質量分析イメージングによるホルマリン固定パラフィン包埋サンプル中の生体分子の逐次検出

Summary

ここでは、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織サンプルにおける逐次代謝物、 N結合糖鎖、およびトリプシンペプチド検出のための質量分析イメージングプロトコルを紹介します。

Abstract

組織は複雑な細胞環境であり、膨大な数の細胞型と生体分子で構成されており、すべてが相互作用して臓器の機能を実行します。従来、代謝産物、糖鎖、タンパク質などの生体分子の分析技術は、組織の均質化を伴い、すべての空間情報を破壊していました。これらの従来の方法は、複雑な細胞内および細胞外の分子相互作用の完全な理解を阻害しました。一方、質量分析イメージング(MSI)は、組織内の生体分子の空間情報を保存するだけでなく、ほぼ単一細胞の分解能で逐次分析を行うことで、同じ組織切片から複数のクラスの分析物を検出することができます。これにより、さまざまなクラスの生体分子にわたる分子相互作用のより完全な全体像を導き出すことができます。ここで提示するプロトコルは、代謝物、 N-結合型糖鎖、およびトリプシンペプチドを同じ組織切片から20μmの分解能で順次質量分析イメージングを実行する手順を概説しています。分析物のクラスが画像化される順序を慎重に考慮し、完全性を確保するために切片を慎重に扱うことで、同じ切片から複数の高品質の画像を収集することができます。これらのデータは、その後、連続切片から収集された他の空間オミクスデータ(トランスクリプトミクス、免疫組織化学など)と統合することができ、これらの隣接する切片で同じ細胞を分析することができます。

Introduction

質量分析イメージング(MSI)は、組織内に存在する正確な分子のアプリオリな知識を必要とせずに、薄い組織切片から数百から数千の生体分子を検出および視覚化できる強力な技術であり、バイオマーカー発見のための優れたツール^{になります1。}脱着エレクトロスプレーイオン化(DESI)^2,3、赤外マトリックス支援レーザー脱着エレクトロスプレーイオン化(IR-MALDESI)⁴、二次イオン質量分析(SIMS)⁵など、いくつかのタイプのMSIがさまざまなラボで使用されていますが、マトリックス支援レーザー脱着/イオン化(MALDI)は依然として最も一般的に使用され、最も用途が広いです。ほとんどのクラスの生体分子は、組織の洗浄/前処理、酵素消化^{、および使用}されるマトリックス/溶媒など、サンプル調製を調整することにより、MSIによって検出できます^6,7。MALDI MSIは、代謝物、脂質、糖鎖、タンパク質、タンパク質分解ペプチドの検出に使用されています。

MSI 研究は、疾患メカニズム ^8,9 をよりよく理解し、がんの等級付けと病期分類^{を改善し 10,11}、治療結果を予測し¹²、診断を改善し¹³、分子腫瘍縁を決定するために、さまざまな臨床および前臨床研究で使用されています¹⁴。これらの研究のほとんどは、単一のクラスの分析物のみの検出に焦点を当てています。ただし、同じサンプルから複数のクラスの生体分子を分析することは、多くの場合興味深いものです。伝統的に、これは組織の連続切片で行われてきました。しかし、最近では、同じ組織切片から複数の分析種クラスを順次分析する例が示されています。例えば、Yagnikらは、凍結組織の脂質イメージングとそれに続く細胞型分類のための同じセクションからのMALDI免疫組織化学を実証した¹⁵。Cliftらは、PNGaseF、コラゲナーゼ、およびトリプシンを、それぞれN結合型糖鎖、細胞外マトリックスタンパク質、および一般タンパク質のイメージングのために、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片に連続して適用することを示しました¹⁶。Escobarらは、凍結組織の同じセクションからのN結合型糖鎖、O-GlcNAc、およびトリプシンペプチドの逐次分析を実証しました¹⁷。これらのタイプの実験は、最も失われやすい分析種を最初に分析し、次に組織内でより安定した分析種を分析するという慎重な実験計画によって行われます。多くの場合、不要なクラスの分子を除去するために使用される洗浄は、他のクラスの分子6を増強するのに役^{立ち、以前}に適用されたマトリックスを除去する各洗浄は、画像化される次のクラスの分析種のシグナルを増強するのにも役立ちます。

最近、FFPE卵巣癌組織の同じセクションからの代謝産物、 N結合糖鎖、およびトリプシンペプチドの逐次分析のためのワークフローを発表しました¹⁸。ここでは、同じ組織切片からのこれら3つのクラスの生体分子を分析するための詳細なワークフローを紹介します。プロトコルの概要を 図 1 に示します。私たちの知る限り、これはFFPE組織からのシーケンシャルイメージングのためのこのワークフローを詳細に記述した最初のプロトコルです。簡単に言うと、負イオンモード代謝物イメージングのために、1,5-ジアミノナフタレンマトリックス(50%アセトニトリル中で10 mg / mL)でコーティングする前に、組織切片をキシレンで脱ろうします。次に、マトリックスを除去し、切片を再水和し、抗原を回収してから、PNGase F(重炭酸アンモニウム中で0.1 μg/μL)を噴霧して、 N結合型糖鎖 をその場で放出します。インキュベーション後、切片をα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸(CHCA)(70%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸中で10 mg/mL)マトリックスでコーティングし、ポジティブイオンモードでイメージングします。次に、マトリックスを再度除去し、再水和と抗原回収を繰り返し、切片にトリプシン(重炭酸アンモニウム中で0.075 μg/μL)を噴霧し、インキュベートしてから、再びCHCA(70%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸中で10 mg/mL)マトリックスでコーティングし、ポジティブイオンモードでイメージングします。すべての溶液は、使用直前に新鮮にする必要があり、可能であれば、実験は連続3日間にわたって実施する必要があります。遅延が発生した場合は、切片を乾燥させた状態で-80°Cの冷凍庫に保管する必要があります。

Protocol

このプロトコルは、高悪性度漿液性卵巣癌の一次細胞減少手術を受ける未治療の患者から収集されたホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織を使用します。すべての臨床データは、テキサス大学 MD アンダーソン校の治験審査委員会によって承認されたプロトコルに基づいて、婦人科腫瘍学および生殖医学部門の卵巣がんリポジトリから取得されました。患者からの書面によるインフォームドコンセントはフロントデスクの担当者によって取得され、研究は認められた倫理ガイドラインに従って実施されました。

1. 代謝物イメージングサンプルの調製

注:このプロトコルは、臨床サンプルは一般に組織技師によって臨床病理コア内で切片化されなければならないため、ホルマリン固定パラフィン包埋組織(厚さ4μm)の切片がすでにガラス顕微鏡スライドに取り付けられていることを前提としています。ここで紹介する作業は、参照されたTOF装置で実行されるため、直交TOF測定により、MSI実験で従来使用されていた導電性スライドの必要性が軽減されます。また、標準的な顕微鏡スライドを使用することは、臨床病理学ラボでの標準的なワークフローに適しているだけでなく、スライドにすでに載っているアーカイブ組織の使用を可能にします。

1. ダイヤモンドスクライブを使用して、スライドの四隅に基準マークを作成します。
2. 組織学的グレードのキシレンに3分間浸漬することにより、切片を脱パラフィン化します。
   注:キシレンは有毒であるため、化学ヒュームフードで使用する必要があります。
3. 切片を新鮮なキシレンに3分間浸します。
4. スライドを室温で乾燥させます。
5. スライドをスライドアダプターターゲットに配置します。
6. フラットベッドスキャナーを使用して、4,800 dpiの解像度でスライドの光学画像を取得します。
7. 15 mgの1,5-ジアミノナフタレン(DAN)を1.5 mLの50%ACNに溶解してMALDIマトリックスを作成します。完全に溶解するまで~5分間超音波処理します。サンプルループにロードする前に、マトリックス溶液をろ過します。
   注:DANは発がん性の疑いがあるため、適切な個人用保護具と一緒に使用する必要があります。マトリックス噴霧は、化学ヒュームフードで実行する必要があります。
8. 次のパラメータを持つロボット試薬噴霧器を使用して、スライドにDAN溶液をスプレーします。 トラック速度 - 1,200 mm/s;トラック間隔 - 3 mm;ノズル温度 - 60 °C;ノズルの高さ-40mm;流量 - 100 μL/min;パス - 4;N ₂ 圧力-10psi;パターン - CC
9. メタノールに懸濁した赤リン0.5 μLをスライド上の既知の位置に塗布します。

2. 代謝物イメージングデータ収集

1. 準備したスライドをスライドアダプターIIに入れ、timsTOF fleX MALDI QTOF質量分析計にロードします。
2. timsOffでtimsControlに負イオンモードデータ収集に適したメソッドをロードします。装置がまだマイナスイオンモードになっていない場合は、平衡化のために極性を切り替えてから少なくとも25分待ってから、代謝産物の次の機器パラメータを使用して校正およびデータ収集を行います:m / z範囲 - 50 - 600;レーザースキャン範囲 - X、Y両で16.0 μm。結果のフィールドサイズ - XとYの両方で20.0 μm。レーザーショット - 150;レーザーフルエンス - ~30%;漏斗 1 RF - 150.0 Vpp;ファンネル 2 RF - 200.0 Vpp;多極RF - 200.0 Vpp;衝突エネルギー - 10.0 eV;衝突RF - 500.0 Vpp;転送時間 - 55.0 μs;プリパルスストレージ - 5.0 μs(補足図S1)。
3. サンプルキャリアタブでターゲットプロファイル(今すぐ生成ボタンをクリック)とフォーカス調整(今すぐ調整ボタンをクリック)を実行します。必要に応じて、レーザータブでレーザーの位置をXとYで調整し、レーザーが十字線と正確に位置合わせされていることを確認します。
4. スライド上のスポットから少なくとも 5 セットのレーザー ショットを合計して、赤リンのスペクトルを収集します。
5. キャリブレーション タブの [キャリブレーション] ボタンをクリックして、キャリブレーションを実行します。強度が非常に低いピークや ppm 誤差が高いピークをすべて除去します。
   注:リンクラスター(P2およびP4)でさえ、一般に非常に弱い信号を発します。[同意する]をクリックする前に、キャリブレーションスコアは100%である必要があります。そうでない場合は、合計されたスペクトルをクリアして、新しいスペクトルを取得します。
6. flexImagingソフトウェアを起動します。画像取得GUIが自動的に起動します。
7. [イメージング実行の選択]ウィンドウで[新しいイメージング実行の設定]を選択します。
8. [ワークフローの選択] ウィンドウで [クラシック ワークフロー] を選択します。
9. [ データストレージ ] ウィンドウで、データの [イメージング実行名 ] と [結果ディレクトリ ] を指定します。
   注: ファイル名にはスペースを使用しないでください。
10. [集録設定] ウィンドウで [ユーザー定義の計測領域] を選択し、[ラスター幅] ボックスに「20」と入力します。[参照] をクリックして、以前に作成した timsControl メソッドを選択します。
11. [ サンプル画像] ウィンドウで、[ 参照 ]をクリックして、フラットベッドスキャナを使用して取得した光学画像を選択します。
12. [ サンプルのティーチング] ウィンドウで、光学画像とスライドの間の3点位置合わせを実行します。次に、サンプルキャリアをスライド上の最初のエッチングされた基準値に移動し、TimsControlの十字線をエッチングの明確な特徴に合わせます。画像を拡大し(100%ズームを推奨)、 サンプル画像 をティー チポイントの設定に設定し、光学画像内の同じ場所をクリックします。このプロセスをさらに 2 回繰り返して、合計 3 つのティーチ ポイントを取得します。[ 次へ ] をクリックして、ティーチングを完了します。
13. [ OK ]をクリックして、 新しいイメージング実行ウィザードを終了します。
14. ティーチングの精度を確認するには、ソフトウェアの「 サンプルキャリアの位置 」ボタンをクリックします。ズームインして、画像内の 4 番目の (未使用の) 基準点の明確な特徴をクリックします。サンプルキャリアは、timsControl内のこの位置に移動します。十字線が選択したフィーチャーと揃っていることを確認します。それらが揃わない場合は、flexImagingでティーチングをクリアし、ティーチングプロセスを繰り返して精度を向上させます。
15. ソフトウェアで、[ ポリゴン測定領域の追加]ツール を選択し、画像化する組織の輪郭を描きます。マウスをクリックするたびにアンカーポイントが作成されます。キーボードのバックスペースボタンを押して、ポイントを 1 つずつ削除します。領域が描画されたら、マウスをダブルクリックしてポリゴンを閉じます。
16. 組織内のいくつかの場所にレーザーを発射して信号を確認します。ステップ2.14のように、 サンプルキャリアの位置 ボタンを使用して、図内の場所をクリックし、ティーチングを確認します。スペクトルは、m / z 157および313付近のマトリックスピークによって支配されます。154 と 250-300 未満の m/z 領域を拡大すると、それぞれ多くの低分子代謝産物と脂肪酸のピークが表示されます。最適な信号を得るために、必要に応じてレーザーフルエンスを調整します。
17. timsControl メソッドを保存します。
18. ソフトウェアの[ AutoXecute Runの開始 ]ボタンをクリックして、イメージングの取得を開始します
    注:DANマトリックスを使用した負イオンモードでのイメージングにより、TCAサイクル、アミノ酸、脂肪酸などからの多数の代謝産物が検出されます。

3. N結合糖鎖イメージングのためのサンプル調製

1. 質量分析計からサンプルを取り出した後、スライドを100%エタノール(200プルーフ)に1分間浸してDANマトリックスを除去します。
2. スライドをコプリンジャーに再水和します:新鮮な100%エタノールを1分間。95%エタノールを1分間。70%エタノールを1分間。3分間水をやる。真水で3分間。
3. スライドを~15分間乾燥させます。
4. スライドを100 mM Trisバッファー(6.06 gのTrisベースを500 mLの水に溶解し、必要に応じてpHを調整して作られ)、pH 9)、蓋を上にゆるく置いたコプリンジャーに浸し、チャンバー内に500 mLの水を入れたデクローキングチャンバーに入れることにより、抗原回収を行います。95°Cに20分間加熱します。
5. コプリンジャーをデクローキングチャンバーから取り出し、ベンチトップに置いて20分間冷却します。
6. スライドを5回の交換で水に緩衝液交換します。最初の3つについては、溶液の半分を注ぎ、水と交換します。最後の2つについては、すべての溶液を注ぎ、水と交換します。
7. スライドを完全に乾かします。
8. PNGaseF塗布後にスライドをインキュベートするための湿度チャンバーを作成します。直径100mmのペトリ皿の底を覆うために、吸収性ワイプの円を切ります。実験用ワイプを2枚転がして、ペトリ皿の両側に枕を作ります(図2)。8 mLの水を加えてこれらのワイプを飽和させ、ペトリ皿に蓋をし、37°Cのオーブンに少なくとも30分間入れて予熱します。
   注:皿の中は蒸し暑く見えるはずです。
9. 100 μgの凍結乾燥酵素を200 μLの100 mM重炭酸アンモニウム、pH 7.8に再構成し、ボルテックスして混合することにより、PNGaseFを調製します。溶液を1.5 mLの微量遠心チューブに移し、水で1 mLに希釈します。
10. ロボット試薬噴霧器を使用して、次のパラメーターでスライドにPNGaseFをスプレーします。シリンジポンプは、小容量/低流量の用途に使用してください。 トラック速度 - 1200 mm/s;トラック間隔 - 3 mm;ノズル温度 - 45 °C;ノズルの高さ-40mm;流量 - 25 μL/min;パス - 15;N ₂ 圧力-10psi;パターン - CC
11. スライドを予熱したペトリ皿に、組織側を上にして、片方の端を各実験用拭き枕に置きます。スライドを交換し、ペトリ皿を粘着シールフィルムで密封します。37°Cのオーブンに入れ、ペトリ皿の上に40°Cに設定された爬虫類の加熱パッドを置きます。
    注:これにより、蓋が皿の最も暖かい部分に保たれ、蓋に結露が発生して組織に落ちて画像にアーティファクトが発生するのを防ぎます。
12. スライドを2時間インキュベートして、消化を進めます。
13. ペトリ皿からスライドを取り出し、~5分間乾燥させます。
14. 15 mgのα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸(CHCA)を1.5 mLの70%ACN、0.1%TFA、10 mMリン酸アンモニウムに溶解して、MALDIマトリックスを作成します。
    注意: TFAは腐食性であるため、適切な個人用保護具を備えたフードで使用する必要があります。
15. 完全に溶解するまで~5分間超音波処理します。
16. サンプルループにロードする前に、マトリックス溶液をろ過します。
17. ロボット試薬噴霧器を使用して、次のパラメータでスライドにCHCAをスプレーします。 トラック速度 - 1,200 mm/s;トラック間隔 - 3 mm;ノズル温度 - 75 °C;ノズルの高さ-40mm;流量 - 120 μL/min;パス - 3;N ₂ 圧力-10psi;パターン - HH
18. メタノールに懸濁した赤リン0.5 μLをスライド上の既知の位置に塗布します。

4. N -結合糖鎖イメージングデータ収集

1. 準備したスライドをスライドアダプターターゲットに置き、MALDI QTOF質量分析計にロードします。
2. 正イオンモードデータ収集に適切なメソッドをtimsControlにロードします。装置がまだ正イオンモードになっていない場合は、平衡化のために極性を切り替えてから少なくとも25分待ってから、糖鎖の次の装置パラメータを使用して校正およびデータ収集を行います:m / z範囲 - 700-3500;レーザースキャン範囲 - X、Y両で16.0 μm。結果のフィールドサイズ - XとYの両方で20.0 μm。レーザーショット - 200;レーザーフルエンス - ~25%;漏斗 1 RF - 450.0 Vpp;漏斗 2 RF - 500.0 Vpp;多極 RF - 500.0 Vpp;衝突エネルギー - 10.0 eV;衝突RF - 2,700.0 Vpp;転送時間 - 140.0 μs;プリパルスストレージ - 14.0 μs(補足図S2)。
3. サンプルキャリアタブでターゲットプロファイル(今すぐ生成ボタンをクリック)とフォーカス調整(今すぐ調整ボタンをクリック)を実行します。必要に応じて、レーザータブでXとYのレーザー位置を調整して、レーザーが十字線に位置合わせされていることを確認します。
4. スライド上のスポットから少なくとも 5 セットのレーザー ショットを合計して、赤リンのスペクトルを収集します。
5. キャリブレーション タブの [キャリブレーション] ボタンをクリックして、キャリブレーションを実行します。強度が非常に低いピークや ppm 誤差が高いピークをすべて除去します。
   注:[accept]をクリックする前に、キャリブレーションスコアは100%である必要があります。そうでない場合は、合計されたスペクトルをクリアして、新しいスペクトルを取得します。
6. ソフトウェアで代謝物イメージングに以前に使用した.misファイルを開きます。
7. グリカンデータであることを示す新しい名前でファイルを保存します。
8. 編集 |イメージング実行プロパティで、取得方法を目的の糖鎖法に変更します。
9. 編集 |ティーチポイントをクリアします。
   メモ: スライドを取り外してスライドアダプターにリロードした後、スライドはまったく同じ位置にはなりません。
10. 編集 |ティーチポイントを設定します。元のイメージングウィザード(ステップ2.12)で行ったように、 3点 を設定します。
11. ティーチングの精度を確認するには、ソフトウェアの「 サンプルキャリアの位置 」ボタンをクリックします。拡大して、画像の 4 番目の (未使用の) 基準点の明確な特徴をクリックします。サンプルキャリアは、timsControl内のこの位置に移動します。十字線が選択したフィーチャに揃っていることを確認します。
    注: 十字線が揃わない場合は、ティーチングをクリアし、ティーチングプロセスを繰り返して精度を向上させます。
12. ファイルを保存します。
13. 組織内のいくつかの場所にレーザーを発射して信号を確認します。手順4.11のように[ サンプルキャリアの位置 ]ボタンを使用して画像内の場所をクリックし、ティーチングを確認します。スペクトルに豊富な糖鎖ピークがあり、通常は m/z 1,663 と 1,809 で優勢なピークがあることを確認します。最適な信号を得るために、必要に応じてレーザーフルエンスを調整します。
14. timsControl メソッドを保存します。
15. [ AutoXecute Runの開始 ]ボタンをクリックして、イメージングの取得を開始します。

5. トリプシンペプチドイメージングのためのサンプル調製

1. スライドを100%エタノール(200プルーフ)に~1分間浸して、CHCAマトリックスを除去します
2. 次のように、コプリンジャーでスライドを再水和します。新鮮な100%エタノールを1分間。95%エタノールを1分間。70%エタノールを1分間。3分間水をやる。真水で3分間。
3. スライドを~15分間乾燥させます。
4. スライドを100 mMのトリスバッファー(pH 9)に沈め、蓋を緩く置いたコプリンジャーに沈め、チャンバー内に500 mLの水を入れたクローキングチャンバーに入れることにより、抗原回収を行います。95°Cに20分間加熱します。
   注:この2番目の抗原検索は、切断部位へのトリプシンのより効率的なアクセスのためにタンパク質を変性させるために必要です。
5. コプリンジャーをデクローキングチャンバーから取り出し、ベンチトップに置いて20分間冷却します。
6. スライドを5回の交換で水に緩衝液交換します。最初の3つについては、溶液の半分を注ぎ、水と交換します。最後の2つについては、すべての溶液を注ぎ、水と交換します。
7. スライドを完全に乾かします。
8. 100 μgの凍結乾燥酵素を200 μLの100 mM酢酸に再構成し、ピペットで上下に混合することにより、トリプシンを調製します。実験に適したサイズ(通常40 μL)にアリコートし、-20°Cで保存します。
9. 350 μLの100 mM重炭酸アンモニウム、pH 7.8、および39 μLのACNを加えて、40 μLのトリプシンアリコートを調製します。よく混ぜます。
   注:アセトニトリル(10%ACN)は、水溶液と比較してトリプシンの活性を高め、スプレー用の溶液の表面張力を低下させます¹⁹。
10. 次のパラメーターを持つロボット試薬噴霧器を使用して、スライドにトリプシンをスプレーします。シリンジポンプは、小容量/低流量のアプリケーションに使用してください: トラック速度 - 750 mm/s;トラック間隔 - 3 mm;ノズル温度 - 30 °C;ノズルの高さ-40mm;流量 - 10 μL/min;パス - 12;N ₂ 圧力-10psi;パターン - HH
11. 直径100 mmのペトリ皿の底に正方形の吸収性ワイプを置きます。角が皿の端にちょうど触れていることを確認し、ワイプの上に1mLの水を流します。
12. スライドをワイプの上に置き、ティッシュ側を上にして、ペトリ皿の上に蓋を置き、ペトリ皿を粘着シールフィルムで密封します。
13. スライドを37°Cで4時間インキュベートして、消化を進めます。
14. シャーレからスライドを取り出し、~5分間乾燥させます。
15. 15 mgのα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸(CHCA)を1.5 mLの70%ACN、0.1%TFA、10 mMリン酸アンモニウムに溶解してMALDIマトリックスを作成します。
16. 完全に溶解するまで~5分間超音波処理します。
17. サンプルループにロードする前に、マトリックス溶液をろ過します。
18. 次のパラメータを持つロボット試薬噴霧器を使用して、スライドにCHCAをスプレーします。 トラック速度 - 1200 mm/s;トラック間隔 - 3 mm;ノズル温度 - 75 °C;ノズルの高さ-40mm;流量 - 120 μL/min;パス - 4;N ₂ 圧力-10psi;パターン - HH
19. メタノールに懸濁した赤リン0.5 μLをスライド上の既知の位置に塗布します。

6. トリプシンペプチドイメージングデータ収集

1. 準備したスライドをスライドアダプターに入れ、timsTOF MALDI QTOF質量分析計にロードします。
2. 正イオンモードデータ収集に適切なメソッドをtimsControlにロードします。装置がまだ正イオンモードになっていない場合は、ペプチドの次の装置パラメータを使用して校正およびデータ収集を行う前に、平衡化のために極性を切り替えてから少なくとも25分待ってください:m / z範囲 - 600-4500;レーザースキャン範囲 - X、Y両で16.0 μm。結果のフィールドサイズ - XとYの両方で20.0 μm。レーザーショット - 200;レーザーフルエンス - ~25%;漏斗 1 RF - 450.0 Vpp;漏斗 2 RF - 500.0 Vpp;多極RF - 600.0 Vpp;衝突エネルギー - 10.0 eV;衝突RF - 3400.0 Vpp;転送時間 - 180.0 μs;プリパルスストレージ - 18.0 μs(補足図S3)。
3. サンプルキャリアタブでターゲットプロファイル(今すぐ生成ボタンをクリック)とフォーカス調整(今すぐ調整ボタンをクリック)を実行します。必要に応じて、レーザータブでレーザーの位置をXとYで調整し、レーザーが十字線と位置合わせされていることを確認します。
4. スライド上のスポットから少なくとも 5 セットのレーザー ショットを合計して、赤リンのスペクトルを収集します。
5. キャリブレーション タブの [キャリブレーション] ボタンをクリックして、キャリブレーションを実行します。強度が非常に低いピークや ppm 誤差が高いピークをすべて除去します。[accept]をクリックする前に、キャリブレーションスコアが100%であることを確認します。そうでない場合は、合計されたスペクトルをクリアして、新しいスペクトルを取得します。
6. 以前に糖鎖イメージングに使用した.misファイルを開きます。
7. ペプチドデータであることを示す新しい名前でファイルを保存します。
8. 編集 |イメージング実行プロパティで、取得方法を目的のペプチドメソッドに変更します。
9. 編集 |ティーチポイントをクリアします。
   メモ: スライドを取り外してスライドアダプターにリロードした後、スライドはまったく同じ位置にはなりません。
10. 編集 |ティーチポイントを設定します。元のイメージングウィザード(ステップ2.12)で行ったように、3つの点を設定します。
11. ティーチングの精度を確認するには、サンプル キャリアの位置 付けボタンをクリックします。拡大して、画像の 4 番目の (未使用の) 基準点の明確な特徴をクリックします。サンプルキャリアは、timsControl内のこの位置に移動します。十字線が選択したフィーチャに揃っていることを確認します。
    注: 十字線が揃わない場合は、ティーチングをクリアし、ティーチングプロセスを繰り返して精度を向上させます。
12. ファイルを保存します。
13. 組織内のいくつかの場所にレーザーを発射して信号をチェックします。ステップ6.11のように[ サンプルキャリアの位置] ボタンを使用して画像内の位置をクリックし、ティーチングを確認します。スペクトルに豊富なペプチドピークがあり、通常は m/z 944、1,105、および 1,198 に優勢なピークがあることを確認します。最適な信号を得るために、必要に応じてレーザーフルエンスを調整します。
14. timsControl メソッドを保存します。
15. [ AutoXecute Runの開始 ]ボタンをクリックして、イメージングの取得を開始します。

7.組織学的染色

注:ヘマトキシリンとエオシンにはいくつかの方法があります。ここでは、このラボで頻繁に使用される修正されたカラッツィ法を紹介します。

1. スライドを100%エタノールに1分間浸して、CHCAマトリックスを除去します。
2. スライドを次のように染色します:95%エタノールを30秒間染色します。70%エタノールで30秒間。30秒間水をやる。ヘマトキシリンを2分間投与します。30秒間水をやる。70%エタノールで30秒間。95%エタノールを30秒間。エオシンを1分間投与します。95%エタノールを30秒間。100%エタノールを30秒間。キシレンを2.5分間;封入剤付きカバースリップ。
3. スライドを>1時間乾燥させ、カバーガラスを軽く押して気泡を取り除きます。
4. デジタルスライドスキャナーでデジタル化します。

8. データの可視化

注:SCiLS Labで実行できる広範な分析は、このプロトコルの範囲を超えています。ここでは、基本的なファイル作成、データの視覚化、および推定識別のためのデータベースに対するピークの検索について説明します。

1. SCiLS Lab 2025b を起動し、[新規] を選択します。
2. ソフトウェアにロードするデータファイルを選択します。
   注:SCiLS Lab Proでは、同じパラメータで収集された複数のデータファイルをまとめてロードして相互に正規化し、同時に視覚化できます。
3. サンプルを好みのレイアウトに配置します。サンプルを左クリックしてドラッグして移動します。サンプルを右クリックしてドラッグして回転させます。[ 次へ] を選択します。
4. [ 質量軸設定] ウィンドウで、必要な調整を行います。通常、デフォルト値は timsTOF データに適しています。[ 次へ] をクリックします。
5. [ フィーチャ検出] ウィンドウで、インポート中の自動ピーク ピッキングに適切な値を設定します。[ 次へ] をクリックします。
   注:これはFFPE組織からの代謝産物データにはうまく機能しないため、スキップする必要があります。
6. インポート設定は、 インポート の概要ウィンドウに表示されます。 [インポート] をクリックします。
7. ファイル名と SCiLS ファイルの保存場所を指定します。
   注: ファイルのサイズによっては、インポートに数分から数時間かかる場合があります。
8. 完了すると、 概要ウィンドウ が表示されます。[ インポートされたデータセットを開く ] をクリックして、SCiLS ファイルを操作します。
9. ソフトウェアの右上にある [正規化] の横にあるドロップダウンをクリックし、[二乗平均平方根] を選択します。
   注:これは、インポートされた重心データのスパース性を考慮すると、timsTOFデータに最も適した方法であり、最適な視覚化を提供します。
10. [ファイル] |[ファイルのプロパティ] で、間隔幅を適切な値 (通常は timsTOF データの場合は 10 から 15 ppm) に設定します。値が平均スペクトルのピークの幅にまたがっているかどうかを評価して、値が適切であることを確認します。
11. ソフトウェアの下部にある平均スペクトルを、クリックしてドラッグするか、マウスホイールを前方に回すことで拡大します。
12. 頂点に十字線を配置し、マウスホイールを左クリックして、視覚化するピークを選択します。
13. Control + スペースバーを押して、アクティブなイオン画像リストに目的のイオンを追加します。
14. キュレーションされた特徴リストを保存するには、ソフトウェアの右側にあるイオン画像ウィンドウの下部にある[特徴量リストとして保存]ボタンをクリックします。
15. 保存したフィーチャリストを開くには、 ファイル | MetaboScapeが同じネットワークにインストールおよび構成されている場合、MetaboScapeを使用して推定代謝物または糖鎖IDを検索する機能表と検索。または、SCiLS ファイルを .imzML ファイルに変換して METASPACE (https://metaspace2020.org/) にインポートして、推定識別します。
    注: SCiLS Lab の機能の詳細については、ユーザーマニュアルの [ ヘルプ ] メニュー オプションを参照してください。

Results

このプロトコルが完了すると、組織の同じセクションから3つの堅牢なMSIデータセットが作成されるはずです。代謝物データの全スペクトルの視覚化では、スペクトルはm / z 157および315のマトリックスピークによって大きく支配されます。これはFFPE組織では正常です。多くの代謝産物と脂肪酸のシグナルは、m/z 範囲 <155 と 250 から 300 の間で拡大することで観察されます。 図3 は、組織から得られた複雑な代謝産物スペクトルを強調するフルスペクトルとズーム範囲の例を示しています。通常、このサンプル前処理では、700〜900の代謝産物ピークがネガティブモードのFFPE組織切片から観察されます。

PNGaseF消化により、組織内で~2〜300個の糖鎖ピークが検出されるはずです。m/z 範囲 1,000-2,000 の糖鎖に由来するピークは、その原子組成により、10 進数以下 0.3-0.7 の質量を持つ必要があります。この10進数の質量は、このサンプル前処理で観察される可能性のあるマトリックスクラスターから糖鎖...

Discussion

単一の組織切片から連続したMSIデータを収集するには、細部に細心の注意を払う必要があります。高品質のデータを実現するには、絶対に重要な手順がいくつかあります。まず、複数のスライドを同時に準備する場合は注意が必要です。スライドをコプリンジャーに入れたり、コプリンジャー間を移動したりするときは、2つのスライドをジャー内の同じ位置に置かないように注意してください。これにより、組織表面の溶媒曝露が不十分になるか、一方のスライドがもう一方のスライドから組織をこすり落とす可能性があります。第二に、分析のために極性を変更するときは、装置を最低25分間平衡化させることが重要です。この間、分子の測定されたm / z値はわずかにドリフトします。これは、この平衡化時間にわたってチューンミックスを噴霧すると、ピークの質量がわずかに変化するため、観察できます。システムが平衡化される前に画像を開始すると、画像の最初の部分で検出されたピークの質量ドリフトが発生し、このセトリング期間中にキャリブレーションが実行された場合、キャリブレーションが正しくありません。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5-ジアミノナフタレン	フィッシャーサイエンティフィック	D010125G	代謝物イメージング用MALDIマトリックス
アセトニ トリル	フィッシャーサイエンティフィック	A955-4	マトリックス調製に使用されるLC-MSグレードの溶媒
&α;-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸	シグマ・アルドリッチ	70990-1G-F	糖鎖およびペプチドイメージング用のMALDIマトリックス
重炭酸アンモニウム	フィッシャーサイエンティフィック	A643-500	酵素用緩衝液
リン酸アンモニウム	シグマ・アルドリッチ	467782-50G	イメージング中のマトリックスクラスターを減らすための添加剤
クローキングチャンバー NxGen	バイオケアメディカル	該当なし	組織の抗原検索に使用
エタノール	フィッシャーサイエンティフィック	04-355-223	マトリックスの調製と染色に使用されるLC-MSグレードの溶媒
M5ロボット試薬噴霧器	HTXイメージング	該当なし	酵素やマトリックスの組織への応用に使用
メタノール	フィッシャーサイエンティフィック	A456-4	赤リン懸濁液製造用LC-MSグレード溶媒
MSグレードトリプシン	フィッシャーサイエンティフィック	PI90058	タンパク質消化用酵素
MTPスライドアダプターII	ブルカーダルトニックス	8235380	マイクロスコープスライドを質量分析計に挿入するためのアダプター
NanoZoomer SQ デジタルスライドスキャナー	浜松株式会社	該当なし	染色組織のデジタル顕微鏡画像の生成に使用
Perfection V600フラットベッドスキャナ	エプソン	該当なし	MSIデータ収集用のスライドの光学画像を生成するために使用されます
ペトリシール	フィッシャーサイエンティフィック	50-212-518	酵素消化中のシャーレの密封用
PNGaseF	ブルドッグのバイオ	NZPP550LY	タンパク質からのN結合型糖鎖の切断のための酵素
赤リン	シグマ・アルドリッチ	04004-250G	正イオンモードと負イオンモードの両方に対応するMALDI校正剤
SCiLS研究室 (2025b)	ブルカーダルトニックス	該当なし	MSIデータ可視化用ソフトウェア
timsTOF fleX QTOF質量分析計	ブルカーダルトニックス	該当なし	質量分析データ収集に使用
トリフルオラセ酸	フィッシャーサイエンティフィック	85183	ポジティブイオンモードイメージングのためのpHを下げるマトリックス添加剤
トリスベース	フィッシャーサイエンティフィック	BP152-500	抗原検索用バッファー
水	フィッシャーサイエンティフィック	W64	マトリックス、酵素、染色に使用されるLC-MSグレードの溶媒
ワイプオールX60	フィッシャーサイエンティフィック	19-413-113	加湿酵素インキュベーション用吸収性ワイプ
キシレン	フィッシャーサイエンティフィック	X3P-1GAL	染色用透明剤