インフルエンザウイルスのクライオ電子断層撮影法による赤血球凝集素のサブナノメートル分解能構造決定

クライオ電子断層撮影法(cryoET)は、タンパク質複合体、ウイルス、細胞、生物のスナップショットをキャプチャするために、過去数十年にわたって適用されてきました。クライオ電子顕微鏡(cryoEM)のモダリティであるクライオETは、生体サンプルを瞬間凍結し、傾斜^1,2,3を介してさまざまな方向で画像化する構造生物学の方法です。次に、各方向で撮影された画像は、共通の傾斜軸に計算的に整列され、断層撮影に再構成されて3次^{元ビュー4}を提供します。

X線結晶学や単粒子クライオEMでは、精製された構造的に均質な分子が必要ですが、クライオETでは、分子をそのネイティブコンテキスト内で直接画像化^{できます4。}したがって、クライオETの主な利点の1つは、インフルエンザ^5,6,7を含む膜ウイルスなどの多形サンプルを視覚化できることです。クライオETのもう一つの可能性は、スケールを超えて画像化する能力です。トモグラフィーは通常、5〜10 nmを超えて分解されません^が8、同じ粒子のコピーが識別され、整列され、平均化されるサブトモグラム平均化の統合により、リボソーム^9,10などの一部の生体分子でほぼ原子分解能が得られる可能性があります。ただし、この分解能に到達できる分子の種類は限られています。サブトモグラムの平均は通常、10〜15 Åの解像度を超えません。対照的に、単粒子クライオEMは、分解能回転後に3〜4 Åの分解能を日常的に達成します¹¹。クライオETデータ取得および解析ソフトウェアの両方の高スループットにおける最近の進歩により、ネイティブコンテキスト^{12、13、14、15、16、17、18}内で追加の生体分子のサブナノメートル分解能の構造決定が可能になりました。

クライオETの一般的な用途の1つは、ウイルスの形態、組織、構造を視覚化することです。この技術では、単粒子クライオEMやX線結晶学に比べて分解能が低いにもかかわらず、クライオETとサブトモグラム平均化を組み合わせることで、ウイルスタンパク質が天然環境でどのように振る舞うかに関する情報を提供し、ビリオンの文脈におけるウイルスタンパク質の組織に関する重要な詳細を提供することができます。ウイルスのクライオETの一般的な標的は、治療薬やワクチンの主要な抗原や標的であることが多いため、宿主細胞の付着と融合に一般的に使用される表面糖タンパク質です。クライオET処理パッケージの最近の進歩により、これらの糖タンパク質19,20,21,22のサブナノメートル分解能平均を達成することがますます実現可能になってきています。そのような例の 1 つは、インフルエンザ ビリオンの表面にある主要なタンパク質である赤血球凝集素 (HA) です。このタンパク質は、受容体結合と膜融合の両方を行うだけでなく、単一の^ビリオン5に数百から数千のHAがあり、信じられないほど高密度にビリオンを覆っています。ここで紹介するプロトコル(図1)は、一般的に使用されるいくつかのパッケージを社内スクリプトと統合して、インフルエンザHAのサブトモグラム平均の前処理からモデル改良までの段階を描写します。

注:このプロトコルに使用されるサンプルデータセットは、このプロトコルに使用される2セットのチルトシリーズを含むEMPIAR-12864でアクセスできます。チルトシリーズは、2.09 Å/ピクセルの物理ピクセルサイズで精製されたインフルエンザAウイルスの手動で急落したグリッドから収集され、各チルトシリーズに複数のビリオンが含まれるように十分な視野を確保し、可能な限り最高解像度の再構成を実現します。ユーザー独自のデータセットの場合は、生のチルトムービーでワークフローを開始することをお勧めします。これらのデータセットは、高性能ワークステーションを使用して処理および視覚化されました。 資料表 には、このプロトコルに使用されるハードウェアとソフトウェアがリストされています。このプロトコルで使用されるすべてのソフトウェアパッケージはオープンソースであり、ダウンロードできます。インストールのリンクと手順 は、 材料表 に記載されています。クライオETデータセットを処理するために推奨されるワークステーションには、少なくとも8コアプロセッサ、6GBのVRAM、64GBのRAM、および2TBのローカルストレージを備えた専用GPUカードが装備されている必要があります。

1. Warp ²³とIMOD ²⁴におけるチルトムービーのデータ前処理とクライオ電子断層撮影の再構成

1. ターミナルで、次のコマンドを使用して、Warp がインストールされている conda 環境をアクティブ化します。
   conda activate warp_environment
2. フレームシリーズを処理するためのフレームシリーズ設定ファイルを作成します。これは、顕微鏡に関するメタデータ、処理するデータの場所、および出力ファイルの保存場所を含む構成ファイルです。
   WarpTools create_settings --folder_data path/to/.tif --folder_processing warp_frameseries --output warp_frameseries.settings --extension “*.tif” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07
   注:これらのデータは超解像モードで収集されました。
3. コントラスト伝達関数(CTF)の推定と動き補正を行います。
   WarpTools fs_motion_and_ctf --settings warp_frameseries.settings --m_grid 1x1x5 --c_grid 2x2x1 --c_range_max 7 --c_defocus_max 10 --c_defocus_min 4 --c_use_sum --out_averages
   注:m_gridパラメータは、チルトムービー内のサブフレームの数に対応する必要があります-データセットは、チルトムービーごとに5つのサブフレームで構成されていました。
4. 傾斜シリーズのメタデータをインポートして、WarpTools がどの傾斜シリーズに属しているムービーを識別できるようにします。
   WarpTools ts_import --mdocs path/to/.mdoc --frameseries /path/to/frameseries --tilt_exposure 3.07 --min_intensity 0.3 --output tomostar
5. tomostar フォルダにデータが入力されたら、傾斜シリーズ処理用の傾斜シリーズ設定ファイルを作成します
   WarpTools create_settings --folder_data tomostar --folder_processing warp_tiltseries --output warp_tiltseries.settings --extension “*.tomostar” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07 --tomo_dimensions NxNxN
6. Etomo GUI²⁴を使用して、IMODのbatchruntomoプログラムを使用して、傾斜スタックを書き出し、自動基準ベースのチルトシリーズアライメントを実行します。
   1. ターミナルで次のコマンドを実行します。
      Warptools ts_stack --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35
      注:チルトシリーズは、位置合わせ時間と計算リソースを削減するために、物理ピクセルサイズの4倍でエクスポートされました。
   2. サンプルデータセットを選択して、batchruntomoのテンプレートとして適用する前に、まずアライメントパラメータを設定します。
   3. batchruntomoを使用している場合は、IMODからアライメントパラメータをインポートします。
      WarpTools ts_import_alignments --settings warp_tiltseries.settings --alignments warp_tiltseries/tiltstack/ --alignment_angpix 8.35
      注:このデータセットでは、Etomo GUIを使用すると、WarpTools内のラッパーよりも優れた結果が得られました。
   4. または、WarpTools内のAreTomo²⁵ ラッパーを使用して、基準のない自動チルトシリーズアライメントを実行します。
      WarpTools ts_aretomo --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35 --alignz 1000 --axis_iter 3 --exe AreTomo_executive
      注: AreTomo ラッパーは AreTomo1.3.4 でテストされました。
7. ターミナルで次のコマンドを実行して、チルト シリーズの CTF パラメーターを推定します。
   WarpTools ts_ctf --settings warp_tiltseries.settings --range_high 7 --defocus_min 2 --defocus_max 10 --auto_hand 4
8. WarpTools を使用して断層撮影を再構築します。
   1. 環境変数を設定します。
      export WARP_FORCE_MRC_FLOAT32=1
      注:このステップにより、断層撮影が、このプロトコルで使用される他のソフトウェアでの画像処理および視覚化の後続の段階と互換性があることが保証されます。
   2. 断層撮影を再構築するには、ターミナルで実行します。 WarpTools ts_reconstruct --settings  warp_tiltseries.settings --input_data input file names --angpix 8.35 --dont_invert
9. すべてのデータセットに対して、手順 1.2 から 1.8.2 を繰り返します。

2. 断層撮影の前処理と粒子ピッキング

1. ターミナルで、IsoNet²⁶ がインストールされた conda 環境をアクティブ化します。
   conda activate isonet_env
2. トモグラフィー処理の準備をするには、最初にサブフォルダを作成し、すべてのトモグラフィーをそのフォルダに移動します。
   mkdir tomo_folder
mv tomograms*.mrc tomo_folder/
3. プロジェクトフォルダにスターファイルを生成します。
   isonet.py prepare_star tomo_folder --output_star tomograms.star --pixel_size 8.35
4. テキストエディタを使用して、生成されたスターファイルを開き、各断層撮影の4列目(_rlnDefocus)に0度の傾斜画像のおおよその焦点剥離値を入力します(warp_tiltseriesフォルダー内のprocessed_items.jsonファイルにあります)。
   注:焦点をぼかす値は、IsoNetのオングストローム単位である必要があります。ワープは焦点をぼけた値をμm単位で書き出すため、10,000の乗算係数が必要です。
5. ターミナルで CTF deconvolve コマンドを実行します。
   isonet.py deconv tomograms.star --snrfalloff 0.7 --deconv_folder deconvolve
6. デコンボリューション後、EMAN2 GUI²⁷ を開始して、粒子ピッキング用の断層撮影の前処理を開始します。
   conda activate eman_env
e2projectmanager.py
7. [トモグラフィー] で、[ 生データ] の横にある矢印を左クリックし、ドロップダウン メニューから [トモグラフィーのインポート ] を選択します。
8. [セグメンテーション]の横にある矢印を左クリックし、[断層撮影の前処理]を選択します。
   注: デフォルトのパラメータは、多くのデータセットに適している可能性があります。これらの断層撮影では、4 Åのローパスフィルターを適用し、チルト画像を正規化しました。前処理後、空白の.jsonファイル(前処理されたファイルと同様のベース名)を含む情報ディレクトリがEMAN2によって自動的に生成されます。パーティクルピッキングの前に、angpixをjsonファイルに追加する必要があります。
9. 畳み込みニューラルネットワーク(CNN)を学習させてHA糖タンパク質を認識します。
   1. 作業ディレクトリを、CNNトレーニングと粒子ピッキングに使用する断層撮影の場所に変更します。
      cd path/to/tomograms
   2. ターミナルを使用して、CNN トレーニング ウィンドウを開きます。
      e2spt_boxer_convnet.py --label label_name
   3. ディレクトリ内のCNNパラメータと断層撮影に関する情報を含むウィンドウと、CNNによって選択された良い参照(ポジティブ)、悪い参照(ネガティブ)、および粒子(粒子)の画像を含む他の3つのウィンドウの4つのウィンドウが開いていることを確認します。
   4. CNN GUI の [ New ] ボタンを左クリックして、新しい CNN を初期化します。デフォルトの学習率を 0.0001 に設定し、ボックス サイズを 8 に設定します。
   5. [ ファイル名 ] 列で、代表的な断層撮影を左クリックして、新しいウィンドウで開きます。
      注:一度に開くことができる断層撮影は1つだけです。
      1. 断層撮影の Z 軸を移動するには、開いている断層撮影の上にカーソルを置き、コンピュータのマウスのスクロールホイールを押して新しいウィンドウを開きます。N# というラベルの付いたスライダーは、Z 軸を変更します。
   6. 開いている断層図で、 ポジティブパネルのマウスの左ボタンを使用して、HAに対応する10〜20個の特徴を選択します。
      注: 膜の上に円柱または三角形として表示される HA の上面図と側面図の両方を選択し、より堅牢なネットワークの適切な参照として選択します。
      1. ポジティブ参照の画像が ポジティブウィンドウ に表示されます。参照を削除するには、Shift キーを押しながら参照画像を左クリックします。
   7. ネ ガティブパネルに切り替え、空のメンブレンパッチ、vRNP密度、基準マーカー、デブリなどの特徴に対応する10〜20個の参照を選択します。
      注: 参照は [ネガティブ] ウィンドウに表示されます。
   8. メインウィンドウの 「トレーニング」 ボタンを左クリックして、CNNトレーニングを開始します。
      注: メインウィンドウの反復回数 (Niter) によって、CNN が受けるトレーニングの反復回数が変わります。パラメータを 50 に設定することをお勧めします。
   9. 選択した参照でCNNが学習されたら、[ 適用] を左クリックして、CNNを使用して開いた断層撮影で粒子を選択します。
      注: 選択したパーティクルのイメージは、[パーティクル]ウィンドウに表示されます。選択した粒子は、トモグラムにも青い円で表示されます。
   10. 適用されたネットワークに基づいてポジティブとネガティブの参照を選択し続け、 保存ボタンで 進行状況を定期的に保存します。
   11. 問題がなければ、[ すべて適用] を選択して、CNNがディレクトリ内のすべてのトモグラム内の粒子を選択し、複数のトモグラムで結果を評価します。必要に応じて追加のトレーニングを実行します。
10. 各トモグラムの座標をテキストファイルに保存します。
    1. e2projectmanager.pyコマンドを使用して EMAN2 GUI を開きます。
    2. [サブトモグラム平均]の横にある矢印をクリックし、[手動ボックス化]をクリックします。
    3. トモグラムの名前を入力し、[ 起動] をクリックします。
    4. [ファイル]>[保存 ボックス座標]を選択して、座標をテキスト ファイルに保存します> tomogram_ha.txt。
    5. neuralnets サブフォルダーと info サブフォルダーに移動して、nnet_save.hdf、trainouts.hdf、segouts.hdf、および boxes3dref.hdf をバックアップします。
11. マトリックス(M1)タンパク質層とウイルスリボ核タンパク質(vRNP)複合体の存在が明らかな完全に組み立てられたビリオンでのみ分析を実行するには、M1タンパク質を認識するように2番目の畳み込みニューラルネットワークをトレーニングします。
    1. 手順 2.9 で概説したのと同じプロトコルに従い、トレーニング ボックスのサイズを 8 から 14 に変更します。

3. パーティクルキュレーション

1. https://github.com/jqyhuang/influenza-analysis からノートブックをダウンロードします。
2. CNN_Particle_Cleaning.ipynb ノートブックを開き、必要なモジュールをロードします。
   注:このスクリプトは、Open3D²⁸ をパッケージとして使用して、粒子座標を3D点群として視覚化します。
3. HA座標とM1座標に対応するテキストファイルを読み込み、Open3Dパッケージを使用して3D点群として表示します。
4. Open3D で実装されている統計的外れ値除去を使用して、HA 座標の外れ値を除外します。
   注:HAの推奨初期値は、nb_neighbors = 50(座標の周りの隣接座標の数)およびstd_ratio = 0.5です。
5. HA 点群と M1 点群の間の距離を計算します。M1点群から20ピクセル以上離れたすべてのHA座標は、外れ値として識別されます。外れ値として識別されていないすべての粒子座標は、出力.txtファイルに保存されます。
   注:20ピクセルは、ピクセルサイズ8.35 Å /ピクセルで、おおよそ16 nmの距離に相当します。私たちの断層撮影では、M1層に対するHA三量体の中心は約15nmです。
6. すべてのパーティクルを連結し、pts2starfile.ipynb を使用してスターファイルとして保存します。

4. 反復サブトモグラフィーの平均化と分類

1. WarpToolsを使用して、ビニング係数4で粒子を抽出し、^{RELION4 29}でサブトモグラム平均化の最初のラウンドを実行します。
   WarpTools ts_export_particles --settings warp_tiltseries.setting --input_star pts2star.star --coords_angpix 8.35 --output_star bin4_export.star --output_angpix 8.35 --box 48 --diameter 140 --3d
   注:推奨されるボックスサイズは48 x 48 x 48ピクセルで、7〜8 HAのアレイを格納するのに十分な大きさの~360 ųボックスに対応します。
   1. ワープスターファイルをRELION 4互換ファイルに変換する
      relion_convert_star --i bin4_export.star --o bin4_conv.star
   2. パーティクルのサブセットでrelion_refine_mpiを使用して初期参照を生成します。
      head -n 30 bin4_conv.star >> subset.star & tail -n +31 bin4_conv.star | shuf -n 2000 >> subset.star
mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o init_ref/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i subset.star --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 300 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 14 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control init_ref/job001
   3. relion_refine_mpiを使用して、サブトモグラムの3Dオートリファインを行います。
      1. サンプルコマンド: mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o Refine3D/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i bin4_conv.star --ref init_ref/job001/run_class001.mrc --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 400 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 16 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control Refine3D/job001
         注:最初のグローバルおよびローカルサンプリングは、healpixの次数4とローカルのhealpix2に対応する7.5度と1.8度に設定されました。最初の改良では、主に膜、M1タンパク質、およびHAアレイの強力な密度を活用します。並進オフセット範囲は、配列の整列時に発生する可能性のあるシフトを包含するために、より大きくすることができます。
   4. 最初のリファインメント実行が収束した後、リファインメントを繰り返し、変換を 8 に、ステップを 2 に変更します。
2. 2D分類を活用して、relion_refineを使用してジャンク粒子を破棄します。
   1. サンプルコマンド: relion_refine --o Class2D/job003/run --grad --class_inactivity_threshold 0.1 --grad_write_iter 200 --iter 200 --i Refine3D/job002/run_data.star --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --tau2_fudge 2 --particle_diameter 300 --K 20 --flatten_solvent --zero_mask -- strict_highres_exp 14 --center_classes --oversampling 1 --norm --scale --j 24 --skip_align --pipeline_control Class2D/job002。
      注:計算効率が高いため、3D 分類の代わりに 2D 分類が使用されました。サブトモグラムは、追加の画像処理なしで、2D分類ジョブへの入力として直接使用できます。
   2. relion_star_handlerを使用して、円筒形の HA、膜、および M1 密度を含む識別可能な HA アレイを含むクラスを結合します。
   3. まず、適切なクラスを含むスターファイルを作成します。
      relion_star_handler --i input_file2.star --o output_good_class.star --select rlnClassNumber --minval goodclassnumber -maxval goodclassnumber
   4. 次に、次のrelion_star_handlerコマンドを使用して、個々のスターファイルを結合します。
      relion_star_handler --i "output_good_class1.star output_good_class2.star … output_good_classn.star" --o bin4_keep.star --combine
3. ビン2で再抽出し、ビン化されていない粒子を反復的に局所的に微細化します。
   1. bin2のリファインメントでは、80の小さいボックスサイズを使用して粒子を抽出し、healpixとローカルhealpixの両方を4(1.8度のローカル角度サンプリング)に設定してローカル検索を行います。
   2. この段階では、relion_star_handlerを使用して異なるデータセットのパーティクル セットを結合します。
      relion_star_handler --i input_file.star --o output_file.star --combine
   3. 最初の改良ラウンドの後、中央のHAとメンブレン、およびM1密度を含むEMAN2環境内の e2filtertool.py を使用して円筒形のマスクを作成します。
      注:円筒形マスクに使用されるパラメータ:cx = 24、cy = 24、outer_radius = 8、zmax = 40、zmin = 12。他のすべてのパラメーターはオフになります。
   4. マスクを適用した状態でさらに1回の調整を行います。
   5. 2D 分類をもう一度実行して、中央の HA と位置合わせしない外れ値と追加のデブリを除去します。
   6. ボックスサイズが120のビニングされていない粒子でプロセスを繰り返し、中央のHAを覆うソフトマスクを作成し、参照をC3対称性に合わせ、この改良段階で対称性を適用します。
      relion_image_handler --i bin1_ref.mrc --o bin1_c3.mrc --sym c3
      注:RIONを使用して達成された最終分解能は6.1Åでした。
4. MTools⁹ での最終的な改良
   1. リファインメントの母集団を作成します(ワープconda環境のアクティブ化後)。
      MTools create_population --directory refine_m --name ha_final
   2. 各データセットのデータソースを追加します。
      MTools create_source --name source_1 --population refine_m/ha_final.population --processing_settings warp_tiltseries.settings
      1. 追加のデータセットで前の手順を繰り返します。
   3. リファインメント種を作成します。
      MTools create_species --population refine_m/ha_final.population --name ha_todaysdate --diameter 160 --sym c3 --temporal_samples 1 --half1 last_relion_refine/run_half1_class001_unfil.mrc --half2 last_relion_refine/run_half2_class001_unfil.mrc --particles_relion last_relion_refine/run_data.star --mask mask.mrc
   4. マルチパーティクルの微細化。
      1. まず、次のコマンドでパーティクルのポーズを調整します。 MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles
      2. 次に、次のコマンドを使用して、パーティクル ポーズと球面収差の両方を調整します。 MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles --ctf_cs
         注: それ以上の反復では解像度が向上しなかったため、改良はここで中止されました。ただし、徹底的にテストされていないパラメーターのさまざまな組み合わせは、結果を押し上げ続ける可能性があります。

5. モデルの改良

1. ChimeraX³⁰を使用して、最終マップとHAの原子モデルをロードします。
2. HAエクトドメインに対応するすべてのセグメントをセグメントマッピングして結合し、 セグメントにフィット ツールを使用してHAモデルにドッキングします。
   1. モデルの変換された座標を保存します。
3. Phenix GUI³¹を開き、 Real Space Refinement ツールを使用します。
   1. ファイルを追加するように求められたら、変換された HA モデルとマップを追加し、最終的な再構成の解像度を入力します。
   2. グローバル最小化、ローカルロータマーフィッティング、占有率の改良、グループADPの改良の5ラウンドを実施します。
4. ChimeraXを使用して最終的な再構成とモデルを視覚化します。

この処理プロトコルの利用を実証するために(図1)、H1N1インフルエンザAウイルス株(A/プエルトリコ/8/1934)から得られた25枚の断層撮影を組み合わせた2つのデータセットに、前述のワークフローを適用しました。データ収集パラメーターの概要を 表 1 に示します。 図2 は、多形性インフルエンザビリオンの代表的な断層撮影とズームインビューを示しています。この断層撮影では、ビリオンが球形から楕円形/細長い形状までさまざまであるため、さまざまな形態が捉えられます。ほとんどのインフルエンザ粒子には、よく組織化されたM1およびvRNPアセンブリが含まれていますが、一部のビリオンはより無秩序で、重要な構造成分を欠いているようです。

このデータセットから、40,995のサブトモグラムの初期セットが、粒子のピッキングとキュレーション後のbin4(8.35 Å / pix)の再構成に使用されました。2つのデータセットは、C1対称性とHAアレイ全体を包含する広い球面マスクを使用して、RELION4で最初に独立して処理されました。これらのサブトモグラムに対して3つの改良サイクルが実行され、続いて2D分類が行われました。分類後、解像度の低いサブトモグラムとジャンク粒子は廃棄されました。残りのサブトモグラムをbin2(4.17 Å / pix)で抽出し、2つのデータセットを組み合わせました。Bin2サブトモグラムは、最初にサブトモグラム平均化のラウンドで一緒に整列され、次に中央HAの周りの円筒形マスクが焦点整列を適用されました。この段階では、HA再構成のために三量体対称性を明確に視覚化できます。追加の改良ラウンドは、bin2 と 2.8 Å/pix で実行されました。2D分類の最後のラウンドは、中央のHA三量体だけをアライメントされたサブトモグラムで覆う小さなマスクを使用して実施されました。残りのサブトモグラムの~94%からなる主要なクラスは、ビニングされていない粒子に抽出され、C3対称性が適用された3D精密化が行われました。最後に、これらのサブトモグラムをMにエクスポートし、そこで粒子姿勢と球面収差の微細化サイクルを実行しました(補足図1)。

15,970個のHA粒子からなる最終的なサブトモグラム平均(図3A)は、6.0 Åのグローバル分解能と5〜7 Åの局所分解能範囲に達しました(図4)。PR8 HAのモデルは、密度に柔軟に改良されました。FSC=0.5 および FSC=0.143 では、マップからモデルへの分解能はそれぞれ 8.1 Å と 6.6 Å でした。HA再構成のアーキテクチャは、以前のクライオEMおよびクライオETマップと非常によく似ていました。この分解能では、アルファヘリックスとベータシートを区別できます(図3B)。さらに、糖鎖は、HAヘッドとステムの4つのグリコシル化部位で同定され始めることができます(図3C)。

私たちの結果は、天然インフルエンザビリオンからのHAの再構築におけるcryoETの適合性を示しています。このプロトコルにより、円筒形の糖タンパク質の透明な密度がウイルス膜に垂直に観察され、各ステップで分解能が向上しました。独自のデータについては、サブトモグラム平均化はビン化された粒子スタックから開始し、各改良サイクルで結果を注意深く監視する必要があることが提案されています。糖タンパク質密度が最初の段階から明らかでない場合は、サブトモグラムの位置をトモグラムにマッピングして、正確な位置を確認することをお勧めします。それ以外の場合は、最適な結果を得るために、アライメント パラメータを微調整したり、追加の分類段階を実装したりできます。

図1:インフルエンザウイルスのクライオETからのHAのサブトモグラム平均化の全体的なパイプライン。 上部のパネルは、プロトコルのデモンストレーションに使用された2つのデータセットの要約ワークフローを表しています。2番目のパネルはプロトコルのセクション1に対応し、3番目のパネルはセクション2〜3に対応し、4番目のパネルはセクション4〜5に対応します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:PR8インフルエンザウイルスの代表的な断層撮影 。(A)再構成された断層撮影をスライスします。スケールバーは100nmです。(B-D)(B)球形、(C)円筒形、(D)M1レスPR8ビリオンを拡大した。B-Dのすべてのスケールバーは50nmに対応します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:PR8 HAのサブトモグラム平均。 (A)PR8 HA単粒子クライオEM構造を柔軟に取り付けた2つの輪郭レベルでのHA再構成の上面図と側面図。(B) HA 再構成によるクリップされたビュー。色付きの矢印は、色付きのボックスに対応します。(C)糖鎖密度を明らかにするために、より低い輪郭で示されたHA再構成。クライオETマップのスティック表現における糖鎖のクローズアップビューも示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:HAサブトモグラム平均の解像度推定値。 (A)再構成にマッピングされたHAサブトモグラム平均の局所分解能推定値。カラーバーは、青-白-赤のパレットに5-7 Åを描きます。(B)ハーフマップおよびマップからモデルへの解像度のFSC曲線。青い曲線はマスクされていない再構成のもので、赤の曲線はマスクされたものです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:PR8インフルエンザウイルスのcryoETデータセットのデータ収集パラメータ。

補足図1:HAのサブトモグラム平均化ワークフロー。 HA サブトモグラムの反復アライメント、平均化、および分類は、段階的なビニング解除を通じて実行されます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者らは開示するものは何もない。