオミクスの安定性を向上させながら、プロテオミクスの安定性を向上させ、プロテアーゼを使用した従来のRNA-ISHとは異なり、プロテアーゼを使用してRNAプローブへのアクセス性を高めますが、プロテオーム8を保存できません。seqRNA-ISH+seqIF法を 図1に視覚的に概説し、一次抗体と二次抗体の穏やかな化学的除去を利用する一次抗体と二次抗体ペアリング法を利用する前に、RNA FISH増幅とそれに続く切断を示しています。seqIFと検出の逐次的な性質は、逐次方法論を利用することにより、蛍光色素の適合性に関連する多くの制限を克服します23。これにより、スペクトルのオーバーラップ23の補正を必要とするハイプレックス方法論での同時染色に必要な広範な最適化の必要性が軽減されます。

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プロトコル

このプロトコルは、一次細胞減少手術を受けた未治療の高悪性度漿液性卵巣癌患者から収集されたホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織切片を使用します。すべての臨床データは、テキサス大学 MD アンダーソン校の治験審査委員会によって承認されたプロトコルに基づいて、婦人科腫瘍学および生殖医学部門の卵巣がんリポジトリから取得されました。患者からの書面によるインフォームドコンセントはフロントデスクの担当者によって取得され、研究は認められた倫理ガイドラインに従って実施されました。

注:特に明記されていない限り、すべての試薬はヌクレアーゼフリーの脱イオン水で希釈されます。

1. サンプルの修正と埋め込み

注:固定剤と固定時間の選択は、アッセイの性能に強く影響し、一般に、空間アッセイは病理学的構造を維持するため、FFPEを使用して行われることがほとんどです。このプロトコルは、FFPE組織サンプルに対して次のプロトコルが提案されているため、FFPE組織の使用を概説しています。ただし、RNAの品質は、タンパク質エピトープと同様に固定プロセスの影響を受けますが、程度は低くなります。これらの固定方法、不完全な固定、およびサンプルの分解により、抗体ベースのプロテオミクスにおける非特異的結合が増加する可能性があります。第三に、構成型蛍光は通常、FFPE処理中に消光されますが、一部の蛍光色素は適度に持続するため、消光されていることを確認するためのテストが必要です。

  1. 組織を≤5mmの厚さに切片付けて、均一な固定を確保し、脂肪誘発性拡散障壁を防ぎます。すぐに切片を10%リン酸緩衝ホルマリン(pH 7.0)で4°Cで24時間固定し、RNAとタンパク質24を最適化します。
  2. ティッシュプロセッサーで固定組織を処理するか、次の手順を使用して手動で処理します
    1. ヌクレアーゼ遊離水(70%、75%、95%2x、100%3x)中の分子グレードエタノールで組織切片をそれぞれ1時間脱水します。
    2. 次に、組織をキシレンに2回、室温(~23°C)でそれぞれ1時間浸漬します。
  3. パラフィンワックスを60°Cに温めます。 ティッシュボックスをパラフィンワックスに2回、それぞれ1時間浸します。
  4. 膨らませた組織を型に入れ、組織を型に入れ、新鮮なパラフィンワックスを充填し、4°C25に急速に冷却します。
    注:RNAの最良の結果は、48時間以内にすべてのステップを完了することによって得られます。

2. RNA品質評価

  1. 3 つのシリアル セクションを使用し、3 つのスライドすべてを並行して実行するか、ターゲット パネルの前にコントロール スライドを実行して、ブロッキングが十分であることを確認します。ペアのポジティブコントロールプローブは、ハウスキーピング遺伝子を標的にして、組織全体の組織の質と空間的完全性を評価します。一般的に使用されるコントロールには、UBC(高発現遺伝子)、PPIB(中等度発現)、およびPOLR2A(低発現)26が含まれます。各検出チャネルでDab1(土壌細菌RNA)などのネガティブコントロールプローブセットを利用します。オプションで、すべてのポジティブおよびネガティブコントロールプローブをターゲットプローブと一緒に同じサンプルに含めます。このセットアップでは、Dab1ネガティブコントロールをチャンネルT2-T4に配置し、ポジティブコントロールを最低発現から最高発現までT1、T5、およびT9に割り当て、ターゲットプローブが残りのチャンネルを占めるようにします。
    オプション:さらに、RNA品質が不明なサンプルの場合、分布値200(DV200スコア)を決定すると役立つ場合があります。DV200 スコアが 30 を超えることを強く推奨し、50 以上の高品質のサンプルが27 を優先します。このスコアはRNAの品質の指標であり、サンプルの質が高いほど、RNA-ISHが効果的に機能する可能性が高くなります27。

3. RNAの注意事項と準備

注:RNaseフリーエリアを使用することに加えて、処理前にRNaseの領域を除染して拭き取り、作業領域に70%エタノールをスプレーすることがベストプラクティスであり、皮膚または呼気からのRNaseの侵入を最小限に抑えるために、常に清潔な手袋、白衣、およびマスクを着用してください。RNaseを含まない水と消耗品のみを使用し、供給袋に手を伸ばさないでください。これらの予防措置は、組織/スライドを涼しく乾燥した状態に保つことと同様に、実験中にRNAの完全性を維持するために不可欠です。

  1. ミクロトームで正に帯電したスライドガラスに切片を切断し、イメージング領域と協調するスライドの中央に関心領域を配置します(システムによって異なります、ここでは約12.5 mm x 12.5 mmです)。
    注:各セクションの理想的な厚さは、FFPE組織の場合4〜6μmであることに注意してください。
  2. FFPEスライドを乾燥したRNAseフリーオーブンで、組織を上に向けて60°Cで最低1時間、脂肪組織や剥離しやすい組織の場合は最大一晩焼成します。
  3. オプションの前処理
    注:前処理はオプションですが、以下に概説するように、特定の手順はさらにオプションです。
    1. 3%過酸化水素の調製:50 mLのコニカルチューブに、5 mLの30%過酸化水素を45 mLの1x PBSに加えます。残りの過酸化水素は室温(~23°C)で、蓋をパラフィルムで固定して最大3か月間保管します。
      注:過酸化水素は強力な酸化剤です。可燃物、熱源、金属から遠ざけてください。個人用保護具(PPE、ゴーグル、手袋、白衣など)を備えた化学ヒュームフードエリアで使用します。皮膚、目、吸入への接触を避けてください。露出した場合は、皮膚を水で15分間洗い流します。摂取または吸入した場合は医師の診察を受けてください。濃度が高いと重度の火傷を引き起こす可能性があり、有機物や特定の金属で発火または爆発する可能性があります。激しい反応を避けるために、常に過酸化水素を水に加えてください。
    2. 3.7%ホルムアルデヒドの調製:化学ヒュームフードに、1x PBS 3.3 mLあたり16%ホルムアルデヒド1 mLを加えます。パラフィルムで包まれたホルムアルデヒドを最長3か月間保管してください。
      注:ホルムアルデヒドは、深刻な眼の損傷、呼吸器の炎症を引き起こす可能性があり、癌を引き起こす疑いがあります。長時間または繰り返し曝露すると、皮膚感作やアレルギー反応を引き起こす可能性があります。化学ヒュームフードでのみ使用し、適切なPPE(手袋、ゴーグル/フェイスシールド、マスク、白衣など)を着用してください。皮膚への接触、アイコンタクト、吸入は避けてください。熱源や裸火から遠ざけてください。パラホルムアルデヒドや汚染物質は有害廃棄物として処分し、可能であればすぐに使用するのに必要な量だけを準備してください。
    3. 組織スライドを以下を含む50 mLの円錐形チューブに入れて洗浄することにより脱パラフィンします:キシレン(40 mL)を化学ヒュームフードでそれぞれ5分間3回洗浄します。
      オプション:キシレンの代わりに、非キシレンベースの組織学的透明化剤を使用できますが、パラフィンの残留物が残り、画質に影響を与える可能性があります。これには、スライスを以下を含む50 mLの円錐形チューブに入れることが含まれます:非キシレンベースの組織学的透明化剤(40 mL)をそれぞれ15分間で2回洗浄します。蜜蝋で作られたブロックのセクションは、非キシレンで脱ろうするのが難しい場合があります。未知のワックス/パラフィン混合物の場合は、正しい安全対策を講じてキシレンを使用することをお勧めします。キシレンは危険で可燃性の物質であり、長時間さらされると中枢神経系、肝臓、腎臓に損傷を与える可能性があります。化学ヒュームフード内でのみ使用し、PPE(手袋、マスク、白衣など)を着用してください。キシレンや汚染物質は有害廃棄物として処分してください。暴露した場合は、直ちに医師の診察を受けてください。
    4. 以下を含む50 mLの円錐形チューブに入れて、組織スライドを洗浄して再水和します:100%エタノール(40 mL)を2回、それぞれ3分間洗浄します。95%エタノール(40 mL)をそれぞれ3分で2回洗浄します。70%エタノール(40 mL)をそれぞれ3分間で2回洗浄します。50%エタノール(40 mL)、それぞれ3分で2回洗浄します。30%エタノール(40 mL)をそれぞれ3分間で2回洗浄します。1x PBS洗浄(40 mL)で2分間に1回洗浄します。
    5. ペルオキシダーゼは、室温(~23°C)の湿度チャンバーに入れ、約100〜200 μLの3%過酸化水素で組織を覆い、10分間で1回洗浄し、次に1x PBS洗浄(40 mL)で組織を洗浄し、それぞれ2分間2回洗浄します。
      注:ペルオキシダーゼブロッキングはオプションであり、組織内の残留ペルオキシダーゼ酵素を消光して非特異的染色を減少させ、組織の自家蛍光を減少させる可能性があります。これは、骨髄、腎臓、肝臓、肺、腸、脳などの自家蛍光の高い組織にとって特に重要であり、強いバックグラウンドシグナルがTRITC、FITC発光帯域28、29、30、31、32のイメージングを妨げる可能性があります。
    6. ホルムアルデヒド固定を行うには、組織を室温の湿度チャンバーに入れ、約100〜200 μLの3.7%ホルムアルデヒドで組織を覆い、10分間で1回洗浄し、次に1x PBS洗浄(40 mL)で組織を洗浄し、それぞれ2分間2回洗浄します。
      注:このステップはオプションですが、高脂肪組織またはスライドガラスへの付着に問題があるその他の組織に推奨されます。

4. 抗原回収

注:ここで推奨および概説されている脱ろうおよび抗原回収方法は、大容量の制御された熱抗原回収装置を利用するメーカーがseqRNA-ISH+ seqIFに推奨する方法とは異なります。

  1. マイクロ波を用いた熱誘発抗原検索(HEIR)
    1. 温度監視されたマイクロ波を使用して、該当する場合は、温度計の下のスライドホルダーのスライドを覆うのに十分な市販のpH 9.0 HEIR緩衝液(約250 mL)を追加します。
      注:RNAの抗原検索は通常、pH 6.0で行われますが、以下の方法は、抗体結合の効率を高めるためにpH 9.0用です。
  2. スライドを緩衝液に挿入して電子レンジに挿入し、該当する場合は空のチャンバーを二重蒸留水でバランスをとります。電子レンジで107°Cで15分間ヒートスライドします(HEIRバッファーが温度に達するまでの合計時間は通常30分です)。
  3. スライドを室温の化学ヒュームフードの下に置いて約20分間冷却します。
  4. スライドを50 mLコニカルチューブ(40 mL)で1x PBSで洗浄し、1回洗浄して2分間洗浄します。
  5. スライドをスクリューキャップスライドメーラーまたは1x PBS(または市販のマルチ染色バッファー)で満たされた50 mLコニカルチューブに保存し、すぐに続行するか、4°Cで最大7日間保存しますが、理想的には72時間未満で保存してからseqRNA-ISH+seqIFに進みます。

5. 原液を準備する

  1. 40x RNAイメージングバッファーの調製
    1. 400 mgの粉末RNAイメージングバッファーと25 mLのヌクレアーゼフリー脱イオン水を組み合わせて、40x RNAイメージングバッファーを調製します
    2. 得られた溶液を完全に溶解するまでボルテックスし、その後1.5 mLの微量遠心チューブ(チューブあたり1 mL)にアリコートします
    3. 凍結して-20°Cで最大3か月間保存し、凍結融解サイクルを避けます。
  2. 20x生理食塩水-クエン酸ナトリウム緩衝液(SSC)を調製します
    1. 157.3 gの塩化ナトリウム(NaCl)および88.2 gのクエン酸ナトリウム(Na3C6H5O7)を800 mLのヌクレアーゼフリー脱イオン水に溶解します。
    2. pHを測定し、1 M塩酸(HCl)でpH 7.0まで滴定します。
    3. オートクレーブで滅菌します。
      注:滅菌20x SSCは、別の会社から購入することもできます。開封後は室温4°Cで保存してください。
    4. 1 mLの20x SSCストックと4 mLのヌクレアーゼフリー脱イオン水を組み合わせて、4x SSCバッファーを調製します

6. 逐次RNA-ISH + 逐次免疫蛍光

注:ここに概説されているすべてのステップは、ほとんどの試薬がシステム互換性のある市販の試薬として識別されているため、 材料表に概説されているseqRNA-ISH+seqIFのメーカープロトコルから適応されています。これらの試薬は、メーカーによって識別および/または提供され、システムと互換性があるように設計されています。変更は可能であり、議論で概説されていますが、蓄積を防ぐために追加のテストと流体洗浄が必要になる場合があります。ソフトウェアは、パネルとプロトコルが設計および入力された後に必要な試薬の総量を計算します。ただし、推奨される変更が提示されます。総ボリュームは、プロトコルごとに使用されるサイクル数とターゲット数に基づいて常に異なります。ただし、抗体とRNA-ISHの希釈は、個々の組み合わせがデータベースに固有の項目として入力されない限り、システムによって計算されません。このプロトコルでは、サンプルスライドごとに400uLの抗体カクテルが必要です。

  1. システムの準備
    1. seqRNA-ISH+seqIFの前に、すべてのマイクロ流体をヌクレアーゼフリーの水で完全に洗い流します。
    2. システムの外にRNAse除染液をスプレーし、続いて70%エタノールをスプレーします。
  2. 一般試薬の調製
    1. 洗浄バッファー:20x システム互換、市販のマルチ染色バッファー 50 mL + ヌクレアーゼフリー脱イオン水 950 mL
    2. 水:ヌクレアーゼを含まない脱イオン水100mL。
    3. エタノール:70%エタノール100mL。
    4. イメージングバッファー:16 mLの10xシステム互換の市販のイメージング溶液+ 140 mLのヌクレアーゼフリー脱イオン水+ 4 mLのシステム互換の市販のイメージングストック。
    5. 溶出バッファー:システム互換、市販、溶出液1 + 8のシステム互換、市販、溶出液2
    6. クエンチングバッファー:ヌクレアーゼフリー脱イオン水130 mL + システム互換、市販の急冷液14 mL + システム互換、市販の急冷液16 mL
  3. RNA-ISHプロトコル用の染色試薬を調製する
    注:このステップは前夜に完了し、暗所で4°Cで保存できます。メーカーの推奨事項では、プールされたプローブは最長 1 年間使用できると記載されていますが、汚染の懸念から 1 週間以上前にプローブをプールすることはお勧めしません。プローブの場合は、軽くたたくかピペットで上下に混合し、使用前に軽く遠心分離してスピンダウンさせるのが最善です。
    1. システム互換の市販のプロテイナーゼフリー透過処理溶液を、システム互換の微量遠心チューブにスライドあたり500 μLでロードします。
    2. システム互換のマイクロ遠心チューブで、次のそれぞれごとにスライドあたり合計500 μLのサイクル(表1)に基づくRNA-ISHアンプをプールします:i)テールT1〜T4のZZテールツリー、ii)テールT5〜T8のZZテールツリー、iii)テールT9〜T12のZZテールツリー。
    3. システム互換の微量遠心チューブ内の次のそれぞれごとにスライドあたり合計500 μLのプールテールツリー特異的、増幅器マッチング、蛍光色素:i)ツリーT1〜T4の蛍光色素、ii)樹木T5〜T8の蛍光色素、iii)T9〜T12の蛍光色素。
      メモ:このステップは光に敏感です
    4. 1:200希釈液の市販DAPI(ストック濃度1 mg/mL)を、ヌクレアーゼフリーの脱イオン水で作った市販のマルチ染色バッファーで1 mLを調製します。
      注:手順は、標準試薬の一部としてDAPIを含むメーカーに従って実行されました。N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)で希釈したDAPIのカスタム製剤を使用する場合、希釈は異なる場合があり、滴定試験を実施する必要があります。ただし、1 mg/mL のストック濃度の 1:1000-1:2000 程度の濃度を使用することをお勧めします。通常、これは複数回のイメージングとストリッピングを経て持続する必要があるため、手動染色プロトコルよりも通常よりも高い濃度になります。DMF の DAPI 新たて製剤は、市販の DAPI 製剤よりも明るい傾向があります。DAPIなどのホルムアミドを含む試薬は、化学ヒュームフードの下に割り当てられます。ホルムアミドは生殖毒性や臓器損傷を引き起こす可能性があり、発がん性が疑われています。適切な PPE (手袋や白衣など) を利用します。
    5. 使用直前に、12.125ヌクレアーゼフリーの脱イオン水、1.5 mLの10xイメージングバッファーストックB、および275 μLの40xイメージングバッファーストックA(解凍または作りたて)を使用してRNA-ISHイメージングバッファーを調製します。
    6. 市販のマルチ染色バッファーで滴定試験された希釈液に従って、seqIF用に最大10対の一次抗体(一次タンパク質抗体の概要を表 2に示します)を、システム互換の微量遠心チューブでスライドあたり合計400 μL調製します。seqIFの各サイクルには、宿主種ごとに1つの一次抗体のみが含まれていることを確認します。
    7. ステップ6.3.7の一次抗体の組み合わせに従って、二次蛍光色素(表3)とDAPIを調製し、滴定試験済みの希釈液に従ってseqIFを行います。マルチ染色バッファーで、デッドボリュームが1 mL以上の50 mLコニカルチューブでサイクルあたり合計400 μLで希釈します。二次Alexa Fluor抗体およびDAPIの濃度例は、Alexa Fluor 555の1:200希釈、Alexa Fluor 647の1:400希釈、DAPIの1:1800希釈(DMF中の1 mg/mL DAPIから)
      注:このステップは光に敏感です。二次へのDAPIの追加は、seqIFの複数のサイクルを通じてDAPI発現を維持するのに役立ち、実行後の画像のアライメントに役立つため、メーカーのプロトコルに従っていません。このシステムに付属しているようなほとんどの画像処理ソフトウェアは、DAPI信号を利用して、蛍光共局在化のための周期イメージングのアライメントを確認します。
  4. システムの初期化
    1. ステップ6.3の各試薬を、システムで指定された順序でロードします。通常、順序は上記の通りですが、試薬がロードされている場所と一致していることを確認してください
    2. 抗原回収スライドをホルダーにロードし、スライドイメージングウィンドウがイメージングスペースの中央に揃っていることを確認してから、システム互換のマイクロ流体チップを上に配置して所定の位置にロックします。
      注:マイクロ流体チップは、ガスケットが無傷である限り、さらに1回まで適切に洗浄および保管されれば、seqIF滴定試験に再利用できます。マイクロ流体チップは、汚染の可能性があるため、RNAパネルを実行する場合、再利用できません。
    3. 1.35 mLの4x SSCと150 mLの市販の10x切断液を混合して、切断液を調製します。
      注:10x切断溶液は急速に酸化し、seqRNA-ISH+seqIF実験実行で使用する直前にのみ破壊する必要があるガラスアンプルに保存されます。

7. システム実行

  1. 製造元の指示に従ってシステムを実行し、20プレックスタンパク質seqIFを使用した12プレックスseqRNA-ISHでの2枚のスライドのおおよその実行時間は、12.5 cm x 12.5 cmのイメージングウィンドウで48時間です。
  2. seqRNA-ISH+seqIFの実行が完了したら、スライドを取り外して1x PBSに保存するか、すぐに追加のseqIF(最大40タンパク質)に利用できます。
    注:汚染の可能性を減らすために、各実行の前後にヌクレアーゼフリーの水を使用してシステムマイクロ流体を洗浄および洗い流すことが重要です。

8. オプション: 画像および統計分析

  1. 画像解析または病理解析ツール を使用して 、画像および統計解析を進めます。

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結果

この方法の例として、ヒト高悪性度漿液性卵巣癌の2枚のスライドで、以下のseqRNA-ISH(表1)+ SeqIF(表2 および 表3)を実行しました。

図2は、卵巣腫瘍組織のサンプル上のseqRNA-ISH+seqIFのオーバーレイを示しています。コラーゲン 1 などの構造タンパク質マーカーは腫瘍領域の同定に利用され、CD33、CD8、グランザイム B (GZMB) などの表現型および機能マーカーは、腫瘍免疫微小環境を理解するために不可欠な特定の免疫細胞の区別に役立ちます。RNAプローブは、ApoEやPDL1などの分子を標的にして、追加の洞察を提供し、RNA転写とタンパク質翻訳の比較を容易にし、GZMBの場合、タンパク質とRNAの両方を同じ組織に提示するため、がんの進行に大きな影響を与える可能性のある翻訳調節を特定する可能性があります33。

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ディスカッション

サンプルの調製と取り扱いにおける最も重要なステップは、RNAse汚染を減らすことです。これは、マスクを使用して呼気による汚染を防ぎ、RNase除染液とヌクレアーゼフリーの水で作られた70%エタノールで作業面を拭くことで実現できます。FFPEスライドの場合、seqRNA-ISH+seqIF用のFFPEブロックから隣接する複数のスライドを切り取り、乾燥剤とともに4°Cで保存するのが最善です。品質管理のために、組織ブロックのDV200のテストに加えて、RNAポジティブコントロールスライド(UBC、PPIB、POLR2A)およびネガティブコントロールスライド(DapB)を組織の隣接部分に実行することをお勧めします。サンプルとスライドを4°Cで保存すると、温度とともに増加するRNAの分解を防ぎ、乾燥剤は水溶性タンパク質の分解を減らすのに役立ちます。4°Cの乾燥剤は定期的に交換する必要があります。脂肪組織やスライドに付着しにくい組織の場合は、ベーキング時間を通常の最低1時間から一晩(12〜18時間)に増やします。このベーキング時間の延長により、スライドへの接着力が向上します。ただし...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、卵巣がん研究同盟(OCRA 811621および891490)、Sie財団、およびStephanie C. Stelter Endowment Fundから部分的に資金提供されました。この研究は、MD アンダーソンのがんセンター支援助成金 P30 CA016672 およびジャレッド バークスの NCI の研究スペシャリスト 1 R50 CA243707-01A1 を通じて国立衛生研究所によって部分的に支援されているフローサイトメトリーおよび細胞イメージング コア ファシリティと共同で実施されました。

また、技術支援とトレーニングを提供してくれた Lunaphore の Emily Martersteck にも感謝したいと思います。

著者らは、早期アクセスプログラムの一環として、Bio-TechneからRNAScopeの標的および対照プローブのセットを割引価格で受け取り、この研究で使用するためにいくつかの試薬が無料で提供されました。製造業者は、研究デザイン、データ収集と分析、または原稿の作成に何の役割も持っていませんでした。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)サーモフィッシャーサイエンティフィック/インビトロジェンEN62248 / 62248核染色用(本試験で使用した製品、62247は製造中止)
50mL円錐形滅菌ポリプロピレン遠心分離管サーモフィッシャーサイエンティフィック339652アリコートに使用 &混合二次溶液
70%滅菌イソプロパノールアルコールテックスワイプTX3270表面除染用
抗体諸諸プライマリターゲットに使用され、使用するチャネルによって異なります
APOE - ホスト:マウス、クローン:960318R&DMAB41443-100(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
aSMA - ホスト:マウス、クローン:1A4CST69319平方フィート(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
オートカットミクロトームライカ14051956472組織の切片化
CD10 - 宿主:ウサギ、クローン:E5P7SCST65534秒(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
CD11c - 宿主:ウサギ、クローン:D3V1ECST93233平方フィート(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
CD163 - 宿主:ウサギ、クローン:D6U1JCST93498秒(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
CD163 - 宿主:ウサギ、クローン:ja51-30インビトロゲンMA5-32684(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
CD20 - ホスト:マウス、クローン:L26ベチルA500-017ACF(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
CD31 - ホスト:マウス、クローン:3F8E2プロテインテック66065-2-IG(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
CD33 - 宿主:ウサギ、クローン:BLR061GベチルA700-061CF型(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
CD4 - 宿主:ウサギ、クローン:EPR6855アブカムAB181724(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
CD45 - 宿主:ウサギ、クローン:BL-178-12C7ベチルA700-012(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
CD45RO - ホスト:マウス、クローン:UCHL1ベチルA500-020ACF(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
CD56 - 宿主:ウサギ、クローン:BLR152Jベチル99746(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
CD66b - 宿主:ウサギ、クローン:BLR111HインビトロゲンMA5-44413(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
CD68 - 宿主:マウス、クローン:KP-1バイオレジェンド916104(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
CD8 - ホスト:マウス、クローン:C8/144Bバイオレジェンド372902(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
CD86 - 宿主:ウサギ、クローン:E2G8PCST76755平方フィート(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
列1A1 - 宿主:マウス、クローン:E3E1XCST66948秒(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
DNA LoBind チューブ 2mLエッペンドルフ22431048混合RNAプローブ溶液に使用
乾燥剤を示すドライアライト 21005コール・パーマー21005乾燥剤、乾燥剤
エッジライトミクロトームブレードサーモフィッシャーサイエンティフィック / Invitrogen4280L組織学 - サンプルを切片化するときに使用
エチルアルコール 100% (200 プルーフ)ファームコ111000200脱パラフィン用
EZ-AR2 エレガンスバッファーバイオジーンXHK547-XAK型FFPE組織切片の抗原検索に使用
FOXP3 - 宿主:ウサギ、クローン:ポリクローナルベチルA700-034CF型(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
ヤギ抗マウスIgG(H+L)Alexa Fluor 555サーモフィッシャーサイエンティフィック/インビトロジェンA-21425(注:この研究に固有のもの)F(ab')2-ヤギ抗マウス IgG (H+L) 交差吸着二次抗体、Alexa Fluor™555
ヤギ抗マウスIgG(H+L)Alexa Fluor 647サーモフィッシャーサイエンティフィック/インビトロジェンA-48289/A-21237(注:この研究に固有のもの)F(ab')2-ヤギ抗マウス IgG (H+L) 交差吸着二次抗体、Alexa Fluor™プラス 647
ヤギ用抗ウサギIgG(H+L)Alexa Fluor 555サーモフィッシャーサイエンティフィック/インビトロジェンA-21430(注:この研究に固有のもの)F(ab')2-ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) 交差吸着二次抗体、Alexa Fluor™555
ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) Alexa Fluor 647サーモフィッシャーサイエンティフィック/インビトロジェンA-21246(注:この研究に固有のもの)F(ab')2-ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) 交差吸着二次抗体、Alexa Fluor™647
GZMB - 宿主:ウサギ、クローン:ポリクローナルプロテインテック13588-1-AP型(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
Hs-POLR2A-T1ACDバイオテクネ310457-T1ヒト低発現プローブ
HS-PPIB-T5ACDバイオテクネ313907-T5ヒト中間発現プローブコントロール
HS-UBC-T9ACDバイオテクネ310047-T9ヒト高発現制御
過酸化水素溶液 30%シグマ・アルドリッチHX0640-5ティッシュ準備用。内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックし、色の高い製品を生成するのに役立ちます。3%過酸化水素溶液を作るには
Ker8/18 - 宿主:マウス、クローン:ポリクローナルプロテインテック66187-1-PBS(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
LRP5 - 宿主:ウサギ、クローン:HPA030505シグマHPA030505-100UL製(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
Lunaphore 20x マルチ染色バッファーバイオテクネBU06COMETの希釈剤および洗浄剤として使用
Lunaphore COMETチップバイオテクネMK03COMET装置用mcirofluidicsチップ
ルナフォア彗星バイオテクネCM10-SSeq-IFオート染色機
Lunaphore 溶出バッファーキットバイオテクネBU07-Lソリューション 1 &COMETの溶出ステップのソリューション2
Lunaphore イメージングバッファーキットバイオテクネBU09溶質&溶質COMETの実行中にイメージングに使用される溶媒
Lunaphore クエンチングバッファーバイオテクネBU08-Lソリューション 1 &COMETの焼入れステップのソリューション2
マイクロピペット諸該当なし試薬調製用
ペリオスチン - 宿主:マウス、クローン:1A11A3プロテインテック66491-1-PBS(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
Pierce 16% ホルムアルデヒド (w/v)、メタノールフリーサーモフィッシャーサイエンティフィック28908組織調製用の3.7%PFAを作るには
プローブ320102入力(T2チャネル)ACDバイオテクネ300040T2 の陰性対照 DapB
プローブ320102入力(T3チャネル)ACDバイオテクネ300040T3 の陰性対照 DapB
プローブ320102入力(T4チャネル)ACDバイオテクネ300040T4の陰性対照DapB
RNAscope HiPlex Cleaving ストック溶液バイオテクネ品番324399RNAScopeアッセイ中の切断用試薬
RNAscope HiPlex Pro for COMET 12-plex, 20-slide Kitバイオテクネ322075試薬 &RNAScope用バッファー
RNAscope HiPlexプローブ - Hs-APOE-T2ACDバイオテクネ433093-T2(注:この研究に固有のもの)早期アクセスRNAscope™HiPlex CSプローブ-Hs-APOE-T2
RNAscope HiPlexプローブ - Hs-ARG1-T4ACDバイオテクネ401581-T4(注:この研究に固有のもの)早期アクセスRNAscope™HiPlex CSプローブ-Hs-ARG1-T4
RNAscope HiPlexプローブ - Hs-CD274-T1ACDバイオテクネ600863-T1(注:この研究に固有のもの)早期アクセスRNAscope™HiPlex CSプローブ-Hs-CD274-T1
RNAscope HiPlexプローブ - Hs-CD40-T6ACDバイオテクネ445973-T6(注:この研究に固有のもの)早期アクセスRNAscope™HiPlex CSプローブ-Hs-CD40-T6
RNAscope HiPlexプローブ - Hs-CXCL1-01-T12ACDバイオテクネ1256473-T12(注:この研究に固有のもの)早期アクセスRNAscope™HiPlex CSプローブ - Hs-CXCL1-01-T12
RNAscope HiPlexプローブ - Hs-GZMB-T7ACDバイオテクネ468453-T7(注:この研究に固有のもの)早期アクセスRNAscope™HiPlex CSプローブ-Hs-GZMB-T7
RNAスコープ HiPlexプローブ - Hs-IFNG-T3ACDバイオテクネ310503-T3(注:この研究に固有のもの)早期アクセスRNAscope™HiPlex CSプローブ - Hs-IFNG-T3
RNAscope HiPlexプローブ - Hs-IL23a-T8ACDバイオテクネ562853-T8(注:この研究に固有のもの)早期アクセスRNAscope™HiPlex CSプローブ - Hs-IL23a-T8
RNAscope HiPlexプローブ - Hs-IL6-T9ACDバイオテクネ400883-T9(注:この研究に固有のもの)早期アクセスRNAscope™HiPlex CSプローブ - Hs-IL6-T9
RNAscope HiPlexプローブ - Hs-TNFa-T11ACDバイオテクネ310423-T11(注:この研究に固有のもの)早期アクセスRNAscope™HiPlex CSプローブ - Hs-TNFa-T11
RNAscope HiPlexプローブ - Hs-VEGFa-T5ACDバイオテクネ423163-T5(注:この研究に固有のもの)早期アクセスRNAscope™HiPlex CSプローブ-Hs-VEGFa-T5
RNAスコープ HiPlexプローブ - Hs-VISTA-T10ACDバイオテクネ491513-T10(注:この研究に固有のもの)早期アクセスRNAscope™HiPlex CSプローブ-HS-VISTA-T10
RNAscope HiPlex12 CS ネガティブコントロールプローブACDバイオテクネ324347メーカーが推奨するフル12プレックスネガティブコントロールパネル。T1-T12のDapB。
RNAscope HiPlex12 CS ポジティブコントロールプローブ-HsACDバイオテクネ324317メーカーが推奨するフル12プレックスヒトポジティブコントロールパネル。チャネルT1からT12の次のハウスキーピング遺伝子のHs-RTU:Polr2a、PPIB、UBC、HPRT1、TUBB、RPL28、RPL5、B2M、ACTB、LDHA-O1、RPLP0-X-RPLP0P2、GAPDH。
RNAseフリー水コーニング46-000センチすべての機器を洗浄および準備し、必要に応じて希釈剤として使用します
RNaseZap RNase除染液サーモフィッシャーサイエンティフィックAM9782RNaseを破壊する表面除染液
RNeasy FFPEキットキアゲン73504 &19093RNA抽出用&DV200測定
スライドメーラーインポートサイエンティフィックM9504MAスライドを液体バッファーに保管するため。
外科設計汎用工業用カミソリの刃サーモフィッシャーサイエンティフィック / Invitrogen13-812-236組織学 - サンプルを切片化するときに使用
TOX 1/2 - 宿主:ウサギ、クローン:E613QCST62886平方フィート(注:この研究に固有のもの)一次タンパク質抗体
キシレン組織学的グレードサーモフィッシャーサイエンティフィックUN1307脱パラフィン用

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