このプロトコルは、マイクロRNAおよびマルチプレックスタンパク質を同時に検出および定量するためのホルマリン固定パラフィン包埋組織を用いたタンデム免疫蛍光ハイブリダイゼーションアッセイを記述している。
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この記事について
サマリー
要約
従来のプローブベースの in situ ハイブリダイゼーション(ISH)イメージング検出法を使用する場合、マイクロRNA(miRNA)は19〜25ヌクレオチドの範囲のサイズのため、捕捉が困難です。しかし、miRNAは正常な生理機能や多くの病態に寄与する重要なエピジェネティックな調節因子であるため、細胞レベルおよび細胞内レベルでのmiRNAの機能を解明するには、miRNAの時空間的挙動を理解することが重要です。このため、適切な検出および視覚化技術が明らかに必要とされています。そこで、マルチプレックス免疫蛍光染色を利用して開発・最適化したLocked-nucleic-acid in situ hybridizatioN(MARLIN)と、miRNAを標的としたロック核酸(LNA)プローブによるMicroRNA Amplification and Recognition を作成しました。この方法は、多重タンパク質発現を伴うmiRNAを定量することができ、腫瘍微小環境(TME)内の細胞内および細胞外miRNAを高い感度と再現性で定量することができます。miRNA検出とタンパク質捕捉アッセイを組み合わせて使用することで、そのTME内の細胞機能と調節メカニズムを包括的に理解することもできます。
概要
マイクロRNA
マイクロRNA(miRNA)は信じられないほど小さく、長さは19〜25ヌクレオチドの範囲ですが、これらの一本鎖RNA分子は遺伝子発現の強力な調節因子であり、配列特異的相互作用を介して転写後にメッセンジャーRNA(mRNA)を調節します1。本質的に、miRNA は標的 mRNA に結合することで負の調節因子として作用し、相補性の程度に応じて、それらの翻訳を妨げたり、mRNA 切断を通じて分解を促進したりし、最終的には標的遺伝子からのタンパク質出力の減少につながります。miRNAは基本的にノンコーディングRNAですが、すべてのmiRNAの約40%は、タンパク質をコードする遺伝子のイントロンまたはエクソン内に依然として存在しています2。miRNA の機能的目的には、細胞増殖、血管新生、アポトーシスなど、いくつかの重要な生物学的プロセスが含まれます。特に、特定の miRNA の異常な発現と miRNA を介した遺伝子調節が複数のがんタイプの発癌性形質転換と関連しているため、miRNA の調節不全は腫瘍形成に関与しています3。
miRNAは発見以来、その組織特異的な発現と調節機能により、さまざまな疾患で広く研究されており、その調節不全は神経変性疾患、自己免疫疾患、さまざまな癌を含む多くの疾患に関連しています4,5,6。miRNAの発現パターンは、がんの種類、病期、臨床変数と相関させることができるため、miRNAプロファイリングはがんの診断と予後のための貴重なツールとなります4,5,6,7。新しいmiRNAの発見は、ハイスループットシーケンシング技術の進歩によっても加速され、多様な生物学的プロセスにおけるmiRNAの関与の理解が深まっています8。miRNA の重要性は、転写後調節における miRNA の機能を発見した2024 年のビクター・アンブロス氏とゲイリー・ルブクン氏に授与された 9 年のノーベル医学賞によって強調されました。
疾患の診断と予後のための貴重なバイオマーカーとして、miRNA の治療の可能性が探求され、miRNA 標的薬の開発につながりました。がん治療における miRNA の治療の可能性は、遺伝子のモジュールを協調的に調節し、正常な細胞機能を回復させる可能性がある能力にあります10。これまで、miRNAベースの抗がん療法は、治療反応を高め、治癒率を高めるために、単剤療法または既存の標的療法と組み合わせて開発されてきました11。miRNA の動的スペクトルにより、miRNA は革新的ながん治療戦略に不可欠なリソースとして位置づけられています。治療抵抗性の文脈では、miRNA を標的とすることは、従来のがん治療に対する再発と耐性を軽減する可能性を示しており、がん細胞を標的とすることで患者の生存率を改善する可能性があります12。腫瘍微小環境 (TME) におけるさまざまな細胞型の活性を調節する miRNA の役割を調査することで、ユニークで臨床的に関連するがん治療法が発見される可能性があります。
miRNAを検出するための利用可能なアッセイ
現在、miRNA測定の最も一般的な方法は、定量的リアルタイムPCR(q-RT-PCR)または次世代シーケンシング(NGS)のために抽出されたRNAに依存しており、空間的コンテキストが失われています。cDNA合成に標的特異的ステムループプライマーを使用するTaqManマイクロRNAアッセイや、ユニバーサルcDNA合成を備えたSYBR Green色素ベースのケミストリーを提供する企業があります。これらのアッセイは高い感度と特異性を提供し、さまざまなq-RT-PCR装置で実行できます。残念ながら、TaqManアッセイでは絶対的な定量化ができないため、偽陽性や結果のばらつきなどの問題が発生する可能性があります13。また、感度が高いにもかかわらず、さまざまなサンプルタイプへのこれらのアッセイの適用は、広範なサンプル前処理の必要性と、サンプル中の他の成分からの潜在的な干渉によって制限される可能性があります。
次世代シーケンシング(NGS):miRNA-seqは、生体液のmiRNome全体にわたる差次的発現解析にますます人気が高まっています。miRNA-seqのようなNGS技術の利点は、miRNAのゲノム全体の発現の大規模な並列解析を可能にし、個々のmiRNAの定量化、配列変異の同定、および新規miRNAの発見を可能にすることです14。IlluminaTruSeq Small RNA Sample Preparation Kitなどのシーケンシングベースの方法の大きな欠点は、miRNAの相同性とリード長の短さが大きいため、定量的バイアスが誘発され、差次発現解析の精度に影響を与えることです14。それだけでなく、isomiR(標準的なmiRNA配列とは配列または長さが異なる変異体)および技術的なアーティファクトの存在は、データの解釈を複雑にし、バイオマーカーアッセイにおける誤検出や交絡因子につながる可能性があります14。また、sRNAbenchやmiRDeep2などのmiRNA-seqデータ解析のためのさまざまなツールは、さまざまな結果をもたらす可能性があり、新規miRNA発見の一貫性と信頼性に影響を与えます15,16。マイクロアレイ技術のようなものでさえ、ほとんどの場合不十分です。miRNAまたは遺伝子発現レベルを検出するための強力でハイスループットなプラットフォームを提供できるため、ゲノム全体の研究に適していますが、この技術は依然として以前に同定されたmiRNAの数によって制限されており、miRNAと標的の相互作用を直接検証できないため、機能研究における有用性が制限されます17。
これらすべての利用可能なオプションを比較する際にここで強調できる最も重要な要素は、空間コンテキストの欠如です。それらは、細胞内の組織形態または時空間分布に関連するコンテキストを提供しません。miRNAの時空間挙動を可視化することは、細胞レベルや細胞内レベルでmiRNAの機能を解明するために必要です。現在、miRNAscope in situ ハイブリダイゼーション (ISH) アッセイは、通常は発色検出法を利用して利用できます。これらのアッセイでは、単一細胞分解能でmiRNAを可視化できますが、結果の品質に欠けており、miRNAの発現とサンプルのバックグラウンドを区別することが困難です。一般に、これらの多くは低品質のアッセイを生成し、信頼性が低く、通常は手動定量が必要です。
そこで、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織内で、多重免疫蛍光染色(オパールタンパク質染色による)とmiRNAを標的とするロック核酸(LNA)プローブを用いたロック核酸in situハイブリディザティN(MARLIN)によるMicroRNA増幅と認識を開発しました。これは、抗ジゴキシゲニン(DIG)西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)複合体抗体によって活性化されるチラミドシグナル増幅(TSA)システムを実装することによって達成されました。HRPはTSAの触媒として機能し、Anti-DIGはLNAプローブに取り付けます。このアッセイは、タンパク質によるトランスクリプトーム後修飾におけるmiRの本質的な性質を理解する上で特に有用であり、場合によっては他のRNAを同時に行う可能性があります。さらに、miRNAとタンパク質発現の両方を定量できる市販のアッセイがないため、MARLINはFFPEサンプル内のmiRとタンパク質の in situ 関係を理解する効果的な方法を提供します。
MARLINを使用したmiR-181c-3pの定量化の初期結果は、ヒト卵巣FFPE組織のネイティブ空間コンテキスト内でmiRNAおよびタンパク質の並列分析の実現可能性を実証しました。この例を超えて、MARLINの成分に基づいて、Alexa Fluorなどの市販の蛍光多重蛍光色素、または他の低分子色素18を利用して、理論的には最大4つのタンパク質に拡張することが可能です。
さらに、この方法論は標準的な組織学的方法のバリエーションを採用しているため、適切なプローブと抗体の選択があれば、他の哺乳類FFPE組織と互換性があるはずです。この方法論は、空間構造を維持し、細胞および細胞内miRNAとタンパク質の共局在化を定量化することができます。このアプローチは、miRNAとタンパク質の共発現パターンと空間分布をマッピングすることにより、空間生物学における重大なギャップに対処し、天然組織構造内で直接コンテキスト化することができます。ここでは、MARLINを 図1の詳細なグラフィカルな概要とともに示します。提示されたプロトコルはmiR-181c-3p用に最適化されていますが、適切なプローブ設計があれば、他のmiRを研究することができます。この方法の重要なパラメータには、組織の品質の評価とプローブ濃度の最適化が含まれます。2つの10μm切片を利用し、すべてのRNAフラグメントサイズを保持するプロトコルを使用してRNAを抽出することにより、DV200メトリックを使用して組織ブロックのRNA完全性を評価することをお勧めします。DV200スコアが50以上、およびプロトコル濃度のサンプルは、体系的にテストする必要があります。
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プロトコル
このプロトコルは、HGSC 患者のヒト卵巣腫瘍組織切片のホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織を使用します。これらのサンプルは、卵巣がんの一次細胞減少手術を受けた未治療の患者から採取されました。すべてのサンプルと臨床データは、テキサス大学MDアンダーソン校の治験審査委員会によって承認されたプロトコルに基づいて、婦人科腫瘍学および生殖医学部門の卵巣がんリポジトリから取得されました。患者からの書面によるインフォームドコンセントはフロントデスクの担当者によって取得され、研究は認められた倫理ガイドラインに従って実施されました。
1.組織の準備
- すべてのFFPEサンプルを60°Cで一晩焼成し、各機器とツールをRNAseフリーの水で洗浄します。セクションの厚さが約5μmであることを確認します。
注:このプロトコルは卵巣腫瘍用に最適化されていますが、さらなるテスト後に他の組織タイプで使用できる可能性があります。 - キシレンを3ラウンド5分間、10ラウンドの再水和を3ラウンド(100%エタノール(EtOH)2x、95%EtOH 2x、70%EtOH 2x、50%EtOH 2x、30%EtOH 2x)で脱パラフィンを行います。1xトリス緩衝生理食塩水(TBS)で2分間、1回洗浄します。
注:この脱ろうステップは推奨されていますが、オプションであり、組織の種類によって異なります。 - 脱パラフィン化と再水和後、3%過酸化水素(H2O2)の溶液を10分間塗布します。1x TBS、2xで2分間洗浄します。次に、3.7%パラホルムアルデヒド(PFA)の溶液を10分間塗布します。1x TBS、2xで2分間洗浄します。
注:このステップはオプションであり、脂肪組織または剥離しやすいサンプルに対してのみ考慮する必要があります。 - 抗原回収の第1ラウンドに進みます。このプロトコルは、EZ-Retriever IR システムを使用します。システムの指示に従って、サンプルを95°Cの新鮮なEZ-AR1バッファーに15分間浸漬した状態でマイクロ波で加熱します。20分間冷まします。
- 1x TBSで2分間洗浄します。次に、1x TBS-T(1x TBS、0.1%トゥイーン)、2xで2分間。
2. タンパク質の応用
- 疎水性バリアペンで各組織切片の周りにバリアを描きます。
- 抗体ブロッキング溶液を1x(組織領域全体を覆うのに十分)を加え、湿度チャンバー(周囲湿度および制御されていない湿度)で室温で30分間インキュベートします。
- 続いて、最初の一次抗体を同じブロッキング溶液で希釈し、組織領域全体を覆うのに十分な量を塗布し、湿度チャンバーで室温で1時間インキュベートします。
注:このプロトコルの開発中に、抗CD8は1:75の希釈で使用されました。 - 1x TBS-T、3xで2分間洗浄します。次に、抗MS + Rb HRPを加え、サンプルを湿度チャンバー(周囲湿度および制御されていない湿度)で室温で10分間インキュベートさせます。
- 1x TBS-T、3xで2分間洗浄します。最初の蛍光色素を増幅希釈剤で1:100に希釈し、湿度チャンバー内で室温で10分間インキュベートします。
注:このプロトコルの開発中に、690 nm発光蛍光色素が使用されました。この時点から、最初の蛍光色素を適用した後の残りの手順では最小限の照明を使用することをお勧めします。 - 1x TBS-T、3xで2分間洗浄します。マイクロ波での抗原回収の2回目のラウンドで抗体染色を開始し、サンプルを95°Cの新鮮なEZ-AR1バッファーに15分間沈め、次に20分間冷却します。
- 1x TBSで2分間洗浄します。次に、1x TBS-T、2xで2分間洗浄します。
- 1x抗体ブロッキング溶液を室温(周囲湿度および制御されていない湿度)の湿度チャンバーで30分間再度塗布します。
- 2番目の一次抗体を同じブロッキング溶液で希釈し、組織領域全体を覆うのに十分な量を塗布し、湿度チャンバーで4°Cで少なくとも16時間一晩インキュベートします。
注:このプロトコルの開発中、Anti-EpCAMは1:200の希釈で使用されました。 - 翌日は、1x TBS-T、3x で 2 分間洗浄することから始めます。次に、Anti-Ms + Rb HRPを加え、サンプルを湿度チャンバー(周囲湿度および制御されていない湿度)で室温で10分間インキュベートします。
- 1x TBS-T、3xで2分間洗浄します。2番目の蛍光色素を増幅希釈剤で1:100に希釈し、湿度チャンバー内で室温で10分間インキュベートします。
注:このプロトコルの開発中に、620 nm発光蛍光色素が使用されました。
3. プローブの応用
- 1x TBS-T、3xで2分間洗浄します。
- EZ-AR1 Eleganceを使用して、107°Cのマイクロ波で15分間、3回目で最後の抗原検索を開始します。20分間冷まします。1x TBSで3分間洗浄します。
- RNAscope Protease Plus(組織領域全体を覆うのに十分)を塗布し、40°Cで30分間保持します。オーブンを使用してください。1x TBS、2xで5分間洗浄します。
- miRNA LNAプローブを90°Cで4分間変性させることにより、プローブ調製を行います。次に、miRNA-ISHバッファーを使用してプローブをすぐに希釈します。プローブ溶液をボルテックスして回転させます。
注:このプロトコルの開発中に、miR-181c-3pターゲットプローブを1:250の希釈で使用しました。 - プローブ(組織領域全体を覆うのに十分)を適用し、60°Cで1時間オーブンに戻します。 5x生理食塩水クエン酸ナトリウム(SSC)バッファーで5分間洗浄します。
- 60°Cで予熱したSSCで、次の順序で5回の厳密な洗浄を行い、各ラウンドで5分間希釈します:5x SSCを1ラウンド、1x SSCを2ラウンド、0.2x SSCを2ラウンド。
- 室温で0.2x SSCで5分間洗浄します。ブロッキングバッファーとともに、加湿チャンバー内で室温で30分間インキュベートします。1x TBSと0.5%ブロッキング試薬パウダーを組み合わせて使用し、塗布前にブロッキング溶液をボルテックスして回転させてください。
- 抗ジゴキシゲニン(マウス)HRP複合体(これらのサンプルには、1:500の希釈液を使用)を適用し、加湿チャンバー内で室温で30分間インキュベートします。
- 1x TBS-T、3x で 5 分間洗浄チラミドシグナル増幅とシアニン 3 (TSA+Cy3) 蛍光色素の推奨希釈液を 1:50 に、室温 (周囲湿度および制御されていない湿度) の湿度チャンバーで 10 分間塗布します。塗布する前に、必ずTSA + Cy3溶液をボルテックスして回転させてください。
- 1x TBS-T、3xで5分間洗浄します。
4. 核染色と実装
- 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)作業溶液(組織領域全体を覆うのに十分)を、加湿チャンバー(周囲湿度および制御されていない湿度)で室温で5分間塗布します。
注:このプロトコルでは、1:1000の希釈液を使用し、作業DAPIストックをTBSで希釈しました。 - 1x TBS-T、3xで5分間洗浄します。完了したら、封入剤を使用してカバーガラスを塗布し、スライドを10分間乾燥させます。スライドは、イメージングの24〜72時間前から最大3か月後まで、暗所で4°Cで保管してください。
5. イメージングと分析
- イメージングには、40倍の倍率でスライド走査顕微鏡(推奨)を使用してください。
- その後の定量分析を実行して、細胞セグメンテーションと表現型解析にDAPIとタンパク質対比染色を利用して涙点を列挙します。
注:このプロトコルでは、フェノイメージャーHTによるイメージングを利用しました。存在する蛍光色素に適切なフィルターを使用して、フルスライドスキャンを40倍の倍率でキャプチャし、多重化された画像をOME-TIFFファイルとしてエクスポートしました。次に、スキャンされた画像を定量分析のためにVisiopharm画像解析ソフトウェアにアップロードしました。
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結果
このプロトコルをテストする場合、精度と比較のために、同じ代表サンプルの2つの連続セクションを持つことが重要です。この場合、高悪性度卵巣がん (HGSC) サンプルを使用して結果を比較しました。miRNA染色のみを通過するコントロールスライド(図2A-B)と、タンパク質とmiRNAの両方の染色を受けるテストスライド(図2C-J)を使用しました。
対照スライドとテストスライドの両方で一貫したmiRNA(miR-181c-3p)発現が見られ、腫瘍細胞ではより高い発現が現れました(図2A-D)。また、2つの切片間でm...
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ディスカッション
miRNAの重要性は認識され、理解されていますが、現在、標準的な方法を使用してmiRNAを研究することの難しさにより、正常な発達と疾患状態の両方の観察が妨げられています。 in situ 方法の不足は、MARLIN (miRNA FISH アッセイ) の開発につながりました。miRNAの相同性と短い長さを考えると、miRNAの位置とトランスクリプトーム後調節への影響を視覚化することは課題になります。このプロトコル開発では、ロック核酸プローブ (LNA) を利用します。LNAは、リボースがメチレン架橋でロックされ、酸素原子を炭素原子に接続する修飾RNA塩基です。この追加のブリッジは、リングに通常関連する柔軟性を制限し、本質的に分子構造を剛性のあるコンフォメーションにロックします19。LNAは、プローブの短縮と消光効率の向上を可能にし、バックグラウンドシグナルを低減し、アッセイ感度と特異性を向上させるためのアッセイ設計をサポートします。
...
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
アッセイの開発中にバサントの論文委員会の一員であったChi Lam Au YeungとManjunath Nimmakayaluの次の人々に感謝したいと思います。また、使用されたサンプルを切片化して提供したサミュエル・モク氏もいます。最後に、Visiopharmソフトウェアの分析と使用中に広範な支援を提供してくれたJohan DoréとDan Winkowskiに感謝します。この研究は、卵巣がん研究同盟(OCRA 811621および891490)、Sie財団、およびStephanie C. Stelter Endowment Fundから部分的に資金提供されました。この研究は、MD アンダーソンのがんセンター支援助成金 P30 CA016672 およびジャレッド バークスの NCI の研究スペシャリスト 1 R50 CA243707-01A1 を通じて国立衛生研究所によって部分的に支援されているフローサイトメトリーおよび細胞イメージング コア ファシリティと共同で実施されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 10xTRISバッファー生理食塩水(TBS)pH 7.6 | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | J62662 K7 | ステップ間の断続的な洗いのために |
| 1xオパール抗体希釈剤/ブロック | アコヤ・バイオサイエンス | ARD1001EA | タンパク質ブロッキング溶液 |
| 1x Plusオートメーション増幅希釈剤 | アコヤ・バイオサイエンス | FP1609 | オパール蛍光素を希釈するために使用 |
| 20倍の濃縮 生理食塩水クエン酸ナトリウム(SSC)バッファー | シグマ・オルドリッチ | S6639-1L | プローブハイブリダイゼーション後のmiRNAウォッシュについて |
| 4',6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI) | サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック/インビトロジェン | EN62248 / 62248 | 核染色用 |
| ACD HybEZ II ハイブリダイゼーションシステム | ACDバイオテクネ | 321711 | miRNAscopeプロトコル中に温度を調節するためのオーブン |
| アンチCD8(D8A8Y)、ラビット抗体 | 細胞シグナル伝達技術 | 85336S | このプロトコルを最適化するために使用された一次抗体の例 |
| 抗ジゴキシジェニン(マウス)HRP共役 | リヴビティ・ヘルスサイエンス株式会社 | NEF832001EA | miRNA検出に用いられる二次試薬 |
| 抗EpCAM(E6V8Y)、ウサギmab | 細胞シグナル伝達技術 | 93790 | このプロトコルを最適化するために使用された一次抗体の例 |
| ブロッキング試薬粉末 | アコヤ・バイオサイエンス | FP1012 | miRNA遮断溶液 |
| エチルアルコール 100%(200プルーフ) | ファームコ | 111000200 | 脱硫黄化のために |
| EZ-AR1バッファ | バイオジェネックス | HK521-XAK | FFPE組織切片のタンパク質段階での抗原回収に使用されます |
| EZ-AR1エレガンスバッファ | バイオジェネックス | HK546-XAK | miRNAプローブステップでのFFPE組織切片の抗原回収に使用されます |
| EZリトリーバーIRシステム | バイオジェネックス | MW015-IR | FFPE組織切片の抗原回収に用いられるマイクロ波 |
| 過酸化水素溶液30% | シグマ・オルドリッチ | HX0640-5 | 組織の準備のために。内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害し、色の濃い生成物を生成するのに役立ちます |
| miR-181c-3p miRNAプローブ | キアゲン | 339112 | このプロトコルを最適化するために使用されたmiRNAプローブの例 |
| miRCURY LNA miRNA ISH バッファセット(FFPE) | キアゲン | 339450 | miRNAプローブを希釈するために使用 |
| オパール620 | アコヤ・バイオサイエンス | FP1495001KT | 一次抗体の特定のための蛍光色体 |
| オパール 690 | アコヤ・バイオサイエンス | FP1497001KT | 一次抗体の特定のための蛍光色体 |
| オパール抗Ms + Rb HRP | アコヤ・バイオサイエンス | ARH1001EA | 検出剤として使用される二次抗体 |
| ピアス 16% ホルムアルデヒド(含水)、メタノールフリー | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 28908 | 組織製製のための3.7%PFAを作ること |
| プロロング ダイヤモンドアンチフェイド | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | P36970 | マウンティングメディア |
| RNAscopeプロテアーゼプラス | ACDバイオテクネ | 322331 | 組織切片の透過性を付与するために、タンパク質や標的miRNA分子を露呈します |
| RNAseフリーの水とnbsp; | コーニング | 46-000-CM | すべての機器を清掃・準備し、必要に応じて希釈剤として使うこと―nbsp; |
| トゥイーン20 | シグマ・オルドリッチ | P1379-25ML | TBS-Tを作るために |
| チラミド信号増幅とシアニン3 | アコヤ・バイオサイエンス | NEL744001KT | miRNA同定のための蛍光色体 |
| U6およびスクランブルmiRNAプローブ | キアゲン | 339459 | オプションの制御プローブ |
| キシレン組織学的グレード | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | UN1307 | 脱硫黄化のために |
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