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方法論記事

デュアルモダリティ分子地図作成:マルチプレックスmRNA検出とタンパク質イメージングマスサイトメトリーの統合

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DOI:

10.3791/68616

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2025年11月14日

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1Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Hematopoietic Biology & Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

この記事について

サマリー

このプロトコルは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片におけるタンパク質イメージングマスサイトメトリーによるマルチプレックスmRNA検出の方法論を詳述しています。

要約

同じアッセイでタンパク質とmRNAを検出する機能は、細胞が到着に向けてどのように準備されているか、そして細胞が置かれている環境を移動して相互作用するときにどのような手がかりを受け取るかを理解するのに役立ちます。高プレックスイメージングにより、空間的に分解されたmRNA(空間トランスクリプトミクス)とタンパク質(空間プロテオミクス)の特性評価が同時に可能になりました。冗長性を避けるために、これらの分析種は単一の組織切片で分析できます。多くのタンパク質と少数のmRNAまたはその逆を可能にする技術は数多くありますが、中心作用分析種はタンパク質であるため、この原稿は、金属プローブを利用したタンパク質イメージングマスサイトメトリー(IMC)とmRNA in situ ハイブリダイゼーション(ISH)の統合に焦点を当てています。これにより、細胞が微小環境で通信する際に、どのようなメッセージをプライミングしているのか、または世界に急速に送信しているのかを理解することができます。また、通常、抗体のみを使用して定量化および視覚化することが困難な分泌タンパク質や困難なマーカーの検出に関連する制限も克服します。また、このプロトコルは、金属プローブベースの検出システムには蛍光スペクトルのスピルオーバーがなく、組織特異的な自家蛍光の考慮事項もないため、高プレックス蛍光ベースの方法で見られる補償または後処理の必要性を最小限に抑えます。

概要

がんは、さまざまな患者において構造的および機能的多様性を示します。正常細胞と悪性細胞で構成される腫瘍微小環境 (TME) は、患者間で不均一です。転移は、原発腫瘍からの残基が細胞クラスターおよび単一細胞として血流に逃げることに起因し、疾患の進行と治療反応に関する手がかりを提供します1,2。これらの微小環境の複雑さを理解する必要があります1.腫瘍は豊富な細胞型で構成されていますが、臨床基準は組織学的に単一のマーカーに基づいており、変化し始めています 1,2。多重イメージング技術は、病理学に新たな方向性をもたらしました。ヒトがんの空間的に分解されたプロテオミクス、ゲノミクス、メタボロミクス、およびリピドミクスは、単一細胞分解能またはそれに近い単一細胞分解能で可能になりました3,4,5,6。

これらの技術は、腫瘍内の不均一な細胞位置と相互作用を分析できます。適切なシングルセルバイオイメージング手法を利用することで、患者の生検における多くの疾患関連タンパク質バイオマーカーのプロファイルを生成し、がん治療の設計に情報を提供することができます。空間細胞マップからの洞察は、オフターゲット、耐性、再発を減少させたがんを効率的に排除できる併用療法の選択を導くことができます1。問題となっているのは、通常、組織の同じ部分で調和して機能しないこれらの多くの多様な技術を組合化する能力です7。図1に視覚的に概説されているこのプロトコルは、同じ組織切片および同じ細胞内のプロテオミクスとmRNAの標的サブセットの両方を、同時に蛍光タンパク質+RNA-ISHで可能なものよりも高い倍数で同時に空間的に調べる機会を提供します8。これは、データの分析をデコンボリュート化することを目的として、並列分析3,4,6のブリッジとしても機能することができる。二重検出が存在する一方で、mRNA産生が急速に開始されたが、直接標識された一次抗体法に固有の感度が限られており、シグナル増幅が欠如しているため、分泌されたタンパク質が検出できないままであり、分泌された分子の検出が特に困難になっている細胞を調べることもできます。以下のプロトコルは、12プレックス蛍光/発色検出から適応され、IMCでの同時検出のためのチオール還元修飾プローブを介した金属ベースの検出に適用できます。

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プロトコル

このプロトコルは、高悪性度漿液性卵巣癌の一次細胞減少手術を受ける未治療の患者から収集されたホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織を使用します。すべての臨床データは、テキサス大学 MD アンダーソン校の治験審査委員会によって承認されたプロトコルに基づいて、婦人科腫瘍学および生殖医学部門のリポジトリから取得されました。患者から書面によるインフォームドコンセントが得られ、研究は認められた倫理ガイドラインに従って実施されました。

1. 注意事項と準備

  1. ヌクレアーゼフリー水(NFW)を常に利用して、必要な試薬をすべて調製してください。
  2. ガラスへの金属結合や金属汚染を減らすために、ガラスを使用せずにプラスチック容器を使用してすべての手順を実行します。
  3. 作業エリアを非常に清潔に保ち、表面とピペットにRNase除染液をスプレーし、続いてNFWで調製した70%エタノールをスプレーします。
  4. Schulzら7によって説明されているように、チオール化mRNA検出プローブ(T1-T12)をマレミドリンカーを介して適切な金属に結合させ、材料表の protocol.io でさらに詳しく説明します。
    注:タンパク質標的は、組織内の細胞の位置(構造マーカー)を示し、どの細胞が存在するか(表現型マーカー)、および細胞が何をしているか(機能マーカー)を特定するために選択する必要があります。一部の機能マーカーは一過性に発現するため、mRNA標的を含めることで、これらの標的を生成する細胞の同定が可能になります。

2. サンプルの前処理と前処理

  1. 組織切片を60°Cの乾燥オーブンで一晩焼きます。
  2. 脱パラフィン化を行う:キシレンを各ラウンド5分間3回、再水和(100%エタノール(EtOH)×2、95%EtOH×2、70%EtOH×2、50%EtOH×2、30%EtOH×2)を各ラウンド3分間行います。1xトリス緩衝生理食塩水(TBS)で2分間、1回洗浄します。同時に処理されるサンプルの数に応じて、50 mLのコニカルチューブ(最大2スライド)または350 mLのIHC染色カセット(最大24スライド)を使用します。
    注:この脱ろうステップは推奨されていますが、オプションであり、組織の種類によって異なります。
  3. 組織スライドを組織切片を覆うのに十分なPFA溶液とともに50 mLチューブでインキュベートすることにより、3.7%パラホルムアルデヒド(PFA)の溶液を10分間塗布します。
  4. マイクロ波を使用した熱誘発抗原検索(HEIR):温度監視マイクロ波を使用して、1つのトレイにpH 6 HEIR抗原検索バッファー(350 mL)を充填し、残りのトレイにNFWを充填します。組織切片を顕微鏡スライド用の染色ラックに入れ、抗原回収バッファーを入れたトレイに追加します。
    注:抗原回収を行うときは、使用前に抗原回収バッファーが室温(RT)にあることを確認してください。
  5. 107°Cで15分間抗原回収を行い、次に組織スライドをケミカルフード内でRTで20分間冷却します。
  6. 抗原回収中は、加湿紙を水ですすぎ、湿度制御スライド染色トレイに入れ、トレイを60°Cのハイブリダイゼーションオーブンに入れます。
  7. スライドをRNaseフリーのTBSで3分間すすぎ、次にスライドを3分間乾燥させます。

3.プロテアーゼ処理

  1. 疎水性バリアペンで各組織切片の周囲に疎水性バリアを描きます。バリアを約2分間完全に乾かします。
  2. スイングクランプを開いて、乾いたスライドを湿度トレイのスライドホルダーにロードします。
  3. 組織切片を完全に覆うのに十分なプロテアーゼ滴を追加します。予熱した湿度制御トレイ(60°C、ステップ2.6)をハイブリダイゼーションオーブンから取り出し、スライドホルダーを湿度制御トレイに挿入します。湿度制御トレイを再密封し、ハイブリダイゼーションオーブンに戻します。40°Cで30分間インキュベートします。
  4. このインキュベーション中に、RNA-ISHアッセイ材料を調製します。
    1. 50xストックをNFWで希釈することにより、500 mLの1x RNA-ISH洗浄バッファーを調製します。RTで最大1か月保存できます。
      注:50x洗浄バッファーに沈殿が発生した場合は、1x洗浄バッファーを調製する前に、バッファーを40°Cに10〜20分間加熱して再懸濁します。
  5. 1 LのDPBS-Tに5 mLのトゥイーンを加えることにより、NFWで1 LのDTBS-T(0.5%トゥイーン)を調製します。
  6. RNA-ISH ZZ対ターゲットプローブを準備します。
    1. mRNAプローブストックとRNA-ISH希釈液を40°Cでドライオーブンで10分間温めます。プローブをボルテックスし、卓上ミニ遠心分離機で回転させます。
    2. ストック50xプローブをRNA-ISH希釈液で希釈して、1xミックス(最大12プローブ、 表1)を調製し、組織切片全体を覆うのに十分な最終容量があることを確認します。
    3. よくボルテックスし、混合プローブとRNA-ISH希釈液を使用までRTで放置します。
  7. ハイブリダイゼーションオーブンから湿度制御トレイを取り外し、スライドホルダーを取り外します。トレイをオーブンに戻します。
  8. スライドをNFWで事前に洗浄した透明なスライドホルダーに入れます。スライドをNFWで5分間少し撹拌しながら洗浄します。
  9. 新鮮なNFWで洗浄ステップを5分間繰り返します。

4. ターゲットプローブハイブリダイゼーション

  1. スライドから余分な液体を取り除きます。湿度調節トレイをオーブンから取り外し、スライドホルダーをトレイに入れます。
  2. 各組織切片を完全に覆うのに十分な量の適切なプローブミックスを追加します。トレイを閉じて、40°Cで2時間オーブンに挿入します。
  3. RNA-ISHアンプ1(テールT1からT4のZZテールツリー)試薬をインキュベーション終了の30分前にRTで平衡化し、ステップ5.2で使用します。
  4. インキュベーションが完了したら、ハイブリダイゼーションオーブンから湿度制御トレイを取り外し、スライドホルダーを取り外します。トレイをオーブンに戻します。
  5. スライドをNFWで事前に洗浄した透明なスライドホルダーに入れます。スライドを1x洗浄バッファーで2分間わずかに攪拌しながら洗浄します。
  6. 新鮮な1x洗浄バッファーでRTで2分間洗浄ステップを繰り返します。

5. RNA-ISHアンプのハイブリダイズ1

  1. スライドから余分な液体を取り除き、スライドを湿度トレイのスライドホルダーに入れます。スライドホルダーを湿度コントロールトレイに挿入します。
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 1 を追加して、各セクションを完全にカバーします。トレイを閉じ、ハイブリダイゼーションオーブンに40°Cで30分間挿入します。 RNA-ISH Amplifier 2 (テール T5 から T8 の ZZ テールツリー) 試薬を RT に置き、ステップ 6.2 で使用します。
  3. ハイブリダイゼーションオーブンから湿度制御トレイを取り外し、スライドホルダーを取り外します。トレイをオーブンに戻します。
  4. スライドをNFWで事前に洗浄した透明なスライドホルダーに入れます。スライドを1x洗浄バッファーで2分間わずかに攪拌しながら洗浄します。
  5. 新鮮な1x洗浄バッファーでRTで2分間洗浄ステップを繰り返します。

6. RNA-ISHアンプ2をハイブリダイズする

  1. スライドから余分な液体を取り除きます。湿度調節トレイをオーブンから取り外し、スライドホルダーをトレイに入れます
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 2 を追加して、各セクションをカバーします。トレイを閉じ、ハイブリダイゼーションオーブンに40°Cで30分間挿入します。
  3. 手順7.2で使用するために、RNA-ISHアンプ3(テールT9〜T12のZZテールツリー)試薬をRTに置きます。スライドホルダーをトレイから取り外します。トレイをオーブンに戻します。
  4. スライドをNFWで事前に洗浄した透明なスライドホルダーに入れます。スライドを1x洗浄バッファーで2分間わずかに攪拌しながら洗浄します。
  5. 新鮮な1x洗浄バッファーでRTで2分間洗浄ステップを繰り返します。

7. RNA-ISHアンプ3をハイブリダイズする

  1. スライドから余分な液体を取り除きます。湿度調節トレイをオーブンから取り外し、スライドホルダーをトレイに入れます
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 3 を追加して、各セクションを完全にカバーします。トレイを閉じ、ハイブリダイゼーションオーブンに40°Cで30分間挿入します。
  3. インキュベーション中に、ステップ8用のメタルオリゴミックスを準備します。各オリゴは1:15の濃度で使用されます(10uMストックから、組織切片全体を覆うのに十分な最終容量があることを確認してください)。よくボルテックスし、混合金属オリゴを使用までRTに残します。湿度調節トレイをオーブンから取り出し、スライドホルダーをトレイから取り外します。その後、トレイをオーブンに戻します
  4. スライドをNFWで事前に洗浄した透明なスライドホルダーに入れます。スライドを1x洗浄バッファーで2分間わずかに攪拌しながら洗浄します。
  5. 新鮮な1x洗浄バッファーでRTで2分間洗浄ステップを繰り返します。

8. 金属オリゴをハイブリダイズする

  1. スライドから余分な液体を取り除きます。湿度調節トレイをオーブンから取り外し、スライドホルダーをトレイに入れます。ステップ7.3で調製した混合金属オリゴ(使用前のボルテックス)を加える。
  2. トレイを閉じ、ハイブリダイゼーションオーブンに40°Cで45分間挿入します。
  3. ハイブリダイゼーションオーブンから湿度制御トレイを取り外し、スライドホルダーを取り外します。トレイをオーブンに戻します。
  4. スライドをNFWで事前に洗浄した透明なスライドホルダーに入れます。スライドを1x洗浄バッファーで2分間わずかに攪拌しながら洗浄します。
  5. 新鮮な1x洗浄バッファーでRTで2分間洗浄ステップを繰り返します。

9. 金属結合抗体

  1. 非特異的部位をブロックするには、組織切片全体を覆うのに十分な量のブロッキングバッファーを塗布し、RTで30分間インキュベートします。
  2. インキュベーション中に、抗体(表1)を抗体希釈バッファーで希釈することにより、ステップ10.1で使用する抗体ミックスを調製します。

10. 金属結合抗体とのインキュベーション

  1. ブロッキングバッファーのインキュベーション後、組織スライドからブロッキングバッファーを廃棄し、組織切片全体を覆うのに十分な量のAbミックス(ステップ9.2から)を分注します。
  2. スライドを湿度チャンバーに入れ、4°Cで一晩(~16時間)インキュベートします。

11. DNA染色

  1. 新しいIr-Intercalator溶液を調製します。
    1. 500 μMのストック溶液から、RNaseフリーのTBSで1:2000の作業溶液を調製します。作業溶液を分注して-20°Cで保存できます(凍結融解しないでください)。
  2. スライドをNFWで事前に洗浄した透明なスライドホルダーに入れます。スライドをTBS-Tバッファーで5分間わずかに攪拌しながら洗浄します。
  3. TBS-Tで洗濯を繰り返します。
  4. Ir 作業溶液 (ステップ 11.1.1 から) で RT で 5 分間スライドを染色します。
  5. スライドをNFWで事前に洗浄した透明なスライドホルダーに入れます。スライドをTBS-Tバッファーで5分間わずかに攪拌しながら洗浄します。
  6. TBS-Tで洗濯を繰り返します。
  7. TBSで5分間2回洗浄します(ゆっくりとかき混ぜます)。
  8. スライドをddH2Oに素早く浸して、組織上のTBSに存在する塩の結晶化を防ぎます。
  9. スライドをケミカルフードの下で乾燥させ(10分)、画像取得まで4°Cで保存します。

12. 画像取得

  1. スライドをIMCのアブレーションチャンバーにロードします。
  2. パノラマ画像をキャプチャして、関心領域(ROI)を特定します。
  3. 画像取得ソフトウェアでROIをマッピングします。
  4. 獲得テンプレートを適用します。
  5. サンプルの種類に基づいてレーザー出力(アブレーションエネルギー)を調整します。デフォルトは 0 dB に設定されています。
    注:複数の小さな組織領域(30 μm x 30 μm)でアブレーションエネルギーをテストし、毎回1 dBずつパワーを上げることをお勧めします。スライドに焼け込むことなく試料をクリアする最低のアブレーションエネルギーを選択してください。通常、これによりレーザー出力は3〜4dBになります。場合によっては、組織が推奨よりも厚い場合、レーザー出力が 5 dB に増加します。
  6. レーザーアブレーションを開始します。このシステムはレーザーを ROI に向け、金属タグ付きタンパク質をアブレーションし、エアロゾル プルームを生成し、誘導結合プラズマ (ICP) トーチに転送され、そこでプルームがプラズマ中で気化、霧化、イオン化されます。
  7. 検出器で測定され、データに変換される各同位体の量を測定します。

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結果

同じアッセイでタンパク質とmRNAを検出する機能は、細胞が到着に向けてどのように準備されているかを理解するだけでなく、移動して環境と相互作用するときにどのようなキューを受け取っているかを理解するのに役立ちます。代表的なデータに見られるように、mRNAとタンパク質の検出は、標識、検出器、および/またはイメージングステップの進行方法に基づいて検出の下限が非常に困難になる可能性があるため、空間生物学研究において重要な要素です。プロテアーゼを含めるだけで、組み合わせたプロトコルで重要なマーカーが複雑になる可能性があるため、冗長性は検証だけでなく明確になります。

このプロトコルは、28の金属結合抗体と12のmRNAプローブからなるアッセイを提示する(表1)。 図2に見られるように、CD8 T細胞の活性化状態はさまざまであり、異なるマーカーの組み合わせによって評価できます。これらの組み合わせを利用して、さまざまなレベルの活性化を持つさ...

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ディスカッション

マルチプレックスマルチオミクスは、収集されたデータにおける重要な進化であり、疾患の進行と治療に影響を与える細胞間および細胞間および細胞間相互作用を標的としています。多くのタンパク質標的が一過性に発現するか、mRNAとタンパク質発現レベルが異なるため、同じサンプル、したがって同じ細胞でこのデータを分析することは重要であり、したがって、タンパク質と組み合わせた標的mRNA検出をもたらすことで、検出が困難または差次的に発現する標的の調節が可能になります21。RNA-ISH技術とIMCの統合における最近の進歩により、同じ組織スライド22、23、24、25上にマルチオミクスが統合され、トランスクリプトミクスとプロテオミクスの両方を単一細胞分解能で直接統合できるようになりました。<...

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開示事項

Jared K. Burks は、Standard BioTools のコンサルタントです。

謝辞

この研究は、MD アンダーソンのがんセンター支援助成金 P30 CA016672を通じて国立衛生研究所によって部分的に支援されているフローサイトメトリーおよび細胞イメージング コア ファシリティと共同で実施されました。この研究は、MD アンダーソンがんセンターの支援助成金開発賞、RNAscope、P30CA016672、NIH/NCI、PI を介した マスサイトメトリー空間トランスクリプトミクスのイメージング メータメトリー スペース トランスクリプトミクス - Pisters によっても部分的に支援されました。JKBの取り組みは、P30 CA016672とNCIリサーチスペシャリスト1 R50 CA243707-01A1によって部分的に支援されました。SFBの取り組みは、卵巣がん研究同盟(OCRA 811621および891490)、ティナ・ブロズマン卵巣がん研究名誉財団、MDACC卵巣がん胞子発生研究プログラム、NIH 1R01CA261952-01A1によって部分的に支援されました。SFB、JKB、BGの取り組みは、1U01CA294459-01助成金によって部分的に支援されました。著者らは、使用されたサンプルを切片化して提供したSamuel Mok氏に感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
 https://www.protocols.io/view/oligonucleotide-polymer-conjugation-for-imaging-ma-dm6gpjz91gzp/v2。Protocols.IOdx.doi.org/10.17504/protocols.io.dm6gpjz91gzp/v2画像化質量細胞計検査V.2 のためのオリゴヌクレオチド-ポリマー共役;
10倍TBSRNAseフリーサーモ・フィッシャー・サイエンティフィック J62780。K7ステップ間の断続的な洗いのために
ACD HybEZ II ハイブリダイゼーションシステムACDバイオテクネ321711ベーキングティッシュスライド用のオーブン
抗体希釈剤ダコS0809 抗体希釈緩衝剤
抗体:B7-H3ベチルA700-025CF、A700-026CFクローン:BLR025F、BLR026F
抗体:B7-H4サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック 14-5949-82クローン:H74
抗体:BRD4(6F11)ベチルA700-005CFクローン:BL-151-6F11
抗体:CCR6R&DMAB195-100クローン:53103
抗体:CD11bアブカム AB209970クローン:EPR1344
抗体:CD25アブカム ab215378クローン:EPR6452
抗体:CD278/ICOSCST 89601BFクローン:D1K2T
抗体:CD31アブカム AB207090クローン:EPR3094
抗体:CD33アブカム AB238784クローン:SP266
抗体:CD3e CST85061BFクローン:D7A6E
抗体:CD4アブカムab181724クローン:EPR6855
抗体:CD44サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック MA1-10225クローン:IM7
抗体:CD45サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック 14-9457-82クローン:CD45-2B11
抗体:CD8aCST 85336BFクローン:D8A8Y
抗体:CXCL13R&DAF801クローン:ポリクローン
抗体:CXCR5R&DMAB190-100クローン:CXCR5
抗体:ガンマH2AXベチルA700-053CFクローン:BLR053F
抗体:グランザイムBサンタクルーズSC-8022 Xクローン:2C5
抗体:KAP1ベチルA700-014CFクローン:BL-248-2G6
抗体:Ki67ベチルA700-021CFクローン:BLR021E
抗体:LCK CST2984BFクローン:D88
抗体:MFAP5該当なし該当なしPMID:31332047 / クローン:130A (注:カスタムデザイン) 
抗体:SMACST56856BFクローン:1A4
抗体:VEGFSTB-フルイドディグム3163028Dクローン:G153-494
抗体:VISTACST64953BFクローン:D1L2G
AZ-AR1 エレガンス・シトラ バイオジェネックスHK546-XAK抗原回収バッファー
エチルアルコール 100%(200プルーフ)ファームコ111000200脱硫黄化のために
EZ & ndash;リトリーバーIRバイオジェネックスMW016-IRFFPE組織切片用の抗原回収システム
HybEZ II ハイブリダイゼーションシステムACDバイオテクネ321710システムは、HybEZオーブン(PN 321710/321720)、湿度管理トレイ(PN 310012)、HybEZ加湿用紙(PN 310025 2枚)、EZ-バッチ洗濯トレイ(PN 321717)、EZ-Batchスライドホルダー(PN 321716)で構成されています。
ImmEdge疎水性バリアPAPペン ベクターラボH-4000疎水性バリアペン
赤外線インターカレーターソリューションサーモ・フィッシャー・サイエンティフィック NC1038184核化細胞の同定に使用
ケラチン 8/18CST 4546BFクローン:C51
メタル・オリゴ様々な様々な金属タグは、必要に応じてT1からT12まであります
ヌクレアーゼフリー水(NFW)コーニング 46-000-CM すべての機器を清掃・準備し、必要に応じて希釈剤として使用すること
RNAscopeプロテアーゼプラス ACDバイオテクネ322331 サンプルの細胞膜を透過させるために使用
RNAscope EZ-バッチスライドホルダーACDバイオテクネ310017最大20枚のスライドを手動でバッチ処理するよう設計されています
RNAscope HiPlex12 試薬キット v2 ACDバイオテクネ324409RNAScope用試薬
RNAscope HiPlexプローブ - ターゲットプローブACDバイオテクネ様々な必要なものによってT1からT12の範囲です
RNaseZap RNase 除染溶液サーモフィッシャー・サイエンティフィックAM9782RNaseを破壊する表面除染溶液
ステインラック 顕微鏡スライドバスケットホルダー 24箇所 耐化学プラスチック最適科学3028複数のスライドを染色するために
トゥイーン20サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック AAJ20605APステップ間の断続的な洗いのために
超音波プロテインブロックサーモ・フィッシャー・サイエンティフィック TA125PBQブロッキングバッファ

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