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研究記事

糖尿病マウスにおける創傷血管新生と血漿エキソソームmir‐31‐5pに及ぼす湿った曝露熱傷軟膏の効果

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DOI：

10.3791/68649

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2025年8月26日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Endocrinology, The Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Cardiology, General Hospital of Central Theater Command, 3Key Laboratory for the Prevention and Treatment of Diabetic Chronic Wounds in Baise City, 4Key Laboratory of Metabolic Diseases in Baise City

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この記事では、湿った曝露された熱傷軟膏が、糖尿病創傷の血管新生と血漿エキソソーム mir-31-5p の発現を動的に調節することにより、糖尿病創傷修復をどのように促進するかについて説明します。

要約

湿った暴露火傷軟膏 (MEBO) は、慢性糖尿病創傷の治療に使用される伝統的な漢方薬です。しかし、根底にあるメカニズムは不明です。最近の証拠は、創傷血管新生におけるエクソソームと機能的 miRNA の役割を示唆しています。ここでは、糖尿病マウスにおける創傷血管新生および血漿エキソソーム mir-31-5p (pExo-mir-31-5p) 発現に対する MEBO の影響を調査することを目的としました。合計120匹のC57BL / 6マウスを無作為に非糖尿病対照群(n = 24)とストレプトゾトシンによって誘導された糖尿病群(n = 96)に分け、さらに糖尿病対照群、MEBO、ベイフシン群、およびMHY1485群(それぞれn = 24)に無作為に割り付けました。5 つのグループは、それぞれ生理食塩水、生理食塩水、MEBO、ベイフキシン、および MHY1485 で治療された全層皮膚切除モデルで確立されました。1日目、7日目、13日目、18日目に、創傷閉鎖率、微小血管密度、pExo-mir-31-5p発現レベル、 VPS4a および Rab27a mRNA、創傷組織におけるタンパク質レベルを、それぞれImageJ、ヘマトキシリン-エオシン(HE)染色、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)、およびウェスタンブロット(WB)を使用して分析しました。さらに、 VPS4a、Rab27aタンパク質、pExo-mir-31-5pの発現と微小血管密度との相関関係を解析した。MEBOは糖尿病マウスの創傷修復を促進することがわかりました(p < 0.050)。創傷治癒の初期および中期では創傷血管新生を促進しましたが、後期では創傷血管新生を阻害しました (p < 0.050)。MEBOは、治癒の初期および中期に創傷組織における Vps4a および Rab27a mRNAおよびタンパク質発現、およびpExo-mir-31-5pをアップレギュレートし、後期段階でダウンレギュレートしました(p < 0.050)。さらに、VPS4a、Rab27aタンパク質、pExo-mir-31-5p発現、および微小血管密度は、MEBO処理マウスで正の相関がありました(p < 0.050)。結論として、MEBO は糖尿病マウスにおける創傷血管新生と pExo-mir-31-5p 発現を動的に調節し、その臨床応用に新たな理論的サポートを提供します。

概要

高齢患者における糖尿病の有病率は高く、年々増加しています。この病気は慢性糖尿病創傷 (CDW) に関連しており、患者の健康、機能、全体的な生活の質に悪影響を及ぼします1。通常、創傷閉鎖には、止血、炎症、増殖、再上皮化の 4 つの異なる段階が含まれます2。これらの中で、増殖期が最も重要です。初期の増殖期には、毛細血管内皮細胞が増殖して創傷に移動し、新しい血管が発芽し、複雑なネットワークを形成します3。しかし、創傷修復の後期段階では、毛細血管管腔のほとんどが閉塞し、少数が小さな動脈や静脈に移行します。CDW の患者では、組織喪失、壊死、壊疽、およびさまざまなレベルの炎症と高血糖が、血管新生と抗血管新生の間の動的バランスを崩し、特に血管新生が損なわれている場合に創傷治癒を遅らせます 4,5,6。湿った曝露火傷軟膏 (MEBO) は、CDW の治療に使用される伝統的な漢方薬ですが、そのメカニズムは不明のままです。最近、複数の研究により、エクソソームを担保した miRNA が血管新生を促進し、それによって糖尿病の創傷治癒を促進する可能性があることが実証されています 7,8。しかし、MEBOとエクソソームを担うmiRNAとの関連を調査した研究はほとんどありません。したがって、MEBOがCDWの血管新生を刺激するメカニズムを、エクソソームと機能的miRNAの観点から明らかにする必要があります。

エクソソームは、生細胞から放出される球状の膜状小胞で、サイズは30〜200 nm、密度は1.1〜1.2 g / mLで、CD81や腫瘍感受性101(TSG101)9などのマーカータンパク質が含まれています。エクソソームの産生と分泌は、輸送に必要なエンドソーム選別複合体(ESCRT)依存性経路と非ESCRT依存性経路に分類されます。これらの経路内の最も重要な調節因子は、液胞タンパク質選別4ホモログa(VPS4a)およびRas関連タンパク質Rab-27a(Rab27a)10、11、12です。Vps4aはATPアーゼとして作用し、エクソソームのサイズとエクソソーム形成速度を調節するESCRT依存性膜リモデリングプロセスを触媒します13,14。Rab27aは、原形質膜への多胞体のドッキングを調節する必須の低分子GTPアーゼです15。エクソソーム分泌は、ラパマイシン17のATP構造ドメインへのMHY1485競合結合によって活性化されるラパマイシン複合体1(mTORC1)16の哺乳類標的によって負に調節されます。全体として、MHY1485エクソソームの合成と分泌を間接的に阻害する可能性があります。エクソソームは、ほとんどすべての体液で検出できます。血漿エクソソームは、他の体液に由来するエクソソームよりも生産的です18。さらに、エクソソームは、それらが運ぶ核酸を分解から保護します19。

MiRNAは、細胞活性を調節する小さなノンコーディングRNA分子です20。エクソソームは、創傷血管新生の促進に重要な多数のmiRNA、特にmir-126、mir-125a、およびmir-31-5pで豊富に発見されています。以前の研究では、骨髄間葉系幹細胞を過剰発現するmir-126に由来するエクソソームが、mir-126を移植することにより、in vitroでヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖、遊走、および管形成を促進することが実証されました21。別の研究では、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞から分泌されるエキソソームがmir-125aを内皮細胞に転移し、創傷の血管新生阻害剤デルタ様4を抑制することにより血管新生を促進することが示されました9。Yanらは、ミルクエクソソームにロードされたmir-31-5pがin vitroで内皮細胞機能を改善し、血管新生を促進し、in vivoで糖尿病の創傷治癒を促進することを報告しました22。これらのmiRNAの中で、mir-31-5pは、正常なマウスの創傷と比較して、糖尿病マウスの創傷で有意にダウンレギュレートされた唯一のmiRNAでした22。

MEBO は、CDW23,24 などの難治性創傷の治療に使用できる油性軟膏です。しかし、MEBOが創傷治癒を促進するメカニズムは解明されていません。以前の研究では、MEBO が糖尿病ラットの血管内皮増殖因子発現をアップレギュレートすることにより、創傷血管新生を促進することが示されています25。ただし、エクソソームを運ぶmiRNAの観点からこの問題に取り組んだ研究はごくわずかです。本研究では、MEBOがCDWに及ぼす影響を調べるために、ストレプトゾトシン(STZ)と高脂肪食を用いて糖尿病マウスの全層創傷モデルを誘導した。MEBOが糖尿病マウスの創傷治癒を有意に加速することを示しました。さらに、創傷組織におけるVPS4aおよびRab27a mRNAおよびタンパク質とともに、微小血管密度、pExo-mir-31-5pの発現レベルに対するMEBOの影響を研究しました。したがって、MEBOはpExo-mir-31-5pを調節して糖尿病マウスの創傷血管新生を調節することにより創傷治癒を促進するという仮説を立てました。スタディデザインの概略的な概要を図1に示します。

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プロトコル

すべての動物実験プロトコルは、中国の百色にある宥江医科大学の動物ケアおよび使用委員会によって承認されました (2018051501)。特定の病原体のない(SPF)雄C57BL / 6マウス(生後7週間)をYoujiang Medical College for NationalitiesのSPF実験動物センターに収容し、通常または高脂肪の食事ときれいな水を与えました。研究全体を通じて、動物の給餌室の温度は23°C〜25°Cに維持され、湿度は40%〜60%、明暗サイクルは12時間でした。動物の世話は、米国国立衛生研究所および中国国立衛生研究院(中国、北京)のガイドラインに従って提供されました。すべての外科的介入は、当研究室で確立された標準化されたプロトコルを使用して、ペントバルビタールナトリウム (0.3%、50 mg/kg) による麻酔下で行われました。動物の使用数を減らし、動物の不快感を最小限に抑えるためにあらゆる努力が払われました。このレポートのすべてのセクションは、動物研究を報告するためのARRIVEガイドラインに準拠しています。

マウス創傷モデルと治療
合計120匹のマウスを、非糖尿病対照群(NDB-CTR;n = 24)または糖尿病群(n = 96)にランダムに割り付けられました。ヒトの2型糖尿病をシミュレートするために、糖尿病群のマウスに高脂肪の精製糖食を4週間与え、その後、1日1回、16時間絶食後、連続2日間、STZ(100 mg / kg)を腹腔内注射(ip)しました。空腹時血糖値は、STZ注射後5日目と6日目に測定されました。空腹時血糖値が16.7mmol/Lを2回以上、多食症、多飲症、多尿症、体重減少などの症状を有するマウスは、成功した糖尿病モデルと見なされました26。1週間後、背毛を剃り、ペントバルビタールナトリウム(0.3%、50 mg/kg)を腹腔内投与した後、各マウスの背中に丸い全層皮膚創傷(直径=15 mm)を生成した。糖尿病群のマウスを、MEBO、BFX(ベイフキシン)、DB-CTR(糖尿病対照)、またはMHY1485(MHY)群にランダムに割り付けられました。MEBO群とBFX群のマウスは、MEBO(0.2 g / cm2)とBFXゲル(0.2 g / cm2)をそれぞれ1日1回創傷に適用して治療しました。BFX ゲルは、一般名がウシ塩基性線維芽細胞成長因子ゲルであり、慢性創傷の治療に使用される局所薬です27。NDB-CTR、DB-CTR、およびMHY群のマウスを生理食塩水で処理しました。MHY グループも MHY1485 (10 mg/kg、ip) で 2 日間連続して治療されました。糖尿病マウスに、血糖値を制御するために、1日1回、2〜4 IU / kgの用量でインスリンを皮下注射しました。

検体採取
1、7、13、18日目に、各群のマウス6匹を頚部脱臼による安楽死のために無作為に選択し、創傷を含むリング状の表皮組織のサンプルを滅菌組織ハサミで創傷端から0.5cmで採取した。次に、HE 染色、qPCR 分析、および WB アッセイのために創傷組織を収集しました。DB-CTR群とMEBO群のマウスから血液サンプルを採取し、ペントバルビタールナトリウム麻酔下で眼窩後法を用いて採取した。血液サンプルを抗凝固チューブ内でヘパリンと混合し、3,000 x g で 15 分間遠心分離して血漿上清を回収しました。すべてのサンプルは-80°Cで保存しました。 創傷閉鎖率を計算するために、デジタル カメラを使用して、一定の時点で等距離で創傷治癒の写真を撮影し、側面に目盛りを付けました。創傷面積は、ImageJ ソフトウェアを使用して測定されました。創傷閉鎖率は次のように計算されました。

創傷閉鎖率 (%) = [W1-Wn] / W1 x 100%

ここで、W1 と Wn はそれぞれ 1 日目と n 日目の創傷領域を指します。

病理組織学的アッセイ
病理学的創傷治癒を動的に観察するために、HE 染色が行われました。4%パラホルムアルデヒド溶液で16時間固定した後、創傷組織を脱水し、パラフィンに包埋し、3μmの切片にスライスした。HE染色は、組織スライドで実行されました。創傷組織の微小血管密度を調査するために、光学顕微鏡を使用して組織スライドを画像化しました。各サンプルの微細血管密度を定量化するために、10倍顕微鏡で毛細管密度が最も高い領域を選択し、20倍顕微鏡で重ならない3つの領域を選択して撮影しました。微小血管密度を計算し、ImageJ を使用して平均化しました。

血漿エクソソームの単離と特性評価
超遠心分離は、公開されたプロトコルに従って血漿エクソソームを単離するために実施され、わずかな変更を加えた28。簡単に言えば、2 mLの血漿を4°Cで2,000 x g で30分間遠心分離しました。上清を4°Cで10,000 x g で45分間再度遠心分離し、より大きな小胞を除去しました。上清を0.45μmのろ膜でろ過し、濾液を回収した。次に、濾液を100,000 x g で4°Cで70分間遠心分離した。上清を除去した後、ペレットを10 mLの予冷した1x PBSで再懸濁し、4°C、100,000 x gで70分間遠心分離しました。上清を除去し、ペレットを150 μLの予冷した1x PBSで再懸濁し、-80°Cで保存しました。 上記で採取した血漿エクソソームを確認するために、透過型電子顕微鏡(TEM)を使用してエクソソームの形態を決定し、ナノフローサイトメトリーシステムを使用してエクソソームのサイズと濃度を分析し、WBを使用してエクソソームマーカーCD81とTSG101の発現レベルを検出しました。

RNA抽出、逆転写(RT)、qPCR
qPCRを実行して、Vps4a、Rab27a、およびpExo-mir-31-5pのmRNA発現レベルを定量しました。創傷組織を採取し、RNA抽出試薬を用いてトータルRNAを抽出しました。400〜700 ng / μLの総RNA濃度は許容できると見なされました。RNAサンプルは、製造元の指示に従って、dsDNaseを含む逆転写酵素を使用してcDNAに逆転写されました。qPCRは、SYBR Green qPCR Mix(ROXなし)を使用して実行しました。mir-31-5pは、ミニキットを用いて血漿エキソソームからRNAを抽出し、First Strand cDNA Synthesis Kitを用いて逆転写し、SYBR Green qPCR Master Mixを用いて増幅しました。mRNAとmiRNAの発現は、それぞれ β-アクチン と cel-mir-39に対して2-ΔΔCt法を使用して分析されました。使用したプライマーを 表1に示します。

ウェスタンブロット
WBアッセイを使用して、Vps4aおよびRab27aタンパク質の発現レベル、およびエクソソームマーカーCD81およびTSG101のレベルを検出しました。創傷組織と血漿エクソソームの総タンパク質レベルを RIPA 溶解バッファーによって抽出し、タンパク質濃度をビシンコニン酸タンパク質アッセイ キットによって測定しました。合計50μgのタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドによって分離しました。ポリフッ化ビニリデンメンブレン上でブロッティングした後、メンブレンをウシ血清アルブミンでブロックし、Vps4a(1:3000)、Rab27a(1:1000)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)(1:5000)、CD81(1:3000)、TSG101(1:3000)に対する抗体とともに4°Cで一晩インキュベートし、次に二次抗体、抗ウサギIgGペルオキシダーゼ結合(1:3000)と37°Cで1時間インキュベートした。膜は、強化された化学発光キットを使用して視覚化されました。

統計分析
この研究で提示されたすべてのデータは、SPSS ソフトウェアを使用して統計的有意性について分析されました。これらの分析で得られたすべての結果は、GraphPad Prismソフトウェアを使用して視覚化されました。2 つのグループ間の差異は、独立したサンプルの t 検定を使用して調べられました。複数グループ比較では、一元配置分散分析が同種分散データに使用され、ウェルチの検定が不均一分散データに適用されました。さらに、等分散データのペアワイズ比較には最小有意差検定を使用し、等分散データにはTamhaneのT2検定を使用しました。定量的データは、平均±標準偏差として表示されます。相関関係は、非正規分布変数のスピアマン相関分析を使用して分析され、相関係数と 95% 信頼区間として記述されました。P < 0.050 は統計的に有意であると考えられました。すべての実験を少なくとも3回繰り返しました。

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結果

MEBOは糖尿病マウスの創傷治癒を加速します
糖尿病創傷における MEBO の有効性を検証するために、糖尿病創傷モデルを確立し、1、7、13、および 18 日目に写真を撮影しました。各グループの傷は時間の経過とともに徐々に治癒しました(図2A)。NDB-CTR群の創傷は18日目までに完全に治癒した。MEBO群の創傷は糖尿病創傷の中で最も急速に治癒し、7日目にいくつかのピンク色の肉芽粒子を形成し、13日目にかさぶたが剥がれた後、真っ赤な肉芽組織の広い領域を成長させ、最終的に修復し、肉芽組織は18日目に大幅に減少しました。BFXグループの傷は18日目までにほぼ治りました。DB-CTRグループはBFXグループよりも治癒が遅かった。MHYグループは最も長い治癒時間を示しました。創傷治癒を定量的に分析するために、写真を ImageJ にアップロードして創傷閉鎖率を計算しました。その結果、各グループの創傷閉鎖率が時間の経過とともに増加することが示されました(図2B)。7、13、および18日目...

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ディスカッション

糖尿病の合併症である CDW は、重大な死亡率や障害につながる可能性があり、血管障害と関連していることがよくあります29。MEBO は CDW の治療に効果的です。しかし、その根底にあるメカニズムは不明である30.そこで、エクソソームや機能性miRNAの観点から検討することを目指しました。この研究では、MEBO群の創傷閉鎖率と微小血管密度が糖尿病マウスのあらゆる時点で最も高いことがわかりました。qPCRおよびWBの結果、創傷組織におけるVPS4aおよびRab27a mRNAおよびタンパク質の発現レベル、およびMEBO群のpExo-mir-31-5pの発現レベルがすべての時点で最も高く、発現レベルは増加後に減少する傾向にあり、7日目にピークに上昇し、13日目にわずかに減少し、18日目に徐々に低下しました。さらに、相関分析により、MEBO グループでは VPS4a、Rab27a、pExo-mir-31-5p、および微小血管密度が正の相関があることが示されました。結論として、MEB...

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開示事項

著者らは、競合する利益はないと宣言する。

謝辞

この研究は、助成金 [番号 81960875] の下、助成金の下、助成金の下、広西チワン族自治区自然科学基金 [番号 2023GXNSFDA026008]、助成金 [番号 S2022134] の下、広西チワン族自治区西洋医学衛生委員会の助成金 [番号 20210234] の西洋医学自費研究プロジェクト、および広西チワン族自治区漢方薬局の自費による支援を受けました助成金[番号GZZC2020255]に基づく研究プロジェクト。

著者の貢献:
Yuanyuan Xu: 執筆 - 原案、ソフトウェア、方法論、調査、形式分析、概念化。Jianchang Xu:リソース、方法論、調査。Anbang Zhou:調査、形式的分析。Nimiao Cen:視覚化、Lina Huang:監督。Biaoliang Wu: 執筆レビューと編集、リソース、プロジェクト管理、方法論、資金調達、データキュレーション、概念化。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1×PBS ソーラービオ(中国・北京)#P1020緩衝液
4%パラホルムアルデヒド溶液ソーラービオ(中国・北京)#P1110固定組織
抗ウサギIgGペルオキシダーゼ抱合 親近感#S0001二次抗体
ベイフシンゲルEssexbio(中国、珠海)#042404A06慢性創傷を治療するための軟膏
CD81抗体シグナルウェイ抗体#41779一次抗体
強化化学発光キット&NBSP;エピザイム(中国)#SQ101タンパク質バンド用化学発光キット
グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)抗体親近感#AF7021一次抗体
GraphPadプリズムhttps://www.graphpad.com/prism/視覚化
画像J https://imagej.net/ij/創傷面積を測定 
インスタントビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイキット エピザイム(中国)#ZJ102タンパク質濃度を決定する
LightCycler96システムロシュqPCR装置
MHY1485MedChemExpress(米国)#326914-06-1哺乳類のラパマイシン複合体1(mTORC1) の標的活性化因子;
miRNeasy Miniキット 天根(中国)#217004RNA抽出(miRNA)
湿った露出した火傷軟膏メボ(中国、汕頭)#2403103B慢性創傷を治療するための軟膏
MonAmp SYBR グリーン qPCR ミックス (ROX なし) モナド(中国)#MQ10101SqPCRキット(mRNA)
MonScript RTIII オールインワンミックスと dsDNase モナド(中国)#MR05101S逆転写キット(mRNA)
ナノフローサイトメトリーシステムN30E(中国)エクソソームの大きさと濃度を分析する装置
光学顕微鏡オリンパス(東京、日本)組織の病理形態を観察する
生理食塩水Kelun (中国四川省)#L24041709生理食塩水
ポリフッ化ビニリデン膜ミリポア(アメリカ)#IPVH00010ウェスタンブロッティングメンブレン
プライマーGeneray Biotech Co., Ltd.(中国・上海)
Rab27a抗体細胞シグナル伝達技術#69295一次抗体
RevertAid ファーストストランド cDNA 合成キットサーモフィッシャー(米国)#K1622逆転写キット(miRNA)
RIPA溶解バッファーソーラービオ(中国・北京)#R0010全タンパク質抽出
ドデシル硫酸ナトリウム–ポリアクリルアミド&NBSP;エピザイム(中国)#PG222電気泳動バッファー
ペントバルビタールナトリウムメルク(中国・上海)#P3761麻酔剤
特定病原体のない雄C57BL/6マウスGuangdong Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd (中国広東省)実験動物
SPSSのhttps://www.ibm.com/spss統計分析
ストレプトゾトシンソーラービオ(中国・北京)#S8050糖尿病マウスモデルを誘導する 
SYBR グリーン qPCR マスターミックス ロシュ(スイス)#4943914001-SRqPCRキット(miRNA)
透過型電子顕微鏡日立製作所(日本)HT-7700型エクソソームの形態を決定する装置
トリゾール Invitrogen(米国)#15596026CNRNA抽出(mRNA)
TSG101抗体アブカム# ab125011一次抗体
Vps4a抗体アブカム# ab197896一次抗体

参考文献

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