この手術プロトコルは、げっ歯類の脊髄硬膜下腔にくも膜下腔内カテーテルを挿入して標的治療を行うための段階的なガイドです。
この記事について
サマリー
要約
脊髄疾患や損傷の治療は、脊髄に直接適用できる効果的な治療法の開発が困難であることもあって困難です。たとえば、脊髄損傷 (SCI) の現在の治療法は主に硬膜外麻酔です。しかし、硬膜外療法では脊髄との直接の相互作用が認められないため、潜在的な治療効果が低下します。ここでは、特定の治療のより直接的な効果を得るために、げっ歯類モデルの硬膜下腔にアクセスする方法が提案されています。記載されたプロトコルを使用して、脊髄記録/刺激用の生体電子デバイスの硬膜下移植、およびニューロトロフィン-3 を負荷したヒドロゲルの安全な挿入が成功しました。両方のアプリケーションでこのプロトコルに曝露された動物は、処置後に後肢または前肢の機能に変化を示さず、処置後最大12週間にわたって機能障害は発生しませんでした。ここで提示された例は非常に具体的ですが、提案されたプロトコルは、脊髄の神経障害のより効果的な局所治療を可能にするために、さまざまなアプリケーションで使用できます。
概要
脊髄の病気や損傷は、世界中の何百万人もの人々に壊滅的な影響を及ぼし、社会的、経済的、医療に重大な負担をもたらす可能性があります 1,2。脊髄の損傷や神経変性疾患は、慢性的な運動機能障害、感覚機能障害、自律神経機能障害を引き起こし、影響を受けた個人の生活の質と自立性を低下させる可能性があります。外科的介入や薬物療法などの現在の治療法は、初期の外傷の軽減と二次合併症の管理に重点を置いています3.しかし、これらのアプローチでは実質的な神経再生や機能回復が達成されることはめったにないため、根底にあるメカニズムを標的としたより効果的な介入が緊急に必要とされています。
現在の治療戦略の主な関心事は、望ましい治療の場所と提供です。神経調節や薬物介入などの治療には、神経細胞の活動に影響を与え、機能回復を促進し、損傷した脊髄回路の接続を再確立する可能性がある4。脊髄刺激は、運動制御の改善と痛みの軽減につながる可能性があります5.ただし、これらの戦略は現在、脊髄の硬膜関門を考慮しずに、硬膜外腔に焦点を当てた損傷組織への間接送達に限定されています 6,7,8。硬膜外治療は臨床的利点を示していますが、標的ニューロン集団への間接的なアクセスにより制限されており、治療薬の効果が低下する可能性があります。
私たちのグループは、硬膜外に焦点を当てた戦略に関連するこれらの制限を克服し、脊髄損傷 (SCI) モデルにおける直接硬膜下治療の提供の可能性を探るために取り組んできました。硬膜下腔にカテーテルを挿入すると、治療を脊髄に直接適用することができ、影響を受けた神経組織との相互作用が強化されます 9,10。硬膜下投与はまた、硬膜のバリア効果を低下させ、電気刺激および標的薬物送達システムの有効性を改善します11,12。この方法は治療の精度と有効性を向上させ、機能回復のより良い結果につながる可能性があります。
この記事では、げっ歯類の脊髄の硬膜下腔に安全にアクセスするための段階的なプロトコルについて説明します。この手順は脊椎の胸部領域 (T10-T12) に焦点を当てていますが、必要に応じて臍帯のさまざまな場所に実施できます。解剖学的ランドマークが指定され、領域の識別が可能になり、椎弓切除術、硬膜切開術、および硬膜浸透に関する詳細な指示が提示されます。電気刺激装置の埋め込みおよびヒドロゲルドラッグデリバリーシステムの送達を含む、このプロトコルの2つのアプリケーションも提示されます(図1)。概説された手順は、げっ歯類の手術の経験を持つ研究者によって簡単に再現できます。このプロトコルは、SCI の挫傷モデルのコンテキストで書かれています。ただし、損傷の特定のモデルは、望ましい実験結果に応じて変更できます。ここで説明する技術は、SCI 治療の進歩に期待できるだけでなく、正確で局所的な介入による脊髄の修復と再生に関する将来の研究のプラットフォームを提供する可能性もあります。
プロトコル
すべての手順はオークランド大学の倫理ガイドラインに従って実施され、同大学の動物倫理委員会(AEC)と大学の動物福祉責任者(AWO)によって承認されました。体重240〜260 gの雌スプレイグ・ドーリーラットを使用し、グループ収容(21°C、12時間:12時間、明暗サイクル)し、手術の前後に標準的なげっ歯類の食事に自由にアクセスできました。げっ歯類の脊髄の硬膜下腔への安全なアクセスを提供することが目的であるため、損傷モデルがない場合に最初にこのプロトコルを試すことをお勧めします。これは、プロトコルが損傷を引き起こすことなく適用できることを実証するための重要な最初のステップであり、目的の損傷モデルをより正確に検査できるようになります。このプロトコルは、研究グループで使用されるさまざまな損傷モデルと組み合わせるのに適しています。したがって、プロトコルでは、アプリケーションによって異なるため、特定の傷害の伝達手順は説明されていません。使用する試薬と機器は、材料表に記載されています。
1. 術前の準備
- すべての器具(補足図1)および関連する消耗品を滅菌します。
- 翌日手術を受けるラットの体重を量ります。
- 投与する薬剤の適切な用量を計算します。ブピバカイン (鎮痛剤) @ 2 mg/kg、用量 - 0.08 mL/100 g;メロキシカム (鎮痛剤) @ 2 mg/kg、用量 - 0.04 mL/100 g;ブプレノルフィン (鎮痛剤) @ 0.03 mg/kg、用量 - 0.1 mL/100 g;エンロフロキサシン(抗生物質)@ 10 mg / kg、用量 - 0.08 mL / 100 g12,13。
注: ブピバカインは、最初の切開の前に、手術部位に沿った 3-4 部位に皮下投与されました。
2.外科的準備
- 麻酔システムが正しくセットアップされていることを確認します(酸素および麻酔システムに関連するすべてのチューブが正しくセットアップされているかどうかを確認します)。
- ラットの体重に基づいて必要な注射を準備し、開始前に投与する生理食塩水の3 mL注射を準備します。
- ヒートパッド(維持温度37°C)、ランプ、顕微鏡、シェーバーがすべてセットアップされ、機能していることを確認します。
注:倍率はユーザーの好みや手順中の視認性によって異なるため、解剖顕微鏡の特定の倍率は必要ありません。
注意: 処置中、動物の体温が35°Cを下回ったり、40°Cを超えたりしないようにしてください
3.動物の準備
- 麻酔システムと酸素タンクに関連するすべてのチューブが接続されていることを確認します。この研究で使用した麻酔システムを使用する場合( 材料表を参照)、イソフルラン誘導を3%に設定し、動物の体重を麻酔システムに入力して、維持麻酔のための酸素流量を設定します(補足図1A)。
注:麻酔は個々の動物に適した維持レベルに保ちます。これは動物によって1.3%〜2%の間で変動する可能性があります。 - ラットが自分自身を正せなくなるまで誘導チャンバーに入れ、希望のイソフルラン維持レベルに切り替えて、ラットをノーズコーンに移動します。
- シェービング前に、3 mLの生理食塩水と必要な薬物注射を皮下に投与します。
注:生理食塩水の注射とシェービングの後、ブピバカインを意図した切開部位に沿ったいくつかのスポットに注射します - 動物の麻酔レベルを監視しながら、手術部位にあるすべての器具(顕微鏡、ツール、滅菌ドレープ)を準備します。目的の領域にツール用の滅菌ドレープを置き、ドレープ上のツールを整理して、無菌フィールドを維持します。
- 首の付け根から腰の上部まで、動物の背中に沿って毛皮を剃ります。
- クロルヘックススクラブでその部分を消毒し、続いてクロルヘックスチンキで、剃毛部位の中心から円を描くように動き(3回)、乾燥を防ぐために目に潤滑剤を塗布します。
- ラットを顕微鏡下の加熱パッドに移し、剃った部分にプレスとシールのドレープを置き、手術野を露出させるのに十分な大きさの穴を開けますが、剃られていない毛皮を露出させるほど大きくはありません。
- 直腸温度プローブを配置して動物の体温を監視し、加熱パッドで~37°Cを維持します。5〜10分ごとに動物福祉チェックを実施します。
- ペダル反射を施行して麻酔の手術面を確認し、処置を開始する。
4.脊椎の組織解剖
- メスの刃を使用して、首の付け根から始まり、胸部のこぶの上に伸びて、T9-T13椎骨を露出させ、吻側から尾側方向(図2A)に直線的な切開(~6〜8 cm)を行います。
- 切開部位の下の結合組織をグレーフ鉗子またはマイクロスプリングハサミで優しくペアリングして、脊椎の筋肉組織を直接露出させます。
- 切開部の尾側半分近くに2つの白いV字型の腱を見つけて、T13突起を特定します。動物の尾側のVに直接吻側にある棘突起はT13です(図2B)。
- T13から始めてT9まで、各プロセス間の結合組織に小さな切開を行い、筋肉を除去する前にそれらを分離し、手順が進行するにつれて位置を維持するのに役立ちます(図2C)。次に、マイクロスクリパーを使用して、棘突起の両側に平行に走る筋肉のチャネルを切り取ります。これを脊椎の両側で行い、各脊椎セグメントの椎弓板を露出させます(図2D)。
- 筋肉壁の両側にセレファインクランプを取り付けて、背骨への視野を開いた状態に保ちます。T13の側面に1対、T11/T12の境界に、T11/T10にもう1対を取り付けます(図2E)。
- 明確なチャネルが形成されたら、マイクロハサミまたはロンジャーを使用して、各プロセスの間に結合組織を切り取ります(図2F)。
- T13の吻側部分からT9の尾側部分まで、各椎板から結合組織と筋肉がきれいに解剖され、椎弓切除術のためにT10-12セグメントが露出するまで、チャネルをクリアします。正常に完了したことは、プロセスの両側にはっきりと見えるラミナによって示されます。
注:ステップ4では顕微鏡は必要ありませんが、強くお勧めします。
5.椎弓切除術
- T13の吻側部分と重なるT12椎弓板の尾部部分を見つけ、ロンジュールの先端を下に配置し、標準のJoVEプロトコル14,15で推奨されているように、椎板の破片をゆっくりと除去し始めます(図2G)。
注:鉗子を使用して各椎板の棘突起をつかみ、安定性を維持し、ロンガーで各切断中にプレートをそっと「持ち上げます」ます(図2G)。ロンガーの先端を椎板の下にスライドさせるときは、潜在的な損傷を最小限に抑えるために、脊髄から外側の圧力を維持してください。
注意: 硬膜や脊髄自体を損傷する可能性があるため、切断するときはロンジャーを下に押しすぎないように注意してください。 - 一方の側からもう一方の側に移動し、切断をプロセスの正中線に伸ばすのに十分なスペースができるまで、T12椎弓板から骨片を切り取り続け、幅約5mmの穴を開けて脊髄を露出させます(図2H)。
注: 脊柱から骨を除去すると出血が発生し、処置中の視認性が低下する可能性があります。綿棒または丸めた糸くずの出ないワイプ(補足図1B)を使用して、椎弓切除術の実行中にこれを管理します。 - 両側の椎板の下にあるロンジャーを動かし、T12の頭蓋部分への均一なチャネルをクリアします(図2I)。
注:脊髄は、脊髄セグメントごとに層状プレートの破片が取り除かれると見えるようになります。 - 手順 5.1 から 5.3 を繰り返して、T11 と T10 の両方を取り外します。
- 椎弓切除術を継続し、両側の均一な切り口を維持し、吻側にT9まで移動します(図2J)。
注:挫傷SCI処置の場合(代表的な結果のセクションを参照)、目的の脊髄セグメントの上の椎弓板は、挫傷装置を使用できるように十分な幅でクリアする必要があります( 図2Kの中央の広がった領域を参照)。薬物送達の場合、椎弓切除術は、目的の化合物の適用を視覚化するのに十分な幅にすることができます。 - 椎弓切除術が完了し、T10-T12の十分な領域が除去されたら、髄膜嚢を生理食塩水でそっと洗い流し、硬膜切開術に必要な領域を準備します(図2K)。
注:この手順は、脊椎セグメント(T10-T12)にアクセスするために固有ですが、これらの方法は、脊椎に沿ったさまざまなセグメントで椎弓切除術を実行するために使用できます。
6.治療適用のための硬膜切開術
- 解剖スコープを使用して硬膜切開術(硬膜の切開)を実行し、脊髄の硬膜下腔にアクセスします(図3A)。
注: 硬膜の視認性に対する外科医の好みに基づいて、スコープの倍率を調整してください。 - 27-G針をベベルを上に向けて90度の角度に曲げます(図3B)。
注意: 曲げるときは、針ドライバーまたは止血器を使用して針をつかみます。 - 脊髄の目的の進入点で針の先端で硬膜をそっと突き刺します(図3B)。
注意: 下にある脊髄やその正中血管を損傷しないように注意してください。 - 硬膜に穴が開いたら、針を背側にそっと持ち上げて、正中線血管の両側にある硬膜に2mm以下の円形の穴を引き裂きます。硬膜切開術の成功は、いずれかの穴からの少量の脳脊髄液 (CSF) の漏出によって示されます。
注:硬膜下腔へのアクセスを容易にするために、椎弓切除術の端から少なくとも数mmの距離を保ちます。必要に応じて、針先を最初の穴に慎重に再度挿入してサイズを大きくします。 - 硬膜切開用に選択された位置と、すぐ前の位置に正中線血管から分岐した血管がないことを確認してください。
注意: 正中血管を損傷すると、過剰な出血を引き起こし、手順の完了を妨げます。 - 硬膜に開けられた穴を使用して、目的の治療を行うか、硬膜下腔にデバイスを埋め込みます。このプロトコルでは、くも膜下腔内カテーテルを治療送達に使用して、刺激装置を所定の位置に誘導するか、ヒドロゲルを注入します(図3C)。
注:デュロ切開後に血液および/またはCSFを継続的に除去することにより、明確な視野を維持します。 - 脊髄に進む前に、カテーテルの先端が硬膜の下に見えることを確認してください。適用の成功は、硬膜膜の下で小さな脊髄血管をスムーズに横切って移動するカテーテルによって示されます。
- 目的の治療が行われた後(図3D、E)、椎弓切除術によって作成されたスペースに滅菌外科用ゲルフォームを配置して、止血、創傷治癒、および脊椎の構造の維持を助けます。
- ゲルフォームを配置した後、4-0ポリジオキサノン吸収性縫合糸を使用して、脊椎の上の筋肉と皮膚の層を閉じます。
7. 術後のケア
- 動物を毎日チェックし、必要な術後薬(ブプレノルフィンを2日間、エンロフロキサシンとメロキシカムを最大5日間)投与します。必要に応じて1〜3 mLの生理食塩水を皮下投与します(術後24時間にわたって<10%の体重の水が消費された場合)。
- 手順に応じて、膀胱機能、運動機能、しかめっ面のスケール、その他の動物福祉の兆候を監視します。
- 手術後約10〜14日で皮膚縫合糸を取り外します。
結果
提案されたプロトコルは、2つの異なる実験設定に適用されました。示されたデータは、手順で説明されている硬膜下操作 (損傷モデルがない場合) が機能を損なわないことを実証することを目的としていたため、損傷していないグループを代表しています。生体電子デバイスを移植(図1A)するか、ハイドロゲルを6〜8週間齢のSprague-Dawleyラットに送達(図1B)しました。これらの動物の運動機能は、BBB運動機能スケールを使用して、硬膜下手術を行わずに偽手術を受けた対照動物の運動機能と比較されました。ここでは、いくつかのグループの動物が表現されており、各手順の実行可能性とその安全性を示しています。各手順の後、すべての動物は、手順の 7 日後にグループ間で BBB スコアに差がなく、正常な運動機能を維持し、記載されたプロトコルの安全な実施を示しています。さらに、後肢の運動機能障害を示す動物のグループ(図4C)は、硬膜下処置グループと比較するために表され、実験グループで悪影響が認められなかったことをさらに実証します。このグループは、以前の文献12,13 で説明されているように、175 kdyn 衝撃装置の力で挫傷 SCI 処置を受けました。
生体電子インプラント
デバイスの移植の場合、プロトコルには、硬膜の下でのガイド カテーテルの移動とデバイスの制御された配置を容易にするために、2 つの硬膜切開部位 (1 つはカテーテルの挿入用、もう 1 つは出口用) の作成が含まれます。このバイオエレクトロニクスデバイスは、生体適合性ハウジングでカプセル化されたPCBインターフェースに取り付けられた2つの分岐アームで構成されていました。アームは、インプラントの位置決めを支援するために、7-0シルク縫合 糸を介して 小さな髄腔内カテーテルに一時的に接続されます。カテーテルは、吻側硬膜切開孔からゆっくりと引っ張られ、硬膜の下に滑り込み、出口硬膜切開孔を通って尾側に治療場所まで移動します。次に、取り付けられたインプラントアームを引っ張って、脊髄の各半部分に配置しました。インプラントの尾端は、T13突起に付着した筋肉に縫合されます。ハウジングは僧帽筋/広背筋吻側に縫合され、椎弓切除術が行われます。次に、スキンはハウジングユニットのベースの周りを閉じて、外部からのアクセスを提供します。
ハイドロゲル処理
ハイドロゲルの送達には、エントリーポイントのみが必要です。ヒドロゲルは、刺激装置と同じ位置に配置された同様の髄腔内カテーテル を介して 送達されました。カテーテルに10μLのポロキサマーヒドロゲル12 をロードし、デバイスの移植ステップと同じ方法で硬膜下腔に挿入しました。所定の位置に配置されると、カテーテルはゆっくりと引っ込められ、ヒドロゲルは硬膜の下(図1B)から各半索に連続的に放出されました。各手順の後、動物は適切な回復を確実にするために7日間監視されました。
運動機能評価には、21 ポイントの Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) スケールが使用されました16。両方のグループの動物は、処置前(ベースライン)と手術後1日、3日、および7日に評価されました。オープンフィールドの行動は、直接、および盲検ビデオ録画 によって 評価されました。各グループの左右後肢の両方の運動機能スコアを、手術の副作用の程度を決定するために、未手術の対照動物および別のSCIグループと比較しました。インプラント群またはヒドロゲル群のいずれかの動物は、未手術の対照または損傷したSCI動物と比較した場合、いずれかの処置後に運動機能の欠陥を示さなかった。なお、脊髄損傷がないことを確認する組織学的分析は、以前の研究ですでに発表されています。その研究では、この方法を使用してデバイスを埋め込んでも、処置後 7 日まで追加の脊髄外傷が発生しないことが実証されました11。アストロサイト(GFAP)とミクログリア/マクロファージ(Iba1)の両方の活性に最小限の変化が見られ、対照動物と比較して、デバイスの移植後に見られました。インプラントの真下にある冠状脊髄切片の表面積と真円度も検査され、形態に変化は見られませんでした。
図1:硬膜下治療戦略。 (A)インプラント装置および(B)ヒドロゲルの注入に使用されるカテーテル/シリンジの例。(C)ラットの脊髄へのインプラントとヒドロゲル挿入の両方の代表的なモデル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:手術野を表す椎弓切除術の画像。 (A) 図2 および 図3の手術画像に対する動物の向き。(B) 筋解剖の開始をガイドするためのプロセス T13 の位置の筋腱ランドマーク。(C) 椎弓切除術 によって 除去される各プロセスを識別するための垂直切断。(D)筋肉チャネルは、骨板にアクセスして除去できるように、脊椎突起と平行に切断されます。(E) ブルドッグ セレファイン クリップは、脊椎の両側の筋肉/皮膚を保持して適切な手術スペースを提供するために使用されます。(F) 椎弓切除術の開始前に、各プロセスを相互接続する白い腱の除去。(G) 椎弓切除術の開始時の手術野で、ロンジャーが T12 プレートの下にスライドして骨の切断を開始します。(H) T12 プロセスの前半を切除して脊髄を露出させ、外科医が吻側に移動して残りの突起の除去を開始するための十分なスペースを確保しました (T11/T10)。(I) T12 の頭蓋部分の除去、セグメントの完全な除去。(J) 挫傷 SCI の例を適用するために幅の広いカットを使用して、T11 で半分完了した椎弓切除術。(K) T10-T12 セグメントの除去後の椎弓切除術を完了し、脊髄の背側表面を完全に露出させます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:硬膜切開術を実施し、標的治療を適用するための手順。 (A)脊髄の硬膜の穴の位置の概略図。(B) 硬膜切開術を作成するために硬膜を貫通する 27 G の針を示す手術野。これは、(A)に見られるように、中央血管の両側で行われます。(C) 治療用途に使用されるカテーテルの初期挿入。(D) 脊髄に設置された電気刺激装置。(E) 脊髄表面に注射するためのハイドロゲルを充填したカテーテル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:術後の状態と運動機能。 (A) デバイス移植およびヒドロゲル送達後の動物の代表的な画像。(B) 硬膜下処置 (インプラントまたはハイドロゲル) を受けた動物または操作を受けなかった対照動物と比較した脊髄挫傷損傷を有する動物の代表的な BBB スコア。対照 (未手術)、SCI、およびインプラント グループのサンプル サイズは n = 5 であり、ハイドロゲル グループのサンプル サイズは n = 3 でした。エラーバーは標準誤差を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:手術ツール。 使用した手術器具の写真。(1)#10ブレードメス。(2)ヴァンナスマイクロハサミ。(3)グレーフ鉗子。(4) Serrefine ブルドッグ クリップ。(5) ロンジャー。(6) 硬膜切開術用 27 G 針。(7)細い鉗子。(8) 必要に応じて生理食塩水を塗布するための 1 mL シリンジ。(9)解剖はさみ。(10)縫合用の止血剤。(11)先のとがった綿棒。(12)滅菌綿球。(13) ロールした糸くずの出ないワイプ。 この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 2: 硬膜下腔と硬膜外腔。 硬膜外と硬膜外麻酔を示す脊椎と脊髄の概略図。硬膜下腔。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ディスカッション
ここで紹介する方法論は、脊髄硬膜下腔にアクセスするための段階的な指示を提供し、脊髄の胸部領域への治療送達の2つの例を通じてその安全性と実現可能性を実証します11,12。多くの研究グループが、電気的または化学的介入を通じて脊髄損傷 (SCI) を治療しようとするアプローチを開発してきました。光遺伝学17または電気刺激18のための埋め込み型デバイス、およびヒドロゲル19,20を利用した薬物療法を含む現在の戦略は、回復とリハビリテーションの促進においてさまざまな程度の成功を実証しています。しかし、現在の治療のほとんどは硬膜下腔の外で行われているため、正確な標的化は依然として重要な課題です。ここで説明する技術は、硬膜下腔への長期アクセスの手段を含む、脊髄に直接介入を送達するための有望なアプローチを提供し (補足図 2)、SCI および神経変性疾患に対する治療薬の持続的かつ標的を絞った送達をサポートします。これは、脊髄障害の効果的な治療法を開発する上で大きな課題である血液脊髄関門をバイパスする上で重要な意味を持ちます。
椎弓切除術
げっ歯類の椎弓切除術は広く使用されていますが17、21、22、プロトコルには注意しなければならない重要な側面がいくつかあります。上記のプロトコルで使用される解剖学的ランドマーク(ステップ4.3; 図2A)脊髄の胸部下部領域へのアクセスを可能にし、私たちのグループの作業に固有のものです。手順を別の脊椎領域に適用する場合は、最初の椎骨に対して吻側または尾側のセグメントを数えて、位置を決定できます。もう 1 つの重要な考慮事項は、薄板の除去の程度です。処置中に脊髄に望ましくない損傷を与えるリスクを最小限に抑えるために、少なくとも 2 つの連続したレベルを除去する必要があります。そうすることで、硬膜切開術に十分なスペースが確保され、適切な視覚化が保証されます。この予防措置により、カテーテル挿入中に小さな血管を損傷するリスクが軽減されます。手術後の不必要な出血や脊柱の不安定性を防ぐために、脊椎の側壁からの過度の骨除去も避ける必要があります。適切なアクセスと最小限の中断の間のバランスを維持することで、この手順により、より安全で正確な治療の提供が保証されます。
硬膜切開術とカテーテル挿入
硬膜切開術の実施には、脊髄への貫通を避けるための精度が必要です。不適切な挿入は、脊髄または硬膜下血管にあざや裂傷を引き起こす可能性があります。硬膜に作成された開口部は、膜の完全性を損なうことなく、目的の治療戦略、この場合はくも膜下腔内カテーテルの直径に対応するのに十分な大きさでなければなりません。硬膜切開術を行う際、硬膜に穴が開くと脳脊髄液が漏れることがあります。ただし、量は最小限です。硬膜の大きな裂傷は合併症を引き起こす可能性がありますが、以前の文献では、記載されているプロトコル (ステップ 6.4) で使用されるような小さな穿刺は、コラーゲン沈着/血管新生23 を介して自己治癒することができ、その結果、処置後に測定可能な悪影響は発生しません。カテーテルを留置するときは、直接的な力による怪我のリスクを最小限に抑えるために、カテーテルを脊髄とできるだけ平行に挿入する必要があります。曲がりや圧着を防ぎ、スムーズな挿入と適切な位置決めを確保するには、慎重な取り扱いが必要です。
術後のケア
げっ歯類は通常、標準的な状態で集団飼育されていることを考えると、処置後の術後のケアは重要な考慮事項です。この処置後の攻撃的な行動や社会的相互作用は、適用される治療の種類によっては、実験結果に影響を与える可能性があります。このプロトコルにより、動物の背中に6〜8 cmの皮膚縫合糸の線が形成されます。傷の治癒を可能にし、ケージメイトによる縫合糸の除去の可能性を防ぐために、術後7〜10日間、一軒家の動物を飼うことをお勧めします。薬物送達アプリケーションの場合、切開部が治癒すると、あからさまに攻撃的な行動や処置に関連する合併症なしに、以前のグループに再収容することができます。埋め込み型デバイスの場合、動物は2人のグループでのみ収容する必要があります。動物を3匹以上のグループで飼育すると、治療結果に攻撃性関連の合併症が生じる可能性があることがわかりました。
治療用途
ここで説明する手順は、胸脊髄と 2 つの特定の治療戦略に焦点を当てていますが、脊椎の他の領域や追加の治療用途にも適応できます。同様の椎弓切除術は、げっ歯類モデルのさまざまな脊椎レベルで成功裏に実行されています。しかし、げっ歯類の硬膜下腔が小さいため、治療実施中のエラーの余地が最小限に抑えられるという課題があります。椎弓切除術と硬膜切開術のステップは、げっ歯類の手術の経験者が簡単に行うことができますが、怪我をせずに硬膜の下にデバイスや薬剤を正確に配置するには、追加のトレーニング時間が必要になる場合があります。外科的トレーニングに加えて、治療の適用に役立ついくつかの要因があります。治療中は明確な視野を維持することが重要です。この研究で説明されているように髄腔内カテーテルを使用する場合は、硬膜の下に挿入する前に、カテーテルにギザギザまたは粗い斑点がないことを確認してください。前述のように、硬膜切開の位置は非常に重要です。カテーテルの入口が残りの吻側層から離れているほど、カテーテルが並びやすくなり、挿入中に脊髄と平行な状態を保ちます。怪我に関連する治療戦略のタイミングも考慮する必要があります。将来の研究では、損傷後のさまざまな時点で動物でこれらの手順を確立し、その後、慢性損傷に対処することを目的とした治療法の評価を可能にする予定です。このプロトコルは、脊髄の神経疾患の治療応用における大幅な進歩を表しており、脊髄組織に直接治療を提供するための多用途かつ正確なアプローチを提供します。
開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、CatWalk 脊髄損傷トラストと HRC サー チャールズ ハーカス研究フェローシップ (BH) によって資金提供されています。この研究は、国防総省によって承認された保健担当国防次官補によっても、賞番号の下で脊髄損傷研究プログラムを通じて534,258米ドルの金額で支援されました。HT9425-23-1-0492です。 図2A と 図3A の回路図は、Biorender.com を使用して生成されました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1mLと3mLの注射器 | アムテック | ||
| 1mlのツベルクリン注射器 | BD | 302100 | |
| グラフェ鉗子2本 | FST | 11051-10 | |
| 薬剤投与用の25G針 | ニプロ | SH811 | |
| 硬膜切開用の27G針 | ニプロ | SH816 | |
| ティッシュブルドッグクランプ6本 | FST | 18051-28 | |
| エタノール70% | |||
| ベイトリル 5 mg/kg | エランコ | KV04UHU | |
| Biogel Surgeons ラテックスグローブ | モルンリーク | 822775-01 | |
| ブピビカイン 2 mg/kg | アスペン・ニュージーランド | 2023-02 | |
| ブプレノルフィン 0.05 mg/kg | Ceva(Vetergesic) | 9000320 | |
| クロルヘックスとエタノールのチンキ剤 | ペリゴ | K076A | |
| クロルヘックススクラブ | シュルケ | LBL11258 | |
| 湾曲したロンゲール | FST | 16021-14 | |
| デュモン #4 鉗子 | FST | 11294-00 | |
| ジェルフォーム、滅菌吸収性ゼラチンスポンジ | ゲルフォーム | 09-0342-04-015 | |
| ハミルトン注射器 | ハミルトン | 80314 | |
| ヒートパッド(37oC) | ケント・サイエンティフィック | SF-01 | |
| 止血鉗 | FST | 13004-14 | |
| インフィニット・ホライズン・インパクターとソフトウェア | 精密システムおよび計装(PSI) | IH-0400 | |
| イソフルラン | メッドソース | 不明 | |
| メタカム 2 mg/kg | ベーリンガー・インゲルハイム | D02818 | |
| 非吸収性縫合糸(Ethilon 4-0、P-3) | エティコン | 1603G | |
| O2タンク | |||
| Omax外科顕微鏡 | ジェイコブズ・デジタル | W43DPT | |
| ドレーピング用のプレス&シールラップ | よかった | 該当なし | |
| メス柄 | ファインサイエンスツールズ(FST) | 10004-13 | |
| サイズ10のメス用刃 | アムテック・メディカル | SH070 | |
| Somnoflow Induction Suite | ケント・サイエンティフィック | SF-01 | 低流量麻酔システム |
| 無菌吸収パッドと綿 | スイスパーズ | 該当なし | |
| 滅菌綿棒(標準+尖ったもの) | help@hand | 該当なし | |
| 滅菌生理食塩水 0.9% | 実験室で作製・オートクレーブ処理 | 該当なし | |
| 巻き上げたキムワイプの無菌部位 | キムテック・サイエンス | 34155 | |
| 温度プローブ | ケント・サイエンティフィック | SF-01 | |
| ヴァンナス・スプリング・シザーズ | FST | 15903-08 | |
| 水性潤滑剤 | |||
| 体重計 | どんな人でも | 該当なし |
参考文献
- Ahuja, C. S., et al. Traumatic spinal cord injury. Nat Rev Dis Primers. 3, 17018(2017).
- Lee, B. B., Cripps, R. A., Fitzharris, M., Wing, P. C. The global map for traumatic spinal cord injury epidemiology: Update 2011, global incidence rate. Spinal Cord. 52 (2), 110-116 (2014).
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