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方法論記事

Stereo-seq による 種に依存しないトランスクリプトームの包括的な空間プロファイリング

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DOI:

10.3791/68619

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2025年10月31日

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1Department of Hematopoietic Biology and Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Veterinary Medicine & Surgery, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Genetics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この記事では、組織構造を維持しながら多様なトランスクリプトームの高解像度マッピングを可能にするStereo-seqを使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片から宿主、ウイルス、真菌、およびマイクロバイオームRNAの包括的な空間トランスクリプトームプロファイリングを実行するプロトコルを紹介します。

要約

宿主内の細胞の空間構成、および組織内の細菌またはウイルス量は、細胞型特異的プロセスを通じて細胞を駆動する細胞型と分析種の相互作用に影響を与える可能性があります。FFPE組織のステレオシークは、空間バーコードへのランダムプライミングを使用しますが、これは、A'tailingを使用してメッセンジャーRNA(mRNA)をキャプチャしたり、プローブベースを使用して種特異的な転写産物をキャプチャしたりする標準的な空間トランスクリプトミクス法とは異なります。これらの方法は、長いノンコーディングRNA、ミトコンドリアRNA、マイクロRNA、または微生物、ウイルス、真菌などの他の種のRNAからの他のタイプのRNAの影響と重要性に関する最新の知識を受け入れていません。ここでは、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織と互換性のあるランダマープローブ法を使用したRNA検出による空間種にとらわれないステレオシーケンスアプリケーションのための組織切片化からライブラリー調製までの段階的な手順を概説します。このStereo-seq法は、0.22 μmのサイズのランダムキャプチャビーズを持ち、0.5 μmごとにアレイ内で再発生し、シーケンシングベースの技術から細胞内分解能を可能にします。この方法は宿主RNAと非宿主RNAの両方を検出するため、プロトコルでは、収集、保存、切断、および検出プロセス中に組織内に何が存在するか、組織に沈着したもの(すなわち、環境および取り扱い汚染物質)を決定できるようにするための特定の考慮事項が必要です。最後に、このプロトコルにより、空間的コンテキスト内でマルチRNA種の高い(単一細胞)レベルの分解能を得ることができ、細胞型および病理学的種のインククトーム内およびインタクトームについての洞察が得られます。

概要

空間オミクス技術は、複数の標的、DNA(ゲノミクス)、RNA(トランスクリプトミクス)、代謝産物(メタボロミクス)、またはタンパク質(プロテオミクス)の同時定量を可能にすることにより、組織細胞の不均一性の研究に革命をもたらしました1。これらの異なるアッセイの分離能はしばしば異なるため、分析種を測定する際には、単一細胞2,3またはネイティブ空間コンテキスト4を測定する際のスパース性の増加のいずれかで、さまざまな制限が生じます。対照的に、RNAシーケンシングなどのバルク法は、サンプル全体にわたる平均的な遺伝子発現しか得られず、細胞の不均一性が不明瞭2、またはシングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)2,3は、単一細胞シーケンシングのために組織解離を必要とするため、多くの場合、フィルタリングを必要とします。したがって、これらの方法は大きな細胞と凝集体を除外しますが、バイオインフォマティクスの方法はフラグメントとダブレットを除去しようとしますが、これらはすべてバイアスを誘発します5,6,7。空間トランスクリプトミクスは組織構造を保持し、細胞の組織化と相互作用に関する重要な洞察を提供します。非標的空間シーケンシング法のほとんどは、単一細胞の分解能を持たないため、10〜100個の細胞を含む空間キャプチャ領域のデコンボリューションが必要である8,9,10。しかし、過去10年間で、実験戦略または新しい技術のいずれかを使用した解像度の進歩、より広いキャプチャ領域、およびマルチオミクスアプローチの統合が見られたため、空間トランスクリプトミクスはこれらの方法のニーズを上回りました1,11,12。

空間分解能強化オミクスシーケンシング(Stereo-seq)は、ナノスケールの分解能(500 nm)とセンチメートルスケールのキャプチャ領域を提供し、種にとらわれない全トランスクリプトームキャプチャにより、コーディング、非コーディング、および非宿主RNAのキャプチャを可能にします13。この方法は現在、空間トランスクリプトミクスの最高解像度であり、最大の視野を提供するオプションがあります。しかし、この方法には、シーケンス対応ライブラリを完成させるまでに約15時間のハンズオン時間、4日間にわたる時間と労力など、いくつかの顕著な制限があります。比較すると、プローブベースの空間トランスクリプトミクス、polyAキャプチャアレイベースの空間トランスクリプトミクス、Slide-seq、空間オミクスシーケンシングのための組織内の決定論的バーコーディング(DBiT-seq)など、他のシーケンシングベースの空間トランスクリプトミクス技術は、通常、2〜3日間で5〜8時間のハンズオン時間を必要とします(表1)。多くの研究者にとって、これらの進歩は技術的な課題を上回り、特に他の技術と重ね合わせた場合、細胞および細胞内レベルで疾患の進行を研究するための完全なトランスクリプトミクス空間アトラスを構築するのに理想的です1。

Stereo-seq プロトコルには、ポリアデニル化 mRNA 転写産物を捕捉するためにポリ T プローブに依存する従来の mRNA トランスクリプトミクスを超える可能性があります。これらの方法は、新鮮組織14 にポリアデニル化を追加するか、空間発現解析のために標的の事前定義された遺伝子セット15 の種特異的プローブを追加することによって変更することができる。代わりに、Stereo-seqはランダムヌクレオチドプローブを使用して、微生物RNA、真菌RNA、ウイルスRNA、およびエンハンサーRNA、環状RNA、および長いノンコーディングRNA(lncRNA)16などの非ポリアデニル化RNAを含む、種に関係なく多様なRNAを選択します。理論的には、より小さなRNAまたは低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、トランスポゾンなどの修復要素を捕捉することが可能です17。ただし、現在、これらのRNAのバイオインフォマティクスとマッピングは依然として困難であり、通常30 bpのカットオフを使用する初期アライメント中にフィルタリングされることがよくあります。

ここでは、 図1に示すStereo-seqプロトコルの理解と取り扱いを確実にするために、DNAナノボール(DNB)チップでのメーカーのランダムヌクレオチドキャプチャの変更を含む詳細なプロトコルの概要を示します。このプロトコルには、分子生物学者がランダムヌクレオチドキャプチャーを使用してStereo-seqで新しいFFPE組織をテストし、低品質のアーカイブサンプルおよび脂肪組織からより一貫性のある高収率を生成するための戦略が含まれています。概説されたプロトコルは、起源の種に関係なく、ほとんどの臓器からのFFPEサンプルに最適化されています。ただし、このプロトコルには、脱灰を必要とする骨髄などの困難な組織を処理するために必要な現在の変更は含まれていません。

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プロトコル

この方法論文では、未治療の高悪性度漿液性卵巣癌患者標本に関する臨床データは提供されていません。ただし、関連する臨床データは、テキサス大学 MD アンダーソンがんセンター婦人科腫瘍および生殖医療部門の治験審査委員会 (IRB) によって承認されたプロトコルに従って、書面によるインフォームド コンセントを提供した参加者から収集されました。

注:RNase汚染を防ぐために、プロトコル全体を通してサージカルマスクと手袋を着用することをお勧めします。髪が長い研究者は、髪を後ろに引っ張るか、ヘアネットを着用することをお勧めします。収量を最大化するために、常に滅菌ヌクレアーゼフリー水(NFW)とヌクレアーゼフリーの低結合DNA/RNAチューブを使用してください。植物組織などの非哺乳類組織では、ポリ-L-リジン (PLL) や細胞壁による透過処理時間の延長など、接着の最適化が必要になる場合があります。分子捕捉は理論的には実現可能ですが、現在のワークフローでは植物組織が未テストのままであるため、実験的検証が必要です。

1. RNAの品質とRNAフラグメント分布値を評価する200スコア

  1. 200 bp を超える RNA の割合を測定する RNA フラグメント分布値 200 (DV200) を使用して RNA 品質を評価します。
  2. Stereo-seq処理を目的とした同じ組織ブロックから2つの10 μm切片を利用します。
    注:即時処理が最適ですが、サンプルは4°Cで最大1週間、-20°Cで4週間、または-80°Cで6か月間保存できます。
  3. Patelら18 によって説明されているように、非サイズ選択的RNA抽出プロトコルを使用してRNAを抽出し、RNAフラグメントサイズの分布を正確に評価できるようにします。
  4. フラグメントアナライザーを使用して次のいずれかでRNA品質を評価し、DV200スコア、または200 bpを超えるRNAフラグメントを表す曲線下面積の割合を決定します。理想的には、組織はDV200スコア(>50%)と濃度(>10 ng / μL)を持っている必要があります。

2. ワークスペースの清掃

  1. すべての表面を30%の漂白剤で洗浄します。漂白剤とエタノールの組み合わせによるクロロホルムの形成を防ぐために、表面を少なくとも30分間乾燥させます。
  2. DNA除染ワイプ(DDW)で表面を拭きます。すべての表面にRNase除染液(RDS)をスプレーし、次にNFWで調製した70%エタノールをスプレーします。
    注意: 漂白剤やその他のアルコールを混ぜないでください。この組み合わせによりクロロホルムが生成され、毒性が高く、低曝露でも意識不明、臓器損傷、または死を引き起こす可能性があります。

3. Stereo-seq ランダム オリゴヌクレオチド キャプチャ チップ (N チップ) の調製

  1. 手順 2.1 と 2.2 の説明に従って、この手順で使用したすべてのシステムを含めてワークスペースをクリーンアップします。
  2. Stereo-seq N-chipをパッケージから取り出し、チップIDを記録し、チップに触れずにStereo-seq N-chipとスライドガラスの端を100%エタノールで洗浄します。完全に自然乾燥させます。
  3. チップをスライドに固定するための樹脂塗布(キシレンを使用するユーザーの場合はオプション)。
    注:非キシレン透明化剤は市販業者によって推奨されることがよくありますが、パラフィン混合物によっては非キシレン透明化剤の効果が低下する可能性があることが観察されています。多くの場合、特定のプラスチック、合成樹脂、または蜂蝋が埋め込まれた組織と互換性がなく、高度に架橋されたパラフィンや高融点のパラフィンを効率的に除去できません。サンプルの包埋に使用されるパラフィン組成が不明な場合は、最適な透明化のためにキシレンを使用することをお勧めします。さらに、キシレンは乳房、卵巣、卵子、脳組織などの脂肪組織をよりよく除去することができます。
    1. 樹脂をよく振るか混ぜて、均一に白くなるようにします。マイクロピペットを使用して、Stereo-seq Nチップの端の周りに10 μLのUV硬化性セラミック樹脂を慎重に塗布します(図2A)。
      注:樹脂は皮膚や目に炎症を起こし、繰り返し暴露するとアレルギー性皮膚反応を引き起こす可能性があります。この樹脂をピペッティングまたは取り扱うときは、常にニトリル手袋、安全ゴーグル、白衣を着用してください。換気の良い場所で作業し、大量に使用する場合や溶液を加熱する場合はマスクを着用し、皮膚や目に直接触れないようにしてください。
    2. 密閉されたフォームスワブを使用し、余分な樹脂を取り除き、チップの端の周りに細い線だけを残します。切りくず表面に触れないように、スライドをUV硬化装置に入れます。
    3. 405 nmのUV光源の不透明マスクの上に樹脂を塗布したチップを置き、スライドの裏側を照らし、5分間硬化させます。これを 図 2B に示します。
      注:Stereo-seq NチップをUV光に過度に露光したり、チップ表面の樹脂に触れたりしないでください。
    4. 硬化後、次のそれぞれに浸した密封されたフォーム綿棒を使用します。100%分子グレードのエタノール。70%エタノール;そして最後にNFWは、樹脂が置かれた端の周りを掃除します。白い斑点が剥がれた場合は、エッジをもう一度掃除してください。チップ表面には絶対に触れないでください(図2C)。
    5. スライドを完全に自然乾燥させます。検査後、必要に応じて乾燥剤を使用してチップを4°Cで一晩保存します。ただし、可能であればすぐにチップの準備と切片化を続けることをお勧めします。
      注意: UV光を扱うときは、常にUV保護メガネを含む適切な個人用保護具を着用してください。エタノールと樹脂は、換気の良い場所、できればヒュームフードで取り扱ってください。廃棄物は、制度上のガイドラインに従って処理します。
  4. ポリ-L-リジンによるチップ調製(脂肪組織または接着に問題のある組織にはオプション。
    1. 手順 2.1 と 2.2 の説明に従って、この手順で使用したすべてのシステムを含めてワークスペースをクリーンアップします。
      注:化学薬品をPCR装置に直接スプレーしないでください。すべてのPCR前ステップでは、可能であればPCRフードで作業し、cDNAの以前の増幅を含む汚染を防ぎます。
    2. 50 mLのコニカルチューブを使用して、チップを新鮮なNFWに3回浸します。
    3. 圧縮空気を使用して、圧縮空気を約60°から80°の角度で圧縮空気の全力で、チップの表面から約5cm離れたところからチップの表面を斜め(45°)に移動させます(図2E)。表面が濁っているように見える場合は、新鮮なNFWで洗浄を繰り返し、再度乾燥させます(曇った表面は通常、前の手順でセラミックが十分に洗い流されていないか、硬化していないことを意味します)。
    4. 150 μLのPLL溶液を塗布して、チップ表面全体を覆います。室温(22°C〜25°C)で10分間インキュベートします。これを 図 2D に示します。
    5. PLL溶液を取り除き、チップをヌクレアーゼフリー水で10〜15秒間2回洗浄します。
    6. 2回目の洗浄後、スライドの端を注意深く乾かします(チップに触れずに)。
    7. 圧縮空気を全力で使用し、チップの表面から約5cm離れたところからチップの表面を斜めに横切って約60°〜45°の角度で圧縮空気を使用してチップをしっかりと乾燥させます(図2E)。
      注:チップは30秒以内に完全に乾燥する必要があります。これより時間がかかると、DNB が妨害され、キャプチャにアーティファクトが発生します。
    8. 1時間以内に取り付けに進み、チップを乾いた状態に保ちます。
      注意: 乾燥後にチップ表面が曇っているように見える場合は、新しいNFWで洗浄し、乾燥プロセスを繰り返します。乾燥後にチップの表面にアーティファクトがある場合、その領域でキャプチャの問題が発生する可能性があります。組織がPLLを必要としない場合は、PLLを使用して接着することは避けてください。チップに触れると、cDNA放出前の捕捉領域に傷や喪失が生じたり、放出後の捕捉が不均一になったりする可能性があります。チップ表面の樹脂は、捕捉領域の斑点の損失につながります。チップを圧縮空気ノズルに近づけすぎると、結晶が発生し、チップ表面全体に損傷した DBN マークがスプレーする可能性があります。ただし、これはまれであり、通常はノズルがチップにほぼ接触しており、圧縮空気ボトルが冷たすぎる場合にのみ発生します。この手順は技術的に難しいため、評価チップを使用してこの手順を数回練習することをお勧めします。

4.組織の切片化と取り付け

  1. ステップ 2.1 および 2.2 で説明されているように、ワークスペースがクリーンであることを確認します。組織の切片化と取り付け中に、すべてのウォーターバスと氷に新しいブレードとNFWが使用されていることを確認してください。チップに直接触れず、チップの80%のみをティッシュで覆ってください。
    注:標準組織には5μm、高脂肪組織には4μmの厚さを使用することをお勧めします。該当する場合は、シリアルセクションのリボンを使用して、サンプル間のモダリティを一致させます。
  2. スライドを42°Cで3時間乾燥させ、蓋を開けた状態でオーブンまたはPCR装置で。次に、スライドを移すか、オーブンまたはPCRマシンで温度を37°Cに変更し、12〜48時間一晩焼きます。18時間前後の使用をお勧めします。
  3. オプションの停止点:乾燥後、スライドを乾燥剤で4°Cで最大1週間アルミ袋に密封してから、続行します。
    注:乾燥時間が長くなると、RNAの完全性が低下する可能性があります。乾燥時間が短すぎると、スライドへの組織接着が低下します。高温で焼くと、RNAの完全性が低下する可能性があります。スライドは、外部処理(ホスト解析など)のために出荷できます。ただし、輸送中の汚染の可能性が増加するため、マイクロバイオーム分析には出荷は推奨されません。

5. スライドを脱パラフィンする

  1. ステップ 2.1 および 2.2 で説明されているように、ワークスペースがクリーンであることを確認します。
  2. 脱パラフィン処理とStereo-seqプロトコル用の試薬を準備します。
    1. 必要な試薬を分注します:50 mLコニカルチューブに30 mLのキシレンを2個、50 mLのコニカルチューブに30 mLの100%エタノールを2個入れます。
    2. 次の希釈試薬をNFWで調製します:チップあたり96%エタノール(2つのコニカルまたは1 mLが必要)、チップあたり90%エタノール、チップあたり80%エタノール、チップあたり70%エタノール、チップあたり50%エタノール、チップあたり30%エタノール、20x溶液から2.5 mLの5x生理食塩水-クエン酸ナトリウム(SSC)、5 mLの0.01N HCl(0.1N HClをNFWでpH 2に希釈します)。エタノール希釈の場合は、50 mLのコニカルチューブに30 mLの溶液を1つ、シリコンガスケットを使用する場合は1.5 mLチューブに500 μLの溶液を調製します。
    3. 次の溶液を調製し、氷上に保管します:i)5x溶液から32.5 mLの0.1x SSC(30 mLの溶液を円錐形のチューブに保持し、残りの2.5 mLを将来の使用のために5 mLチューブに入れます)、ii)400 μLの0.1x SSCを5%RIで氷上に置きます。
    4. 0.1 N HClで以下の希釈試薬を調製します。
      1. 市販の凍結乾燥試薬に 1 mL の 0.1 N HCl を加えて、10x 透過処理試薬 (PR) 溶液を調製します。
        注:氷上に1時間だけ保管し、将来の使用のために必ずアリコートし、-20°Cで凍結してください。
      2. 500 μLの1x PR溶液を調製します(10x PR溶液のアリコートを0.01 N HClで希釈し、氷上で最大6時間保持します)。
        注:ペプシンベースの酵素はpH 2で最適に機能するため、0.01 N HClのpHがpH 2.0の10%以内であることが重要です。
  3. スライドをキシレン(推奨)に2回、それぞれ20分間浸すことにより、スライドを脱パラフィンします。
  4. すぐに、サンプルをエタノールで再水和します(100%、96%、2ラウンド、各5分、続いて90%、70%、50%、および30%を1ラウンド、2分)。最後に、NFWで1分間水分補給します。エタノール希釈の場合、マイクロバイオーム研究用のサンプルを調製する場合は、各スライドに50 mLの円錐形チューブに30 mLの溶液を使用し、非マイクロバイオームサンプルを調製する場合は、2枚のスライドごとに30 mLを使用します。その後のすべての希釈液では、50 mLのコニカルチューブに30 mLの溶液を調製するか、シリコンガスケットを使用する場合は、1 cm2チップあたり500 μLの溶液を使用してチップ領域を完全に覆います。
    オプション:図2F-Hに示すように、100%エタノールステップの後にシールを作成するために、チップの周囲に3チャンバー取り外しスライドからシリコンチャンバーを配置することをお勧めします。これにより、より少量の試薬を使用できるようになり、チップが損傷するリスクが軽減されます。あるいは、50 mLのコニカルチューブを使用して、手順全体を通してStereo-seqスライドを完全に沈めることもできます。

6. (オプション)核イメージングとssDNA染色

注:6.1で使用する前に、FFPE脱架橋試薬を室温(~25°C)に到達させてください。他の染色溶液も可能ですが、トランスクリプトームデータの単一細胞セグメンテーションと細胞ビニングには現在、蛍光核染色が必要です。

  1. 一本鎖DNA(ssDNA)色素を用いた蛍光染色
    1. Qubit ssDNA試薬を5x SSCバッファーで1〜2チップあたり1:1の希釈で希釈することにより、SSCバッファー中で2 μLのssDNA染色溶液を調製します。
      注:ssDNA希釈は、イメージング時に使用される顕微鏡に基づいて変化する可能性があります。 したがって、新しい顕微鏡は、評価チップとテスト組織を使用して設定されたssDNA色素希釈液でテストし、最適なダイナミックレンジを決定する必要があります。
    2. RNase Inhibitor(RI)を1:20に希釈し、ssDNA希釈液を1:200に希釈し、残りの5x SSCを使用して、染色液(チップあたり200 μL)のマスターミックスを作成します。
    3. 染色液(チップあたり150 μL)を加え、室温で暗所で5分間インキュベートします。ピペットを使用して、チップの角から染色液をそっと取り除きます。
      注:取り外し可能なシリコンチャンバーを使用する場合は、ssDNA色素混合物でチップを染色する前に、シリコンチャンバーを取り外してください。
    4. チップを0.1x SSC(毎回チップあたり150 μL)で10〜15秒間2回洗浄します。スライドの端を2回目の洗浄後、レンズペーパーで慎重に乾かします(チップに触れずに)。
    5. ~3〜5 μLのグリセロール(倒立顕微鏡では使用量が少なくなります)を加えてクローバースリップを取り付けます(気泡に注意してください)。
      注:正しい量のグリセロールがスライド領域に塗布されていることを確認してください(通常、1 cm2チップの場合は約4 μL)。グリセロールを過剰に使用すると、スライドを垂直に保持したときにカバーガラスがずれる可能性があります。グリセロールの使用量が少なすぎると、カバーガラスを除去するときに組織損傷のリスクが高まり、気泡が発生する可能性があり、イメージングや単一細胞セグメンテーションの結果に悪影響を与える可能性があります。
    6. カバーガラスを約1cmの高さからチップに落とします。介在顕微鏡を使用する場合は、垂直に保持したときにカバーガラスが滑り落ちないように注意してください。グリセロールを追加せずに再マウントする場合は。
    7. ssDNA染色組織の蛍光画像を、画像タイル間に10%のオーバーラップで広視野顕微鏡でキャプチャします。
      注:10倍の対物レンズを使用して、広視野顕微鏡で9〜13ポイントの手動フォーカスマップを作成することをお勧めします。共焦点顕微鏡を使用できますが、組織やチップ全体の焦点の変化に対してはるかに敏感です。
    8. ImageJなどの画像処理ソフトウェアで、理論上のオーバーラップを利用して各タイルのおおよその位置を生成し、その後ピクセルマッチング計算オーバーラップを実行して画像タイリングを微調整します
    9. StereoMapソフトウェアで画像を処理し、続行する前に画像QCに合格したことを確認してください。
    10. Stereo-seqスライドを30 mLの0.1x SSCにカバーガラスが剥がれるまで浸します。

7. 脱架橋プロセス

注意: このステップでは、チップに触れたり傾けたりせず、そっとピペットでピペットを打ってください。

  1. FFPE脱架橋試薬が暖かい室温(~25°C)にあることを確認し、溶液を濁らせる粒子がないことを確認します。粒子が見える場合は、55°Cに加熱し、30°Cに冷却してから使用してください。
  2. 次の設定でサーモサイクラーの電源を入れます:平衡化のために30°C(85°Cの加熱蓋);95°Cで30分間のインキュベーション。4°Cの無限保持時間。
  3. カセットガスケットを組み立て、Stereo-seqチップスライドをカセットに入れます。
  4. FFPE脱架橋試薬(チップあたり400 μL)をチップを含むカセットのウェルに加えます。カセットにシーリングテープを貼り、しっかりと密閉されていることを確認します。
  5. ステップ7.2から95°Cで30分間のインキュベーションを開始します。10分が経過したら、10 mLのメタノールを15 mLの容器に入れます(スライドあたり約1 mLが必要になります)、-20°Cの冷凍庫に入れます。
  6. サーモサイクラーから切りくずを慎重に取り除き、カセットをベンチに移し、シーリングテープをはがします。
  7. ピペットを使用してFFPE脱架橋試薬を取り出し、廃棄します。すべての脱架橋試薬が取り除かれたら、カセットとガスケットを取り外して廃棄します。
  8. Stereo-seqスライドを室温~23°Cで平衡化します。 滅菌ヒュームフードの下で、スライドの端を乾かし、新しいシリコンチャンバー(該当する場合)を塗布します。-20°Cの冷凍庫から500 μLの冷却メタノールを加え、セクション全体が20分間完全に浸漬されていることを確認します。
    注:あるいは、Stereo-seqスライド全体を、30 mLの冷却メタノールで満たされた50 mLの円錐形チューブに沈めることもできます。
  9. メタノール固定終了の約5分前に使用する前に、37°Cの乾燥ブロック上で1x PR溶液を10分間予熱します(ステップ7.8)。
  10. 固定が完了したら、スライドを滅菌ヒュームフードに移動します。スライド上の余分なメタノールを拭き取り、チップ上の残りのメタノールが蒸発するのを待ちます(~5分)。新しいカセットとガスケットを組み立てます。メタノールが完全に蒸発したら、Stereo-seqチップスライドをカセットに入れます。

8. 透過処理と逆転写

注意: 手順8.1〜8.11では、ゆっくりとピペットをし、チップに触れないでください。過剰な圧力は、DNBに拡散やマークを引き起こします。

  1. 200 μLの透過処理試薬をチップに加えます。Stereo-seqスライドカセットにシーリングテープを貼り、しっかりと密閉されていることを確認します。
  2. 37°Cで30分間インキュベートします。
  3. 各スライドに380 μLの0.1x SSCと20 μLのRI(RNA阻害剤)を添加して、洗浄バッファーを調製します。スライドごとに400 μLを作り、使用するまで氷の上に置いてください。
  4. FFPE逆転写(FFPE RT)用の試薬を取り出し、以下をすべてスピンダウンし、酵素ミックス、オリゴ、および二量体を氷上に保持します。FFPE RTバッファーを室温(~23°C)に温めます。
  5. 透過処理が終了する5分前に、FFPE RTミックスのチップあたり200 μLを調製します。FFPE RTバッファー(158 μL)、FFPE RT酵素ミックス(30 μL)、FFPE RTオリゴ(10 μL)、およびFFPEダイマー(2 μL)を追加します。これをやさしく混ぜて氷の上に置いておく。
  6. チップをサーモサイクラーに乗せたまま、インキュベーション温度を室温(~23°C)に変更します。シールを取り外し、1x PR 溶液をそっと廃棄します。
  7. 1 cm2 チップあたり200 μLの0.1x SSC(5%RIを含む)でチップを非常に穏やかに洗浄します。
  8. チップの角から0.1x SSC(5%RIを含む)洗浄液を取り除きます。
  9. 200 μLのFFPE RT溶液をチップの角に加えます。
  10. Stereo-seqスライドカセットにシーリングテープを貼り、しっかりと密閉されていることを確認します。そうしないと、蒸発により収量が低下します。
  11. プロトコルFFPE RTインキュベーション等温反応を42°Cで開始し、45°Cの加熱蓋で(5〜24時間)。
    注:12〜16時間インキュベートし、実験全体で一貫性を保つことをお勧めします。

9. cDNAの放出と精製

注意: 手順9.6〜9.7では、ゆっくりとピペットをし、チップに触れないでください。過剰な圧力は、DNBに拡散やマークを引き起こします。

  1. cDNA放出バッファーを55°Cで温め、形成された可能性のある沈殿物を溶解することにより、400 μLのcDNA放出バッファーを調製します。
  2. cDNA放出バッファーを暖かい室温(25°C)まで平衡化します。氷の上に置かないでください。
  3. 使用前に卓上遠心分離機でcDNA放出バッファーとcDNA放出酵素を100 x g でスピンダウンします。
  4. 380 μLのcDNA放出バッファーに20 μLの放出酵素を加えて、cDNAバッファーを調製します。
  5. チップをサーモサイクラーに乗せたまま、インキュベーション温度を室温(~23°C)に変更します。シールを取り外し、FFPE RT溶液をゆっくりと取り外して廃棄します。
  6. チップを1回、驚くほど穏やかに、チップあたり0.1x SSC(200 μL)で洗浄します。
  7. チップの角から0.1x SSCを取り除き、非常に慎重にピペッティングします。
  8. 調製したcDNA放出液400 μLを各チップに加えます。
  9. Stereo-seqsスライドカセットをシーリングテープ(またはPCRカバー)をカセットに貼り付けてシールします。蒸発、漏れ、汚染を防ぐために、カセットがしっかりと密閉されていることを確認してください。
  10. 蓋を60°Cに加熱した状態で、55°Cで≥5時間(最低5時間から24時間まで)インキュベートします。
    注:5〜7時間インキュベートするか、2時間で実験間で一貫性を保つことをお勧めします。

10. cDNA放出ミックスを収集します

  1. NFWを37°Cに予熱します(1 cm2のチップあたり少なくとも500 μL)。
  2. シールを取り外し、組織上のチップの各角と中央を激しくピペットしますが、組織をこすったり触れたりしないでください。チップからすべてのcDNAリリースミックスを収集し、1.5または2.0 mLの遠心分離管に移します。各チューブにチップ識別(チップID)番号を記録します。
  3. 350 μL の予熱した NFW をチップ表面に直接加えます。そして、もう一度、小さなピペット(P100またはP200)で激しくピペットを出し、チップを傾けてせん断力をさらに加えますが、組織に触れたり、チップを削ったりしないでください。
  4. ステップ10.3の洗浄液(350 μL)とステップ10.2のcDNAリリースミックス(400 μL)を組み合わせます。必ず1つのチップのサンプルのみを組み合わせてください。
  5. 100 μLのNFWをチップ上に置き、Stereo-seqチップスライドをカセットに密封し、プロトコルが終了するまで冷蔵庫に保管します。
    注:収量が低い場合は、cDNAを再放出することを検討してください。チップ上のDNAの存在は、ssDNA色素とカバーガラスの有無にかかわらず再イメージングを使用して評価できます。

11. cDNAビーズをクリーンアップして収集します

  1. ステップ10.4のcDNAを同量の固相可逆固定化(SPRI)ビーズで再懸濁します。ビーズが溶液全体に均一に分布するまで混合し、~100 bpを超えるDNAフラグメントを選択します。
  2. 27°C〜37°Cの温度で10分間インキュベートします(30°Cを推奨)。
    1. インキュベーション中。処理された2つのチップごとに、NFWで5mLの80%新鮮なエタノールを調製します。
  3. インキュベートしたビーズミックスを入れたチューブを取り、卓上遠心分離機で100 x g で短時間スピンダウンします。
  4. チューブを磁気分離ラックに置き、少なくとも5分間インキュベートします(液体が透明になるまで)。
  5. ビーズを乱さずに上清を慎重に取り除き、清潔なラベルの付いたチューブに保存します。cDNA放出をチップIDと日付で標識します。
  6. ビーズを乱すことなく1.5 mLの80%エタノールをチューブに加え、エタノールを除去する前に30秒間インキュベートします。
  7. ステップ11.6をもう1回繰り返し、今度はビーズを乱さずに小さなピペットチップを使用してできるだけ多くのエタノールを除去します。
  8. チューブ内のビーズが反射しなくなるまで自然乾燥させます。時期は変動しますので、収量が低くなる乾燥(ひび割れ)を防ぐために定期的にチェックしてください。
    注意: 部屋の湿度と温度を測定します。高温(27°C)および低湿度(20%未満)では、ビーズは非常に速く乾きます(3〜5分)。低温(23°C)と高湿度(40%以上)では、ビーズの乾燥ははるかに遅くなります(7〜15分)。
  9. ビーズチューブをマグネットラックから取り外し、22 μLのNFWを加え、ボルテックスで混合します。
  10. 27°CのドライバスまたはPCR装置で5〜15分間インキュベートします。
  11. 短時間遠心分離し、液体が透明になるまでチューブを磁気分離ラックに戻します(2〜5分)。
  12. cDNAを含む上清21 μLを、ビーズを乱すことなく、サンプル標識された0.2 mL PCRチューブに移します。
  13. 各チューブについてステップ11.9〜11.12を繰り返し、合計42 μLのcDNAを収集します。cDNAの増幅を直接続行します(ステップ12.1〜12.8)。
    注:増幅開始が遅れると、収量が低下し、短いリードが増加し、一本鎖DNAテンプレートが分解されます。

12. cDNA増幅

  1. cDNA増幅ミックスとFFPE cDNAプライマーを冷凍庫から取り出し、湿った氷の上に置いて解凍します。
  2. cDNA増幅ミックスとFFPE cDNAプライマーを卓上遠心分離機で~100 x gでスピンダウンします。
  3. (ステップ11.13)の42 μLから各cDNAチューブに50 μLのcDNA増幅液と8 μLのFFPE cDNAプライマーを加え、チューブの変形を防ぐためにフラットキャップアダプターを備えたサーモサイクラーに入れます。
  4. cDNA増幅のためにサーモサイクラープログラムを実行します:初期変性:95°Cで5分間。サイクリング: [98 °C で 20 秒間、58 °C で 20 秒間、72 °C で 3 分間] × 15 サイクル。最終延長:72°Cで5分間。保持温度:12°C(すぐに処理する場合)/ 4°C(一晩保持する場合)。
  5. ビーズクリーンアップ前後の1 μL cDNAのDNA濃度を測定します。
    注:クリーンアップ前のcDNA産物の量は、1cm²チップごとに1μgを超えるように計算する必要があります。クリーンアップ後の濃度は少なくとも10 ng / μLである必要があります。収率が低いと、通常、ライブラリの多様性が低下します。この段階での大幅なサンプル損失は、DV200 スコアと相関しています。ただし、DV200 は結果の完全な予測因子ではありません。
  6. ステップ12.4のPCR産物を使用して、ステップ11からcDNAビーズクリーンアップ(ビーズクリーンアップ)を繰り返し、3つの変更を加えます:より小さなPCR磁気ラックを使用し、ステップ11.6で200 μLの80%エタノールのみを追加し、ステップ11.9で22 μLのTris-EDTA(TE)バッファー(pH 8)に再懸濁します。
  7. ビーズを20 μLのNFWを入れたチューブに保存し、サンプル名、バーコード、日付、チップIDをラベル付けします。
  8. フラグメントアナライザーを使用してcDNAフラグメントの分布を測定します。フラグメントサイズの範囲は250〜400 bpである必要があります。フラグメントが小さすぎる場合は、ビード洗浄を繰り返しますが、27°Cではなく室温(~25°C)を使用します。
    オプションの停止ポイント:cDNAを測定した後、-20°Cで最大1か月間、-80°Cで最大1年間保存できます。ビーズは、NFWで4°Cで1週間保存できます。 ビーズを凍らせないでください。

13. 図書館の準備(4日目)

  1. 増幅反応ミックスの調製
    1. ライブラリPCR増幅液、ライブラリバーコードセット、cDNA産物、およびNFWを取り除きます。cDNAと試薬を室温で氷と水で解凍し、100 x g で10秒間スピンダウンします。
  2. PCRバーコードプライマーミックス25 μLごとにライブラリバーコード戦略を決定します。
    注:このシーケンサーでは、すべての塩基をバーコードセットの各位置で均等に表す必要があります。したがって、これと互換性のあるほとんどの市販キットは、事前定義されたバーコードテトラッド(4個セット)で設計されています。これらのテトラッドは、シーケンシングレーンをまたいで分割するときに個々のサンプルに適用することも、レーンごとに1つのサンプルをシーケンシングするときに1つのサンプルにプールすることもできます。バランスのとれたバーコードは、シーケンサーによって生成される使用可能なデータの量を減らすため、バランスの取れたバーコードを維持することが不可欠です。
  3. 20 ngのcDNAの体積を決定します(たとえば、10 ng / μLには2 μLが必要です)。これを使用して、希釈したcDNAのNFW(25 μL)溶液(~1 ng / μLに希釈)を作ります。
  4. ライブラリ増幅ミックス(50 μL)と希釈したcDNAをNFW(25 μL)およびPCRバーコードプライマーミックス(25 μL)を0.2 mL PCRチューブに組み合わせます。
  5. ピペッティングでウェルを混合し、100 x g で10秒間スピンダウンします(ボルテックスしないでください)
  6. 0.2 mL PCRチューブをサーモサイクラーに入れ、チューブが押しつぶされないようにインサートがあることを確認してください。
  7. cDNA増幅のためにサーモサイクラープログラムを実行します:初期変性:95°Cで5分間。サイクル: [98 °C で 20 秒、58 °C で 20 秒、72 °C で 3 分間] × 8 サイクル。最終延長:72°Cで5分間。保持温度:12°C(すぐに処理する場合)/一晩保持する場合は4°C。
    注:ライブラリーを調製するために、さまざまな量のインプットcDNAを使用することが可能です。ただし、使用する量は増幅に必要なPCRサイクル数に影響します。たとえば、ベンダーは 20 ng のインプット DNA と 8 サイクルの使用を推奨しています。7サイクルで40ng、6サイクルで80ngを使用することもできます。20 ng未満または80 ngを超えるインプットcDNAの使用は推奨されません。

14. ライブラリ増幅ビーズクリーンアップ

  1. 手順12.5で行ったように、生ライブラリ製品を定量化します。
  2. ステップ13.7の生ライブラリ産物を使用して、ステップ11からビーズクリーンアップ(ビーズクリーンアップ)を3つの変更で繰り返します:0.8:1の比率のビーズと製品を使用する、より小さなPCR磁気ラックを使用する、ステップ11.7と比較して200 μLの80%エタノールのみを使用し、ステップ11.9で22 μLのTEバッファー(pH 8)に再懸濁します。1cm2 チップ2個あたり、新鮮な80%エタノールを約1mL用意します。
  3. オプションの停止点:ライブラリーを測定した後、-20°Cで最大1ヶ月間、-80°Cで最長1年間保存できます。ビーズはNFWで4°Cで1週間保存できます。 ビーズを凍らせないでください。

15. Stereo-Seq Random Oligonucleotide Primed DNBのシーケンシング用DNBSEQ-T7RSシステム

  1. DNBSEQ-T7RS システムで PE75 キットを使用して、サイクルを読み取り 1 に 25、読み取り 2 に 62 (PE25+62) として割り当て、その後に 10 bp のインデックスを割り当てます。
    1. 最初の読み取り(25サイクルのうち1サイクルの読み取り)は、チップベースのバーコードから空間チップID(CID)または場所固有の情報をキャプチャします。
    2. 2回目の読み取り(62サイクルのうち2サイクルを読み取り)では、ランダムな6 bp配列である分子識別子(MID)が、位相補正とバーコードオフセットキャリブレーションに使用される3つの追加のダークサイクルで遺伝子インサートに直接結合されます。これに続いて、リード2からの30〜59 bpの遺伝子挿入が続き、既知のゲノムまたはトランスクリプトームへのマッピングによって同定されます。
      注:より長い遺伝子挿入が可能ですが、異なるペアエンドキットとマッピングワークフローの変更が必要になります。
    3. 逆多重化のインデックスサイクルは、ステップ13.2でプールされたシーケンスバーコードに基づいて10 bpsをカバーします。
      注:75 PEフローセルの標準的なシーケンス時間は約10〜12時間です。シーケンシングは、DNBSEQ-T7RSまたは同様のシーケンシング装置を必要とするため、ほとんどのラボでは社内プロセスではなく、シーケンシングコアまたは商業施設で行われることがほとんどです。

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結果

以下のデータは、SAWパイプラインを使用して単一細胞セグメンテーションを実行し、FFPE切片からtRNA(TRDMT1)などの非ポリアデニル化RNAにマッピングする機能を示しています。Stereo-seqの偏りのないデータにより、mRNAだけでなく、tRNA、rRNA、および非宿主RNA(該当する場合)の重要性を調べることができます。SAWパイプライン16からの直接出力と、図3A-GのStereo-seq出力の品質評価のためのステレオピーを使用して、セルビン(SAW核画像を介して作成された単一核オーバーレイ)から、標準的な空間概要、遺伝子発現、クラスタリング、QCを生成しました。検出される転写産物の数は組織の種類によって異なります:免疫密集組織は通常、転写物数が少なく(セルビンあたり約100遺伝子)、異数性腫瘍細胞はセルビンあたり1,000もの転写...

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ディスカッション

Stereo-seq プロトコルは非常に詳細であり、特に特定の予防措置が必要なマイクロバイオームまたは非宿主プロファイリングで成功を確実にするために、精度、タイミング、クリーンな環境を必要とするいくつかの重要なステップが含まれます。

すべてのステップでヌクレアーゼフリーの水を使用する必要があり、キャプチャーチップにサンプルと試薬以外のものに触れてはなりません。カセットアセンブリを使用するときは細心の注意を払い、練習用チップの使用には時間がかかります。組織領域に傷があると、組織の空間分解能が損なわれ、トラックラインに傷があると、空間分解能やサンプルの自動位置合わせが妨げられる可能性があります。さらに、膵臓や肝臓などの高RNase/DNase組織では、切片化中の水分交換が推奨されます。さらに、RNAの品質を維持するために、FFPE組織ブロックを少量のワックスシールで顔面に4°Cで保存し、分解を防ぐためにデシケーターに保管することをお勧めします。この方法で保管された場合でも、サンプルは表面で再水和し、

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開示事項

著者らは、この研究はComplete Genomicsによって資金提供されていないことを宣言します。ただし、Complete Genomics はこの記事の出版費用を支援しています。 彼らには高度なコピーも内容への入力も与えられませんでした。

謝辞

この研究は、卵巣がん研究同盟(OCRA 811621および891490)、Sie財団、およびStephanie C. Stelter Endowment Fundから部分的に資金提供されました。この研究は、米国国立衛生研究所がMDアンダーソンのがんセンター支援助成金P30 CA016672とジャレッド・バークスのNCIの研究スペシャリスト1 R50 CA243707-01A1を通じて部分的に支援している、フローサイトメトリーおよび細胞イメージングコア施設、獣医学および外科部門および先端ゲノミクステクノロジーコアと共同で実施されました。

また、Compete Genomics、特に技術トレーニングとトラブルシューティングを提供してくれたBrandon VanderbushとTanzeen Yusuff、およびJia "Jackie" Zhao、Yongfu Wong、Erin Petrilliにも感謝します。著者は、FFPE OMNIとシーケンシング試薬のセット、およびT7早期アクセスプログラムへのアクセスをComplete Genomicsから割引価格で受け取りました。さらに、この研究で使用するためにいくつかの試薬が無料で提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mL遠心分離機チューブ 通常のDNAase/RNAaseサーモフィッシャーサイエンティフィック/インビトロジェン3456試薬を混ぜるために(他のバンドでも問題ありません) 
100%エタノールシグマ・オルドリッチE7023分子級
15mL円錐形無菌ポリプロピレン遠心分離機管サーモフィッシャーサイエンティフィック/インビトロジェン339650アリコート に使われる;
20倍の濃縮 生理食塩水クエン酸ナトリウム(SSC)バッファーシグマ・オルドリッチS6639-1L以前はステイン用にSSCを5倍、洗濯ステップやカバースリップの除去用にSSCを1倍作っていました。
2100バイオアナライザー機器アジレント割引された装置:バイオアナライザー
3井戸チャンバー、取り外し可能イビディ80381再水和とメタノール固定時の体積を減らすためのシリコーンチャンバー。
405nm UV光源様々な該当なしUV樹脂の硬化用
50mL円錐形滅菌ポリプロピレン遠心分離機管サーモフィッシャーサイエンティフィック/インビトロジェン339652アリコットおよび脱脂に使用される 
70%無菌イソプロパノールアルコールTexwipe TX3270表面除染のために、nbsp;
Agilent 高感度DNAキットアジレント5067-4626バイオアナライザーによるcDNAおよびライブラリの特性評価
アジレント RNA 6000 ピコキットアジレント5067-1513RNAのバイオアナライザー特性評価のために
アルミホイル様々な該当なしSSD染色時のスライドを覆うためです。
ベックマン・コールター SPRIセレクトベックマン・コールター生命科学B23317/B23318/B23319SPRIビーズcDNAとライブラリークリーンアップ
ブリーチ様々な該当なしマイクロバイオーム汚染を除去する洗浄作業台
CONSTIX密封フォーム綿棒コンテック19161023精密な樹脂洗浄のために
カバースリップシグマ・オルドリッチBR470045-2000EA
乾燥剤パック様々な該当なしRNaseフリー、ダストフリーの乾燥剤パックです。
使い捨てフェイスマスクサーモフィッシャーサイエンティフィック/インビトロジェン12-888-001保護、RNAase汚染および無菌性 
DNA消去ワイプシグマ・オルドリッチL9060-250EA表面を拭き取る(ウェットティッシュ)による除染
DNAロバインドチューブ 1.5mLエッペンドルフ 22431021cDNAの採取およびライブラリポスト増幅に使用されます。
DNAロバインドチューブ2mLエッペンドルフ 22431048増幅前のcDNA採取に使用されます。
DNBSEQ OneStep DNB メイク試薬キット完全ゲノミクス940-001891-00DNAナノボール(DNB)製剤および増幅用試薬
DNBSEQ-T7RS クリーニング試薬キット完全ゲノミクス940-001903-00シーケンス完了後の洗浄用カートリッジ
DNBSEQ-T7RS DNBロード試薬キット完全ゲノミクス940-001894-00DNBをフローセルにロードするための試薬とプレート
DNBSEQ-T7RS シーケンシングフローセル完全ゲノミクス940-001902-001レーン/フローセル
DNBSEQ-T7RS ステレオシークエキュー可視化試薬キット完全ゲノミクス940-001893-00シーケンス用のカートリッジと試薬。
DNBSEQ-T7RSシステム完全ゲノミクスこのステレオシークエクサライゼーションセットはDNBSEQ技術を利用しています。シーケンス実行はDNAアンカーのハイブリダイゼーションから始まり、その後、組合せプローブアンカーシーケンシング(cPAS)化学を用いて蛍光プローブをDNAナノボール(DNB)に取り付けます。最後に、高解像度イメージングシステムが蛍光信号を捉えます。光信号のデジタル処理後、シーケンサは高品質かつ正確なシーケンス情報を生成します。
ダストオフ圧縮空気朝M-6318このブランドまたは類似の推進剤を持つものを使うことが重要です。
エッジライト・ミクロトームブレードサーモフィッシャーサイエンティフィック/インビトロジェン4280L組織学 - サンプルの区画に用いられます
防爆冷凍庫様々な該当なしメタノール固定の前後でメタノールを冷却すること。
組織学用ブラシ様々な該当なし組織学 - サンプルの区画に用いられます
塩酸シグマ・オルドリッチ2104-50ML0.01 N HCl(pH 2)での前複化酵素の希釈用。HCl溶液の標準ストック濃度は0.1 Nです。
イメージングシステム様々な該当なしGC ストミクスイメージャー、レシア、エボ・レボリューション
Invitrogen RNaseZap RNase 除染溶液サーモフィッシャーサイエンティフィック/インビトロジェンAM9780RNAs汚染を除去する洗浄作業ステーション
キムテック・デリケート・タスクワイパー キムテック34155作業台や機器、ピペットなどを乾燥させるために。
白衣様々な該当なし個人防護具(PPE)
レンズペーパーサーモフィッシャーサイエンティフィック/インビトロジェン11-997スライドをしっかりせずに乾燥させるための様々な作品
ルックアウトDNA消去ワイプシグマ・オルドリッチL9060PCR汚染を除去するクリーニングワークステーション
マゼンティック分離ラック 5uL - 0.2 Permagen LabwareMSRLV08PCRチューブ内のビーズ分離
マグジェットラック 12×1.5 mLサーモフィッシャーサイエンティフィック/インビトロジェンMR021.5 mLチューブでのビーズ分離
手動ロータリーミクトミーライカRM2235組織学 - サンプルの区画に用いられます
メトナール≥99.9%、免疫蛍光およびHPLCに適しているシグマ・オルドリッチ34860固定用(HPLCグレードが必要)
マイクロ解離鉗子シグマ・オルドリッチF4142-1EA組織学 - サンプルの区画に用いられます
マイクロピペット様々な該当なし
分子グレードのヌクレアーゼフリー水、非DPEC処理水様々な該当なしビーズの希釈と浸出
ニトリルグローブ様々な該当なしPPE
オーブン様々な該当なしチップスを焼くために
キャップ付きのPCR 0.2 mLチューブ様々な該当なしPCR用途
PCRカバー 様々な該当なし付属のカバーの接着剤が弱い場合は交換
PCRフード&ワークステーションミステアMY-PCR24-010プレPCR(RNAからcDNAへの移行)ステップについて
pHメーター様々な該当なしHClのpHを確認するためのpHメーター。
ポリLリシン溶液シグマ・オルドリッチA005-Cチップへの組織接着を高めるためにオプション
量子ビット4フルオロメーターサーモフィッシャーサイエンティフィック/インビトロジェンQ33226内挿術;DNA量測定
量子ビット dsDNA 定量分析キットサーモフィッシャーサイエンティフィック/インビトロジェンQ32851cDNAおよびライブラリー定量の測定
Qubit ssDNAアッセイキットサーモフィッシャーサイエンティフィック/インビトロジェンQ10212ssDNA染色(使用した染料のみ)
RNAseフリーアイスブロック様々な該当なし組織学 - サンプルの区画を分けて区画を整理し、区画の前にブロックを水和させる際に用いられます
RNaseZap RNase 除染溶液サーモフィッシャーサイエンティフィック/インビトロジェンAM9782RNAsを破壊する表面除染溶液
RNeasy FFPEキットキアゲン73504号機および19093RNA抽出&DV200の測定およびnbsp;
スカルプト ウルトラホワイトレジンシラヤ・テック該当なし高温耐性UV硬化樹脂
Stereo-seq 16 バーコードライブラリ準備キットSTOmics/完全ゲノミクス111KL160ステレオシーケンスOMNI FFPEライブラリの構築
ステレオシークエンFFPEアクセサリーキットSTOmics/完全ゲノミクス310AK002211SN114キットの空間OMNIアクセサリー部品
ステレオシークエンNチップスライド(1cm x 1cm)STOmics/完全ゲノミクス210CN114211SN114キットの一部である空間OMNIチップ
ステレオシークエンスPCRアダプター STOmics/完全ゲノミクス301AUX001PCRハイブリダイゼーションのステップは、PCRmaxのSituハイブリダイゼーションアダプターに似た3つの対応に合わせて修正されました。
ステレオシークレットトランスクリプトミクスNキットSTOmics/完全ゲノミクス211KN114211SN114キットの一部である空間OMNIリージェント
外科設計汎用産業用カミソリ刃サーモフィッシャーサイエンティフィック/インビトロジェン13-812-236組織学 - サンプルの区画に用いられます
TEバッファー溶液pH 8.0シグマ・オルドリッチ8890cDNAとライブラリーの脱出用
サーマルサイクラーBioRad/その他1861096 /12015392 / 様々な手動蓋付きまたはディープウェルオプション(T100サーマルサイクラー/PTC、テンポ、ディープウェルサーマルサイクラーなど)を備えたPCRマシン
サーモサイエンティフィック Orion オールインワン pHバッファーキットサーモフィッシャーサイエンティフィック/インビトロジェン13-624-500
組織浮選バス - デジタルXH-1003初演NC0779538組織学 - サンプルの区画に用いられます
UV保護メガネ様々な該当なしUV硬化時の安全性のために
キシレンシグマ・オルドリッチ247642脱硫黄化のために

参考文献

  1. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  2. Lähnemann, D., et al. Eleven grand challenges in single-cell data science. Genome Biol. 21 (1), 31(2020).
  3. Molla Desta, G., Birhanu, A. G. Advancements in single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics: transforming biomedical research. Acta Biochim Pol. 72, 1-12 (2025).
  4. Fang, S., et al. Computational approaches and challenges in spatial transcriptomics. Genomics Proteomics Bioinformatics. 21 (1), 24-47 (2023).
  5. Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-cell RNA-seq technologies and related computational data analysis. Front Genet. 10, 317(2019).
  6. Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell RNA sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 882114(2022).
  7. Yu, X., Abbas-Aghababazadeh, F., Chen, Y. A., Fridley, B. L. Statistical and bioinformatics analysis of data from bulk and single-cell RNA sequencing experiments. Methods Mol Biol. 2194, 143-175 (2021).
  8. Ma, Y., Zhou, X. Spatially informed cell-type deconvolution for spatial transcriptomics. Nat Biotechnol. 40 (9), 1349-1359 (2022).
  9. Zhou, Z., Zhong, Y., Zhang, Z., Ren, X. Spatial transcriptomics deconvolution at single-cell resolution using Redeconve. Nat Commun. 14 (1), 428(2023).
  10. Wei, R., et al. Spatial charting of single-cell transcriptomes in tissues. Nat Biotechnol. 40 (8), 1190-1199 (2022).
  11. Cheng, M., et al. Spatially resolved transcriptomics: a comprehensive review of their technological advances, applications, and challenges. J Genet Genomics. 50 (9), 625-640 (2023).
  12. To, A., Yu, Z., Sugimura, R. Recent advancement in the spatial immuno-oncology. Semin Cell Dev Biol. 166, 22-28 (2025).
  13. Chen, A., et al. Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays. Cell. 185 (10), 1777-1792.e21 (2022).
  14. McKellar, D. W., et al. Spatial mapping of the total transcriptome by in situ polyadenylation. Nat Biotechnol. 41 (4), 513-520 (2023).
  15. Kuemmerle, L. B., et al. Probe set selection for targeted spatial transcriptomics. Nat Methods. 21 (12), 2260-2270 (2024).
  16. Gong, C., et al. an efficient and accurate data analysis workflow for stereo-seq spatial transcriptomics. Gigabyte. 2024, 1-12 (2024).
  17. Zhou, Y., Jia, E., Pan, M., Zhao, X., Ge, Q. Encoding method of single-cell spatial transcriptomics sequencing. Int J Biol Sci. 16 (14), 2663-2674 (2020).
  18. Patel, P. G., et al. Reliability and performance of commercial RNA and DNA extraction kits for FFPE tissue cores. PLoS One. 12 (6), e0179732(2017).
  19. Zhao, Y., et al. Stereo-seq V2: Spatial mapping of total RNA on FFPE sections with high resolution. Cell. , (2025).
  20. Russell, A. J. C., et al. Slide-tags enables single-nucleus barcoding for multimodal spatial genomics. Nature. 625 (7993), 101-109 (2024).
  21. Stenbeck, L., Taborsak-Lines, F., Giacomello, S. Enabling automated and reproducible spatially resolved transcriptomics at scale. Heliyon. 8 (6), e09651(2022).
  22. Vol. Rev A. , 10X Genomics. Pleasanton, CA. (2022).
  23. Su, G., et al. Spatial multi-omics sequencing for fixed tissue via DBiT-seq. STAR Protoc. 2 (2), 100532(2021).
  24. Stickels, R. R., et al. Highly sensitive spatial transcriptomics at near-cellular resolution with Slide-seqV2. Nat Biotechnol. 39 (3), 313-319 (2021).
  25. Groelz, D., Viertler, C., Pabst, D., Dettmann, N., Zatloukal, K. Impact of storage conditions on the quality of nucleic acids in paraffin embedded tissues. PLoS One. 13 (9), e0203608(2018).
  26. Yi, Q. Q., et al. Effect of preservation time of formalin-fixed paraffin-embedded tissues on extractable DNA and RNA quantity. J Int Med Res. 48 (6), 030006052093125(2020).
  27. Eccher, A., et al. Pathology laboratory archives: Conservation quality of nucleic acids and proteins for NSCLC molecular testing. J Pers Med. 14 (4), 333(2024).
  28. Chen, T. Y., You, L., Hardillo, J. A. U., Chien, M. P. Spatial transcriptomic technologies. Cells. 12 (16), 2042(2023).
  29. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  30. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nat Biotechnol. 38 (5), 586-599 (2020).
  31. Janesick, A., et al. High resolution mapping of the tumor microenvironment using integrated single-cell, spatial and in situ analysis. Nat Commun. 14 (1), 3602(2023).
  32. You, Y., et al. Systematic comparison of sequencing-based spatial transcriptomic methods. Nat Methods. 21 (9), 1743-1754 (2024).
  33. Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090(2015).
  34. Wang, X., et al. Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states. Science. 361 (6400), eaat5691(2018).

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