慢性骨髄炎の管理のための診断と治療を統合するインテリジェントな構造カラーヒドロゲルパッチ

サマリー

この研究では、慢性骨髄炎 (COM) の診断と治療のためのスマートな構造カラー ヒドロゲル パッチ (CPG) を提示します。このパッチには、温度応答性 GelMA ヒドロゲル、pH 感受性 CSMA-PBA 足場、サリチル酸が組み込まれており、薬物放出の制御、感染のモニタリング、組織再生の促進を実現します。

要約

慢性骨髄炎 (COM) は持続性の骨感染症であり、薬剤耐性や有害な副作用などの問題により、従来の抗生物質では治療が困難です。この課題に対処するために、COM の診断と治療の両方に対応する新しいスマート構造カラー ヒドロゲル パッチ (CPG) を開発しました。このパッチは、足場としてフェニルボロン酸(CSMA-PBA)で修飾されたメチルアクリル化キトサン、フィラーとして温度応答性GelMAヒドロゲル、および薬物送達用のサリチル酸(SA)を組み合わせたものです。特性評価により、優れた機械的特性と接着強度が示されました。薬物放出実験により、CPG が pH 変化に効果的に反応し、薬物放出の制御が可能になることが確認されました。CPG は、感染部位の pH と温度の変化を検出し、術後の回復を支援する診断ツールとしても機能します。抗菌試験では細菌増殖の有意な阻害が示され、 in vitro 実験では、炎症マーカーを減少させながら血管内皮増殖因子の発現を促進する CPG の能力が実証されました。この研究は、抗菌作用、抗炎症作用、血管促進作用など、ハイドロゲルパッチの多機能機能を強調しており、慢性骨髄炎の有望な治療選択肢として位置づけられています。

概要

慢性骨髄炎は、治療プロセスが困難で長期にわたること、治療失敗のリスクが高く、再発が多いため、患者にとって大きな懸念事項となっています¹。骨髄炎の現在の治療戦略には、壊死組織の外科的デブリードマンと非経口抗生物質が含まれます。しかし、作用部位で治療レベルを提供するために高用量の抗生物質の必要性は、病気の治療には効果がないままです。さらに、高用量の抗生物質の使用は、腎毒性、耳毒性、抗生物質耐性、胃腸副作用などの有害な合併症を伴います。抗生物質の局所薬物送達は、これらの欠点を克服するためのより適切な戦略である可能性があります。局所抗生物質の送達は最小限の副作用で骨感染症を治療できますが、治療を成功させるには骨再生を誘導することが不可欠です²。したがって、抗生物質と骨成長因子の同時投与は有望な治療戦略であると思われます。過去数十年にわたり、非生分解性ポリメタクリレートメチル (PMMA) は、骨髄炎における局所抗生物質療法の主力となってきました。しかし、局所抗生物質送達システムとしてのPMMAの使用は、ビーズ除去のための2回目の手術の必要性、表面コロニー形成を促進する細菌バイオフィルム形成、抗生物質耐性につながる治療下レベルでの長期抗生物質放出、残留モノマーの全身毒性、および骨誘導特性の欠如などの制限に直面しています³.したがって、生体適合性ポリマーを使用した生分解性局所送達システムの開発は、これらの欠点を克服できる可能性があります。文献は、バンコマイシンの局所送達のためにシルク足場に組み込まれたシルク フィブロイン ナノ粒子 (SFNP) が重度の骨髄炎の治療に使用できることを示唆しています。しかし、ナノ複合材料に骨誘導性生理活性分子が存在しないため、調製された構築物は骨再生を有意に誘導しませんでした。したがって、慢性骨髄炎の治療に適したナノ複合足場材料の設計は、懸念される困難な問題でした。天然ポリマーベースのヒドロゲルは、細胞外マトリックス (ECM) との構造的類似性と薬物放出を制御する能力により、広く注目を集めています⁴。

ハイドロゲルの顕著な特徴の 1 つは、温度や pH などのさまざまな要因に対する反応性です。慢性感染症は、微生物の負荷、再生と分解のバランスの調節不全、および分解代謝反応の強化により pH を上昇させる可能性があります。さらに、壊死組織や膿などの創面切除物質の外科的切除は、pHのより高い値への移行を加速する可能性があります⁵。したがって、慢性感染のpHを感知できるpH感受性ヒドロゲルの使用は、慢性骨髄炎の予後にとって非常に重要です。

この研究では、図1に示すように、慢性骨髄炎の治療に必要な機能を備えた、インテリジェントな構造カラーヒドロゲルパッチを使用した統合診断と治療のアプローチを提案します。超分子ポリマーネットワークの集合に由来する超分子ヒドロゲルは、天然の細胞外マトリックス(ECM)に似た魅力的な材料です。超分子ヒドロゲルは、適切な機械的強度、自己修復性、抗菌性、抗炎症性などの優れた特性により、生物医学分野で多くの用途が見出されています⁶。対照的に、構造色は、光と固有の周期性ナノ構造との独特の相互作用によって生成される色の一種として、光学ディスプレイ、偽造防止ラベル、ウェアラブル電子機器などの分野で大きな注目を集めています。特に、応答性ポリマーから構造色材料を構築する場合、これらのポリマーの膨張または収縮によってさまざまな刺激によって色を調整できるため、これらの材料がセンサーとしての可能性を示唆しています。したがって、超分子ヒドロゲルと構造色を組み合わせることで、慢性骨髄炎の治療のための新しいヒドロゲルパッチを構築するための独自の戦略が提供されることが想像できます ^7,8,9。

ここでは、抗タンパク質結石足場としてフェニルボロン酸(CSMA-PBA)と混合修飾メチルアクリル化キトサン、フィラーとして温度応答性GelMAヒドロゲルで構成され、サリチル酸(SA)¹⁰を充填したインテリジェント構造カラーヒドロゲルパッチ(CPG)を開発しました。ネットワーク内の水素結合と非共有結合相互作用の可逆性により、得られたヒドロゲルパッチは優れた機械的特性を示すだけでなく、自己修復能力も備えていました。さらに、CSMA の存在により、このハイドロゲル パッチは強力な抗菌生物活性も示しました。さらに、GelMA ポリマーの熱応答性を利用して、ヒドロゲル パッチは、比較的高温の炎症部位に配置すると活性物質を放出する可能性があります。同時に、CSMA-PBAにボロン酸エステル結合が存在するため、ヒドロゲルは環境pHの変化に反応しました¹¹。これらの利点に基づいて、提案された構造色超分子ヒドロゲルパッチが、炎症因子の発現、抗菌活性をダウンレギュレートし、血管新生を促進することにより、慢性骨髄炎を治療できることを実証しました。特に、抗タンパク質結石足場の独特の光学特性の恩恵を受けて、ハイドロゲルパッチは温度刺激に反応して色が変化する能力を示すことさえあり、慢性骨髄炎のモニタリングと管理、および臨床治療の指針において大きな可能性を示しています。

プロトコル

すべての手順は医療倫理委員会によって承認され、実験動物の世話と使用に関するガイドラインに従って実施されました (NIH 出版物 No. 80-23、1978 年改訂)。実験には、雄のSprague-Dawleyラット(生後8週)を使用しました。

シリカコロイド結晶鋳型(SCC)の調製
SCCは、前述のように調製された12,13,14。洗浄およびプラズマ処理されたスライドガラスを、脱イオン水に分散した単分散シリカナノ粒子(直径12 nm)の5%溶液に浸漬しました。溶液を室温(25°C)で1時間連続撹拌し、シリカナノ粒子の均一な分散を確保した。スライドを溶液から取り出し、室温で1時間自然乾燥させた。乾燥プロセスは、スライドガラスの表面にナノ粒子が適切に付着するようにするために重要でした。自然乾燥後、スライドを60°Cの換気オーブンに2日間入れて、残りの溶媒を蒸発させ、コロイド結晶の形成を促進しました。この蒸発中、スライドは45°の角度で配置され、規則化されたコロイド結晶アレイの形成が促進されました。秩序化されたコロイド結晶アレイは自己組織化によって特徴付けられ、粒子間間隔に応じて異なる構造色を示しました。次に、これらのアレイを、その後のヒドロゲルパッチ製造のテンプレートとして使用しました。

統合診断と治療のインテリジェント構造カラーヒドロゲルパッチ(CPG)の調製
抗タンパク質結石足場は、シリカコロイド結晶鋳型(SCC)の空隙から複製されました。洗浄したスライドガラスをまず、脱イオン水中の単分散シリカナノ粒子(直径12 nm)の5%溶液に浸漬し、溶液を室温(25°C)で1時間撹拌して、ナノ粒子が表面全体に均一に分散するようにしました。撹拌プロセスは、凝集体の形成を防ぎ、ナノ粒子の均一な分布を確保するために極めて重要でした。浸漬後、スライドを室温(RT)で1時間自然乾燥させた後、60°Cで2日間オーブン乾燥させて、溶媒の蒸発を促進し、シリカナノ粒子の自己組織化を整然としたコロイド結晶アレイに促進した。蒸発中、スライドはナノ粒子の整列を促進するために 45° の角度で配置され、粒子間距離が制御された周期的アレイの形成が促進されました。この秩序化された配列は、コロイド結晶の特徴である構造色を示し、その後のヒドロゲル構造のテンプレートとして機能しました。

次に、調製したSCCを、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解した濃度10%w/vのGelMAからなるCPGプレゲル溶液に浸しました。サンプルを室温(RT)で5分間放置して、シリカナノ粒子間の空隙にGelMAが完全に浸透し、テンプレート構造内の均一な分布を確保しました。このステップは、ヒドロゲルマトリックスがテンプレートに均一に組み込まれ、最終的なヒドロゲル構造がSCCの秩序あるナノ粒子配列を再現するために重要でした。浸漬後、プレゲル溶液をUV光(365 nm)下で3 mW/cm² の強度で5分間重合させた。この紫外線曝露により、GelMAの架橋が開始され、ヒドロゲルマトリックスが固化しました。過度のゲル化やテンプレート構造の喪失につながる可能性のあるヒドロゲルを過剰に露出させることなく、十分な架橋を達成するために、露光時間と強度を慎重に最適化しました。

CPGの特性評価
ヒドロゲルの断面形態は、サンプル(1 mm x 1 mm)を金¹⁵でコーティングした後、5kVの加速電圧で走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して観察されました。これにより、ナノ多孔質構造を可視化し、ヒドロゲルネットワークの均一性を確認することができました。膨潤挙動は、10 mgのヒドロゲルサンプルを10 mLのPBSに異なる時間間隔(0、30、60、120、および180分)で浸漬することによって評価されました。膨潤率は、時間の経過に伴うヒドロゲル体積の増加を測定することによって計算され、さまざまな条件下でヒドロゲルが水を吸収する能力についての洞察が得られました。レオロジー分析は、1%ひずみのレオメーターを使用して実行され、1 rad/sから100 rad/sの範囲の角周波数を適用して、貯蔵弾性率(G')と損失弾性率(G'')を測定しました。このステップは、応力下での粘弾性挙動を含むヒドロゲルの機械的特性を理解するために不可欠でした。せん断接着特性は、ASTM F2255-05 (2015) に準拠した万能引張試験機 (Instron) を使用して、10 mm/min の速度と 0.01 N の予圧で評価され、ヒドロゲルが生体組織に付着する能力を評価しました。薬物放出は、ヒドロゲルを5 mLのPBS(pH 7.4)に浸漬した後、λ = 280 nmで吸光度をモニタリングすることにより、UV分光光度計を使用して評価されました。CPGヒドロゲルの放出制御能力を確認するために、サリチル酸濃度の標準曲線を使用して放出を定量しました。最後に、ヒドロゲルをpH 4.5および7.2の緩衝液に30分間浸漬してpH応答性を評価し、さまざまなpH条件下での体積と外観の変化を観察しました¹⁶。

CPGパッチの温度とpH応答性
CPGパッチ(直径約2 mm)をpH 7.2の5 mL緩衝液に入れ、温度制御されたウォーターバスを使用して37°Cに30分間維持し、生理学的条件を模倣しました。反射スペクトルは、400 nmから800 nmの範囲の波長でUV-Vis分光光度計を使用して測定されました。初期測定後、パッチを異なるpH値(pH 4.5、7.2、9.0など)の緩衝液に移し、37°Cで30分間維持した。色の変化を含む微小環境への反応を視覚的に観察し、反射率スペクトルを再度記録して色の変化を分析しました。この温度と pH の応答性は、ヒドロゲルが創傷環境の変化にどのように反応するかについての貴重な情報を提供します。

in vitro 抗菌試験
抗菌試験は標準的な手順を使用して実施されました。 黄色ブドウ球菌 (黄色ブドウ球菌、ATCC 25923) および 大腸菌 (大腸菌、ATCC 53868) 株を使用して、CPG パッチの抗菌活性を評価しました。これらの標準参照株は、American Type Culture Collection(ATCC)から購入され、抗菌試験手順を検証するための品質管理(QC)株として使用されました。抗菌薬感受性試験は、CLSI M100 ガイドラインに従ってブロス微量希釈法を使用して実施されました。細菌懸濁液は、抗菌試験の標準培地であるミューラー・ヒントンブロスで調製されました。濁度は、約 1.5 × 10⁸ CFU/mL に相当する 0.5 マクファーランド標準に調整されました。次に、懸濁液に、脱イオン水またはpH 6.0 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)緩衝液(10 mM)のいずれかで調製したCPGパッチ(直径2 mm)を接種しました。パッチは、培養物1 mLあたり1パッチの比率で細菌懸濁液に添加されました。懸濁液を37°Cで24時間インキュベートした。インキュベーション後、培養物を栄養寒天培地に連続希釈してプレーティングすることによって細菌の増殖を評価し、37°Cで24時間インキュベートした後、コロニー形成単位(CFU)をカウントしました。 この手順は、抗菌効果の定量的尺度を提供しました。

生体適合性評価
実験は前述のように行いました。CPGパッチは、PBS(pH 7.4)で4時間透析し、続いてエタノール滅菌(70%)を10分間、UV消毒(365 nm)を30分間処理して、すべての生物学的汚染物質を確実に除去しました。L929細胞(ATCC CCL-1)を、10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEM培地で37°C、5%CO² で培養し、細胞生存率を維持しました。細胞を24ウェルプレートに2×10⁵ 細胞/mLで、CPGパッチ(直径2 mm)の有無にかかわらず、3回に分けて播種しました。細胞は、ブランク コントロール、CPG グループ、および CPG (MES) グループの 3 つの実験グループに分けられました。24時間後、細胞代謝活性を評価するために広く受け入れられている方法であるMTTアッセイを使用して、細胞生存率を評価しました。MTTアッセイでは、20 μLのMTT(5 mg/mL)を各ウェルに添加し、続いて37°Cで4時間インキュベートしました。インキュベーション後、培地を取り除き、150 μLのDMSOを添加して、生細胞によって形成されたホルマザン結晶を溶解しました。吸光度は、マイクロプレートリーダーを使用して570 nmで測定され、生細胞の数を定量化しました。このアプローチにより、ヒドロゲルパッチの細胞毒性と生体適合性の信頼性の高い評価が保証されました。

抗炎症作用
CPG の抗酸化活性は、ROS アッセイ キットを使用して評価されました。L929細胞(ATCC、CCL-1)を、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したDMEM培地で培養し、細胞の付着と初期増殖を可能にするために、5%CO₂ とともに37°Cで24時間インキュベートしました。酸化ストレスを誘発するために、細胞を3μg/mLの過酸化水素(H2O2)で12時間処理しました。酸化ストレス誘導後、ヒドロゲル抽出物(1 mLのCPGハイドロゲルを1 mLのDMEM培地に溶解して調製)を細胞に添加しました。細胞をさらに12時間インキュベートして、CPGヒドロゲルの潜在的な抗酸化効果を考慮しました。続いて、細胞を10 μM DCFH-DA溶液(DMEM培地で希釈)で染色し、37°Cで20分間インキュベートしました。DCFH-DAは、細胞内の活性酸素種(ROS)を検出するために使用される蛍光プローブです。染色後、細胞をPBSで洗浄し、蛍光顕微鏡を用いて励起波長485nm、発光波長530nmの蛍光画像を撮影しました。緑色蛍光の強度はヒドロゲルの抗酸化活性と逆相関しており、細胞内の酸化ストレスを軽減するヒドロゲルの能力を視覚的に評価できます。

ラット骨髄炎動物モデル
慢性骨髄炎モデルが確立されました:雄のSprague-Dawleyラット(8週齢)は、イソフルラン(酸素中2〜3%)を使用して麻酔され、手術中に動かず、痛みがないことを確認しました。左大腿骨の外側に2cmの切開を行い、滅菌27-G針を使用して1 10⁷ CFUの 黄色ブドウ球菌 を大腿骨の小柱領域に直接注入しました。大腿骨の骨髄腔に注射を行い、骨髄炎の原発部位である骨髄腔に感染を誘発しました。細菌は、骨髄内に適切に沈着するためにゆっくりと送達されました。10日後、ラットを_CO2 吸入で安楽死させ、感染した大腿骨を注意深く解剖した。肉芽組織を感染部位から切除し、組織の完全性を維持するためにすぐに 4% パラホルムアルデヒドに 24 時間浸漬しました。固定後、骨の大きさに応じて、骨組織を脱灰剤(EDTAなど)を使用して48〜72時間脱灰し、組織学的および免疫組織化学的分析のための適切な切片化を可能にしました。次に、脱灰された骨サンプルを組織学的検査、免疫組織化学 (IHC)、および免疫蛍光染色のために処理しました。定量的リアルタイムPCR(qPCR)分析では、肉芽組織を-80°Cで保存してその後のRNA抽出を行い、炎症、骨再生、免疫応答に関連する遺伝子発現プロファイルの分析を可能にしました

in vivo骨髄炎治療評価
肉芽組織をパラフィンに包埋し、ミクロトームを使用して5μmで切片化しました。切片をマッソンのトリクロム染色(ヘマトキシリンで15分、アニリンブルーで1時間)で染色し、コラーゲン沈着と組織リモデリングを評価しました。ヘマトキシリンとエオシン (HE) 染色 (ヘマトキシリンで 5 分、エオシンで 2 分) を使用して、一般的な組織の形態と炎症を観察しました。抗CD31(1:100)および抗EGF(1:200)による免疫組織化学(IHC)を37°Cで1時間行い、続いて、使用する一次抗体に応じて、抗マウスIgGまたは抗ウサギIgG(1:200希釈)を使用して室温(RT)で30分間二次抗体インキュベートを行い、血管新生と成長因子の発現を評価しました。免疫蛍光染色を抗VEGF(1:100)および抗bFGF(1:200)で37°Cで1時間行い、続いてRTで30分間二次抗体インキュベートを行いました。蛍光顕微鏡を使用して、CD31、EGF、VEGF、およびbFGFの発現について切片を観察しました。定量的リアルタイムPCR(qPCR)分析では、RNAiso PlusによるRNA抽出とPrimeScript RT試薬キットを使用したcDNA合成後に、炎症誘発性サイトカイン(TNF-α、IL-1β、IL-6)のmRNA発現を分析しました。SYBR Green PCR Master Mix を使用して PCR を実行し、分子レベルで炎症反応を定量的に評価しました。

品質管理措置
実験結果の信頼性と再現性を確保するために、すべての手順は標準化されたプロトコルに従って実行されました。各実験には、変動を最小限に抑えるために、ブランク対照群( 黄色ブドウ球菌 に感染したが治療を受けていないラット)、対照群(細菌感染なしで治療を受けずに外科的処置を受けたラット)、および比較治療群(抗生物質や実験薬などの骨髄炎の異なる治療を受けたラット)などの適切な対照群が含まれていました。すべてのアッセイは、一貫性を確保し、実験バイアスを減らすために、3 回に分けて実施されました。統計的有意性を確保するために、各グループには6匹のラットが含まれていました。紫外可視分光光度計、レオメーター、引張試験機などの機器は、メーカーの仕様に従って使用前に定期的に校正されました。細菌および細胞培養は、バイオセーフティキャビネット内の制御された環境条件下で調製され、再現性を確保するために一貫したプロトコルを使用して染色手順に従いました。データ収集は、サンプル間のばらつきを最小限に抑え、正確な測定を保証するために、統一された顕微鏡設定で実施されました。

統計分析
統計分析は、GraphPad Prism(バージョン8.0)を使用して実行されました。データは平均±標準偏差 (SD) として表示されます。複数のグループ間の比較のために、一元配置分散分析 (ANOVA) とそれに続く Tukey の事後検定を使用して、機械的特性、熱応答性挙動、抗菌活性、および細胞生存率の違いを評価しました。スチューデントのt検定は、異なるpH値または温度変化でCPGパッチの反射ピークを比較する場合など、2つのグループのみが比較された場合のペアワイズ比較に使用されました。p < 0.05 は、すべての分析で統計的に有意であると考えられました。結果の一貫性と再現性を確保するために、すべての実験を 3 回に分けて実施しました。

結果

CPGパッチの製造と特性評価(図1)
典型的な実験では、単分散シリカナノ粒子を溶媒蒸発によって自己組織化して密に充填されたアレイを形成し、構造カラーコーティング(SCC)^17、18、19をもたらし、 図1に示すように、その後、多機能構造カラーヒドロゲルパッチを作成するために使用されました.このプロセスには、毛細管現象を介して SCC のナノスケールの隙間にプレゲル溶液を浸透させることが含まれていました。次に、UV 重合を使用して SCC とヒドロゲルのハイブリッド膜を形成しました。SCCがエッチングされると、周期的な多孔質構造を持つ逆抗タンパク質結石足場が得られました。最後に、熱応答性 GelMA ヒドロゲルを抗タンパク質結石足場のナノスケールの隙間に充填し、続いて硬化させて、独立した CPG パッチを作成しました。

ヒドロゲルの強力な架橋ネットワークは、CPGパッチに優れた機械的特性を与えました。パッチは損傷を与えることなく伸びに耐えるのに十分な強度があり、元の長さの 2.5 倍まで伸ばすことが観察されました。重要なのは、CPG パッチが鮮やかな構造色を示し、ストレッチ中に動的な色の変化を起こしたことであり、これはパッチ内の高次ナノ構造の周期的な配置から生じる独特の特徴です。これらのナノ構造はフォトニックバンドギャップ (PBG) を形成し、PBG 内の特定の波長の光が透過するのではなく選択的に反射され、CPG パッチに特徴的な構造色と反射ピークが与えられます。

CPGパッチのピーク反射位置は、式²⁰で推定できます。

λ = 1.633dn平均

ここで、d は回折面間の距離、n_平均 は材料の平均屈折率であり、これは、GelMA ヒドロゲルやパッチに使用されるその他の材料を含むコンポーネントの屈折率の平均として計算されます。この式は、パッチが引き伸ばされ、d が減少すると、反射波長が減少し、パッチの構造色に青色シフトが生じることを示唆しています。パッチの引張強度もテストされ、抗タンパク質結石足場のナノスケールの隙間にGelMAヒドロゲルが充填されたため、パッチのひずみ容量が低下することがわかりました。CPG パッチは伸びる際の変形により、ひずみ検出に高感度の手段が提供されるため、機械的監視が必要な用途に適しています。

CPGパッチの熱応答性およびpH感受性挙動(図2)
CPG パッチは、GelMA ヒドロゲルにより顕著な熱応答特性を示しました。環境温度を37°Cに上昇させると、ヒドロゲルは収縮し、水分子を放出し、貨物を積み込みました。この収縮により、CPG パッチ内のナノ細孔のサイズが縮小し、PBG が変化し、その結果、反射スペクトルが変化しました。 図2 は、この挙動を示しており、温度とpHの変化に応じてパッチの構造色がどのように変化するかを示しています。

これらの観察を確認するために、CPGパッチを37°C、pH7.2の模擬慢性感染創傷環境に配置しました。溶液のpHが上昇すると、CPGパッチの反射ピークに青色シフトが観察され、ナノ細孔のサイズが小さくなったことが示されました。逆に、pHが低下すると、パッチはナノ細孔の膨張に対応する赤方偏移を示しました。このpH感受性挙動は、酸性条件下でのCSMA-PBA中のボロン酸エステル結合の加水分解に起因し、結合が切断され、構造色の赤方偏移が生じました。しかし、pHがアルカリ性の場合、有意な色の変化は観察されず、塩基性条件下でのパッチの安定性が示されました。これらの発見は、CPG パッチを使用して創傷環境の温度と pH 変化の両方を監視できることを示唆しており、これは効果的な創傷管理に不可欠です。

CPGパッチの抗菌活性(図3)
CPG パッチの抗菌特性は、黄色ブドウ球菌および大腸菌と共培養することによって評価されました。図3A、Bは、CPGパッチが細菌の増殖を大幅に減少させ、効果的な抗菌特性を実証したことを示しています。この抗菌効果は、パッチの正に帯電したCMCSMA表面と負に帯電した細菌細胞壁との間の静電相互作用に起因した²¹。この相互作用により細菌の膜構造が破壊され、細菌の死につながりました。CMCSMA のカチオン基は細菌膜の陰イオン成分に結合し、膜の脱分極と透過性の増加につながります²²。さらに、CMCSMA は分子サイズが比較的小さく、ポリマー鎖が柔軟であるため、脂質二重層をより効果的に浸透し、細胞内物質の漏出を引き起こし、代謝活動を妨げます。CMCSMA 分子のサイズが小さいため、細菌の細胞膜への浸透がさらに促進され、そこで必須の生体分子と相互作用し、細菌の代謝と酵素系が破壊されました²³。さらに、黄色ブドウ球菌の強力なバイオフィルム形成能力を考慮すると、CMCSMA などのキトサンベースの材料が細胞外高分子物質 (EPS) マトリックスに浸透し、その完全性を妨害することにより細菌のバイオフィルムを破壊することが報告されていることは注目に値します。これにより、抗菌剤は、通常、従来の抗生物質に耐性のあるバイオフィルム内に埋め込まれた細菌にアクセスして殺すことができます^24,25。図3Aに示すように、細菌コロニーの視覚的比較は、CPGパッチによる治療後の大幅な減少を明確に示しており、それらの効果的な殺菌活性と、感染しやすい創傷環境での使用の有望な可能性を強調しています。

CPGパッチの生物学的機能(図4)
CPG パッチは、抗菌特性に加えて、重要な生物学的機能性を示しました。 図4C、D は、CPG群の緑色蛍光シグナルの減少によって示されるように、パッチが細胞内の活性酸素種(ROS)を効果的に除去したことを示しています。過剰な ROS 生成は組織の再生を損なう可能性があるため、ROS 除去は創傷治癒に不可欠です。CPGパッチと共培養したヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の生存率は、 図4Aに示すように、生存率染色を使用して評価されました。結果は、細胞の大部分が生きており、死んだ細胞の割合はごくわずかであることを示し、CPGパッチが細胞の生存率を促進し、細胞増殖をサポートすることを示唆しました。

図4B は、CPGパッチが細胞増殖を有意に促進することを実証したMTTアッセイの結果を示しています。さらに、 図4F、G は、CPGパッチが、内皮細胞の増殖と新しい血管形成に重要な血管内皮増殖因子(VEGF)および塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)の発現を促進することにより、血管新生を促進することを示しました。これらの結果は、感染を防ぐだけでなく、組織の再生を促進し、創傷治癒を促進する CPG パッチの可能性を浮き彫りにしています。

CPGパッチのin vivo評価(図5)
慢性骨髄炎モデルを使用して実施された in vivo 実験では、CPG パッチが感染と炎症を大幅に軽減することが示されました。図5Aは組織学的解析(H&E染色)を示しており、対照群は特徴的な炎症、骨破壊、壊死組織、防御細胞の高い浸潤を示したのに対し、治療群は感染、炎症、防御細胞の浸潤の有意な減少を示しました。CPG群では、骨芽細胞の移動の増加、骨芽細胞の骨細胞への形質転換、血管形成、新しい骨形成、感染の減少が観察され、組織再生の促進におけるCPGパッチの有効性がさらに確認されました。

さらに、 図5B は血管新生染色を示しており、CPGパッチが組織修復に重要な新しい血管の形成を促進したことを確認しています。これらの発見は、CPG パッチが感染の制御と組織再生の促進の両方において二重の役割を果たしており、慢性創傷治癒と骨再生の用途に非常に適していることを示唆しています。

図1:構造カラーヒドロゲルパッチ(CPG)の調製と特性評価。 (A):CSMAとPBAの反応。 (B): 伸ばしたときの色の変化を示す CPG の写真。(C):CPGのSEM特性評価。(D):CPGの膨潤挙動。(E):CPGの劣化プロファイル。(F):CPGからの薬物放出動態。スケールバー:100 nm。エラーバーは標準偏差(SD)を表します。実験群には6匹のラットを使用しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:CPGパッチのインテリジェントセンシング。 (A):環境温度とpHの変化に伴うCPGパッチの構造色の変化。(B):さまざまな温度でのCPGパッチのスペクトル分析。(C):異なるpHレベルでのCPGパッチのスペクトル分析。スケールバー:1mm。データは平均± SD を表し、Tukey の事後検定で一元配置分散分析を使用して分析されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:CPGパッチの抗菌活性。 (A): 黄色ブドウ球菌 と大 腸菌 とCPGパッチの共培養の代表的な画像。(B):光学濃度(OD)値の解析。スケールバー:5mm。エラーバーはSDを表します。統計的有意性は、Tukeyの事後検定による一元配置分散分析によって決定されました。グループごとに6回の反復を使用しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:CPGパッチの生物学的機能評価。 (A):CPGパッチと48時間共培養したHUVEC細胞の生存率染色で、生細胞(緑)と死細胞(赤)を示します。(B):MTTアッセイで測定された細胞増殖。(C):CPGパッチのROS染色。(D): VEGF 群の DPPH 除去率。(E):炎症因子のq-PCR分析。(F): CPG パッチによる血管新生の促進。(G):VEGFおよびbFGF発現のウェスタンブロット結果。(H):VEGFとbFGFのグレースケール値の統計解析。スケールバー:100μm。エラーバーはSDを表します。データは、Tukeyの事後検定で一元配置ANOVAを使用して分析されました。各グループに6匹のラットを使用しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:CPGパッチの in vivo 実験。 (A):HE染色;(B):血管新生染色。スケールバー:100μm。データは平均 ± SD を表し、Tukey の事後検定を使用した一元配置分散分析によって分析されます。各グループには6頭の動物が含まれていました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この研究の結果は、特に構造色の変化、温度感受性、pH 応答性、および抗菌特性の点で、CPG ヒドロゲル パッチの多機能性を実証しています。これらのヒドロゲルパッチは、機械的変形を受けると目に見える構造色の変化を起こす可能性があり、ひずみを監視するための非常に高感度なメカニズムを提供します。この特徴は、センサー用途の材料の構造色を調査した以前の研究と一致しており、そのような色の変化はひずみまたは圧力の指標として採用されています^26,27。私たちの研究は、創傷治癒をリアルタイムで評価するために不可欠な創傷ストレスを監視する非侵襲的手段としてこれらの色の変化を利用することで、これらの発見を拡張します。このような機械的ひずみを監視する機能は、臨床医に重要な情報を提供し、縫合糸の裂開などの合併症の初期兆候を特定するのに役立つ可能性があり、より的を絞ったタイムリーな介入をサポートします。重要なのは、光学式読み出しが、追加の電源やイメージング装置を必要とせずに、直接的かつ直感的なセンシングメカニズムを提供し、ポイントオブケアや在宅での術後ケアに最適な分散型モニタリングソリューションを提供することです。

CPG ハイドロゲル パッチの熱応答性と pH 感受性の挙動により、臨床使用の可能性が高まります。傷が治癒すると、特に感染や炎症がある場合、温度とpHの変動が一般的です²⁸。創傷部位の温度上昇と pH 値の変化は、これらの状態に関連していることが知られています。この研究では、CPG パッチはそのような変化に対して感受性を示し、局所的な創傷状態をリアルタイムで監視することができました。この機能は、治療戦略を最適化するために感染や炎症の早期発見が不可欠な臨床現場で特に価値があります。温度と pH の変化をモニタリングすることは、創傷状態の早期の非侵襲的バイオマーカーとして機能するため、創傷管理において特に重要です²⁹。体温の上昇は、臨床症状が現れる前に感染の発症を示す可能性がありますが、アルカリ性 pH へのシフトは、慢性化、微生物の定着、治癒障害を示すことがよくあります。対照的に、酸性環境は急性創傷と治癒の可能性の向上に関連しています²⁴。したがって、温度と pH 応答性要素を創傷被覆材に組み込むことで、タイムリーな介入と治癒の進行状況の継続的な評価が可能になり、創傷の悪化や全身感染への進行を防ぐことができます。これらの変化に動的に適応するハイドロゲルの能力は、臨床医が創傷の状態を継続的に監視するための新しいツールも提供し、治癒過程の追跡の精度を高めます。さらに、このような動的な応答性により、治療放出に対する時空間制御が可能になり、現代のスマート生体材料の中核的な目的である病理学的手がかりと薬物送達が確実に同期されます。

さらに、CPG ハイドロゲル パッチの抗菌特性は、創傷部位の細菌負荷を軽減する上で重要です。ヒドロゲルの構造に組み込まれたキトサンは、負に帯電した細菌の細胞壁との静電相互作用を促進するカチオン性の性質により、その抗菌特性が長い間認識されてきました²⁹。しかし、キトサン系材料の抗菌メカニズムは、単純な電荷引力にとどまりません。キトサンは細菌の膜と接触すると膜透過性を高め、カリウムイオン、タンパク質、核酸などの細胞内内容物の漏出を引き起こす可能性があります。さらに、キトサンは二価金属イオン (Ca²⁺ や Mg²⁺ など) をキレート化し、酵素活性と代謝機能を破壊する可能性があります。低分子量キトサンは、細菌の細胞壁を貫通して DNA に結合し、mRNA の転写とタンパク質合成を阻害することもあります。これらの多面的なメカニズムは、広く文書化されています。ハイドロゲル足場の多孔質構造は、表面積と細菌との接触を強化することでこれらの効果をさらに増幅し、相乗的な抗菌効果をもたらします。この特性は、バイオフィルムの形成が治癒過程を複雑にする骨髄炎などの慢性感染症の治療に特に関連しています^25,30。この研究の結果は、CPG ハイドロゲル パッチが細菌の増殖を抑制し、創傷部位の細菌負荷を軽減し、組織再生にとってより好ましい環境を作り出すのに効果的であることを示しています。この抗菌活性は、ヒドロゲルの他の特性と相まって、このパッチは、細菌汚染や治癒の遅れに悩まされることが多い慢性創傷を管理するための有望な候補として位置づけられています。さらに、ヒドロゲルは局所的な細菌のコロニー形成を阻害することにより、感染した慢性創傷でしばしば持続する炎症誘発性サイトカインのアップレギュレーションを間接的に防止し、それによって再生促進性微小環境を促進します。

ROS は通常、酸化ストレスや組織損傷に関連していますが、ROS の制御された生成が細菌の根絶に重要な役割を果たすことは広く認識されています。ヒドロキシルラジカルやスーパーオキシドアニオンなどのROSは、細菌のタンパク質、脂質、DNAを酸化し、最終的には膜の破裂や細胞死を引き起こす可能性があります。したがって、中程度のレベルの ROS の存在は、自然抗菌防御メカニズムの重要な要素として機能します。細菌のコロニー形成とバイオフィルム形成が持続する慢性骨髄炎の場合、病原体を排除することが有意義な組織再生の前提条件です。CPGハイドロゲルは、CMCSMAを介した膜破壊とバイオフィルム浸透を通じて効果的な抗菌活性を維持しながら、過剰なROSを抑制することにより、バランスの取れたアプローチを提供します。この二重の機能により、細菌の持続的な存在によって炎症が長引かず、免疫活性化から再生微小環境への移行が可能になります。したがって、このシステムは、ROSを無差別に除去するのではなく、酸化微小環境を調節して、細菌の除去と組織の治癒の両方をサポートします。

抗菌活性に加えて、CPGヒドロゲルパッチは、組織の修復と再生に不可欠な生物学的機能を示しました³¹。in vitroアッセイでは、ヒドロゲルが血管新生だけでなく、細胞の生存率と増殖をサポートすることが実証されました。これらの発見は、創傷治癒における血管新生の重要性を強調した以前の研究と一致しています³²。血管新生は、損傷した組織に適切な酸素と栄養素の供給を提供し、組織の再生を促進するために重要です。さらに、ヒドロゲルの血管新生促進効果は、慢性創傷の治療に特に重要であり、これらの創傷は血管新生不良に苦しむことが多く、治癒過程を妨げます^33,34。CPG ヒドロゲルは血管形成を促進することにより、組織の再生に貢献するだけでなく、新しく形成された組織の長期生存にとってより有利な環境を作り出します。さらに、骨芽細胞の移動と分化を促進するヒドロゲルの能力は、特に慢性骨感染症または骨欠損症の患者にとって、骨治癒の文脈で大きな価値を付加します³⁵。骨形成の促進は、治癒が損なわれることが多い骨髄炎および関連する骨の状態の転帰を改善するための有望な手段です。このような骨誘導機能は、局所的な感染制御と統合され、筋骨格系組織工学における中心的な課題、つまり単一のプラットフォームで抗菌防御と組織再生の両方を促進する収束ソリューションの必要性に対処します。

in vivo の結果は、CPG ハイドロゲル パッチの治療の可能性をさらに裏付け、組織修復をサポートし、感染を軽減し、骨形成を促進する能力を示しています。慢性創傷モデルでは、これらのヒドロゲルは創傷閉鎖と組織再生を効果的に促進しました。骨再生モデルでは、CPG ハイドロゲルが骨芽細胞の移動と分化を促進し、骨治癒を促進しました。これらの発見は、ハイドロゲルベースの創傷治癒と骨再生戦略を調査した他の研究の発見と一致しています³⁶。CPG ハイドロゲル パッチは、感染症への対処、血管新生の促進、骨形成のサポートを同時に行う能力により、包括的な創傷ケアのための強力なプラットフォームを提供し、臨床使用の有望な候補となっています。

これらの有望な結果にもかかわらず、現在の研究にはいくつかの制限があります。まず、 in vitro および in vivo モデルは肯定的な結果を示しましたが、前臨床研究は主にマウスモデルで実施されました。マウスは創傷治癒研究に広く使用されていますが、人間の創傷治癒の複雑さを完全に再現できない可能性があります。したがって、実際の臨床現場でこれらのヒドロゲルパッチの安全性と有効性を確認するには、大規模な動物モデルでのさらなる検証とヒトの臨床試験が必要です。第二に、CPGヒドロゲルは短期的には良好な機械的特性と生物学的機能を示しましたが、 生体内での 長期安定性と分解挙動は不明のままです。ハイドロゲルは時間の経過とともに分解する可能性があり、その分解生成物は治癒プロセスに影響を与えたり、副作用を引き起こしたりする可能性があります。今後の研究では、これらのヒドロゲルの分解速度を最適化し、有害な副産物を放出することなく制御された方法で分解することに焦点を当てる必要があります。さらに、特に慢性創傷治療において、長期にわたって持続的な治療効果を確保するために、ハイドロゲル内に組み込まれた生理活性剤の放出制御をさらに改良する必要があります。

この研究はヒドロゲルベースの超分子足場に焦点を当てていますが、同じ治療仮説に対処するための代替アプローチには、電気化学バイオセンサー、マイクロ流体創傷オンチップシステム、および環境センシング用の電子部品を組み込んだスマート包帯が含まれます。ただし、電源や複雑なインターフェースを必要とすることが多いテクノロジーとは異なり、ここで開発されたハイドロゲルパッチは、外部機器なしで自己完結型で視覚的に解釈可能なプラットフォームを提供するため、リソースが限られた環境にとって特に魅力的です。

この研究の重要性は、その翻訳の可能性にあります。CPG プラットフォームは、骨髄炎以外にも、糖尿病性足潰瘍、手術部位感染、腫瘍切除後のモニタリングなど、他の炎症関連疾患に合わせてカスタマイズできます。診断機能と治療機能を単一のヒドロゲルマトリックスに統合することは、次世代のスマート創傷被覆材の開発にまたとない機会を提供します。さらに、フォトニック結晶ベースの構造カラーシステムは、個別化医療に適用できるリアルタイムの比色バイオセンシングの機会を提供します。さらに、CPG 設計のモジュール性により、幹細胞、エクソソーム、または遺伝子送達ベクターとの将来の統合に適応して、精密再生医療の現在の軌道に合わせて再生能力をさらに拡張できます。

今後の研究は、いくつかの重要な分野に焦点を当てる必要があります。まず、CPG ハイドロゲル パッチの組成と構造を最適化することは、長期的な安定性と性能を向上させるために非常に重要です。架橋密度を変更し、成長因子やサイトカインなどの他の生理活性剤を組み込むことで、特定の臨床応用におけるヒドロゲルの治療の可能性を向上させる可能性があります。第二に、これらのヒドロゲルの応用範囲を慢性創傷を超えて、神経や軟骨の修復などの他の種類の組織再生に拡大することで、その多用途性をさらに実証できる可能性があります。CPG ハイドロゲルの臨床的適用性を拡大するには、糖尿病性潰瘍や褥瘡などの特定の創傷タイプに合わせてどのように調整できるかについての研究が必要です。第三に、幹細胞療法や遺伝子治療などの高度な治療法とハイドロゲルパッチを統合すると、その再生特性が強化され、より包括的で効果的な治療が可能になる可能性があります。最後に、CPGプラットフォームの安全性、製造可能性、ユーザーコンプライアンス、規制への対応状況を評価するために、大規模な多施設臨床試験と実世界での応用研究が必要となり、それによって最終的な臨床翻訳がサポートされます。

結論として、CPG ハイドロゲル パッチは、高度な創傷ケアと組織再生のための有望なプラットフォームとなります。創傷ストレスを監視し、温度と pH の変化に反応し、抗菌特性を示し、組織再生を促進する能力は、慢性創傷の治療に多面的なアプローチを提供します。前臨床研究の結果は有望ですが、臨床現場でこれらのハイドロゲルパッチの可能性を完全に実現するには、さらなる最適化と臨床検証が必要です。将来の研究の方向性には、材料組成の改善、より広範な用途、高度な治療戦略との統合、ヒトにおける有効性と安全性を確立するための臨床試験が含まれる必要があります。

この実験では、メチルCSMA-PBAを逆オパール足場として、温度応答性GelMAヒドロゲルをフィラーとして組み合わせて利用し、SAをロードして、CPG統合診断および治療スマート構造カラーヒドロゲルパッチを作成しました。実験結果は、このハイドロゲルパッチが優れた機械的特性と接着強度を示すことを示しています。細菌の増殖を阻害し、血管内皮増殖因子の発現を大幅にアップレギュレートし、炎症因子のレベルをダウンレギュレートすることができ、それによって COM の治療に重要な臨床的見通しをもたらします。さらに重要なことに、感染部位の温度と pH の変化を検出する CPG の能力に基づいて、慢性骨髄炎の術後回復におけるモニタリングの役割を果たします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アクリルアミド(AM、99%)	シグマ・アルドリッチ	A8887	ヒドロゲル重合用モノマー
塩化アクリロイル(AC、99%)	TCIケミカルズ	A0376	化学修飾反応に使用
アルカリアルミナ(200-300メッシュ)	アラジン	A112336	メタクリル酸メチルの精製に使用
抗bFGF抗体	サンタクルス	SC-9084	成長因子検出のための免疫蛍光染色
抗CD31抗体	アブカム	AB28364	血管マーカー検出のための免疫組織化学
抗EGF抗体	シグマ・アルドリッチ	E9644	免疫組織化学染色
抗VEGF抗体	サンタクルス	SC-7269	血管新生のための免疫蛍光染色
ビスアクリルアミド(BIS、97%)	シグマ・アルドリッチ	M7279	ヒドロゲルネットワークにおける架橋剤
細胞計数キット-8 (CCK-8)	道珍島	CK04	細胞生存率の評価
キトサン、メチルアクリル化(CSMA-PBA)	シグマ・アルドリッチ	C3641	ハイドロゲルパッチにおける足場形成
DCFH-DAプローブ	ビヨタイム	S0033	活性酸素(ROS)検出
ジメチルスルホキシド(DMSO)	中国製薬集団集団公司	DMSO-AR型	ハイドロゲル製剤用溶媒
大腸菌(E. coli)	ATCCの	-	抗菌試験に使用
蛍光顕微鏡	オリンポス	BX53	免疫蛍光と細胞イメージング
メタクリル酸ゼラチン (GelMA)	シグマ・アルドリッチ	G1894	温度応答性ハイドロゲル成分
塩酸(HCl)	重慶天雲	HCl-AR型	合成におけるpH調整
過酸化水素(H2O2)	シグマ・アルドリッチ	H1009	細胞に酸化ストレスを誘発する
フッ化水素酸(HF、4%)	シノファーム	H814912	シリカコロイド結晶のエッチング
インストロン万能引張試験機	インストロン	3345	機械的および接着強度試験
L929 細胞	ATCCの	CCL-1	細胞毒性および生体適合性アッセイに使用
ライカミクロトーム	ライカ	2235リンギット	組織のパラフィン切片化に使用
オスのスプレイグ・ドーリー・ラット(8週間)	レーガン・バイオテクノロジー	-	in vivo慢性骨髄炎モデル
マッソン's トリクロームステインキット	ソーラービオ	G1340	線維症の組織学的染色
メタクリル酸メチル(MMA、99%)	シグマ・アルドリッチ	M27805	足場形成用モノマー
MTTアッセイキット	ビヨタイム	M5655	細胞増殖と細胞毒性の評価
パラホルムアルデヒド(4%)	サービスバイオ	G1101	組織固定
パラフィン	シグマ・アルドリッチ	P1003	組織学用包埋培地
PBSバッファー	ギブコ	10010023	細胞およびヒドロゲル処理に使用
フェニルアラニン(99%)	シグマ・アルドリッチ	P5482	化学修飾に使用
フェニルボロン酸(PBA)	TCIケミカルズ	P0157	ハイドロゲル中のpH感受性成分
過硫酸カリウム(KPS)	北京宝陵威	KPS-AR型	重合におけるラジカル開始剤
PrimeScript RT試薬キット	タカラ	RR047A型	cDNA合成に使用
活性酸素種(ROS)アッセイキット	キージェンバイオテック	KGAF019	抗酸化活性評価
リアルタイムPCRシステム	アプライドバイオシステムズ	ステップワンプラス	遺伝子発現の定量化
RNAisoプラス	タカラ	9108	RNA抽出試薬
レオメーター(HR-1)	TAインスツルメンツ	HR-1	ハイドロゲルのレオロジー特性評価
サリチル酸(SA)	シグマ・アルドリッチ	S3254	ヒドロゲル中の薬物分子
走査型電子顕微鏡(SEM)	日本	JSM-7500F	ヒドロゲル構造の形態解析
シリカナノ粒子(12 nm)	シグマ・アルドリッチ	637246	シリカコロイド結晶テンプレートの形成
水酸化ナトリウム(NaOH)	中国製薬集団集団公司	NaOH-ARの	pH調整
黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌)	ATCCの	-	抗菌試験に使用
SYBR グリーンPCRマスターミックス	アプライドバイオシステムズ	4367659	qPCR検出試薬
UV光源(365 nm、3 mW/cm²)	ヒーローラボ	UVT-28	UV重合に使用
UV分光光度計	島津製作所	UV-2600	薬物放出測定