肺癌の同系同所性マウスモデルを生成するための低侵襲法

サマリー

肺がんの新しい治療法を開発する上の主な課題には、局所疾患が転移性疾患に進行する際の腫瘍微小環境のモデル化が含まれます。ここでは、肺がんの同所性同系モデルを確立する簡単な方法を説明し、経時的な疾患の in vivo 追跡を可能にします。

要約

非小細胞肺がん (NSCLC) は、世界中の女性と男性の両方にとって、がん関連死因の第 1 位であり続けています。より効果的な治療法を開発するには、がん細胞、免疫系、各腫瘍内の微小環境、宿主組織の間の相互作用を理解するには、より多くの情報を収集する必要があります。ここで報告されているのは、マウスの肺内でがんを誘発するための簡単で再現性のある方法であり、初期段階から後期段階の疾患までの腫瘍増殖のモニタリングを可能にします。外科的処置には、皮膚の小さな表面切開と、肋間筋から肺へのがん細胞の注射が含まれます。ルシフェラーゼを発現するように操作された細胞と組み合わせた in vivo イメージング システム (IVIS) は、研究の過程で腫瘍の増殖と疾患の進行を評価する便利な方法を提供します。この技術は、肺がんのさまざまなモデルに簡単に移行でき、自然な腫瘍微小環境を模倣した肺がんの前臨床モデルにおける新規治療法の実現可能性と有効性をテストするために使用できます。これにより、外科的切除、放射線、免疫療法と実験的治療法を併用した標準治療を使用した有効性と安全性/毒性試験の両方の関連性が広がります。

概要

肺がんは引き続き最も診断されているがんの 1 つであり、世界中の男性と女性のがん関連死因の第 1 位となっています ^1,2,3。非小細胞肺がん (NSCLC) は、米国における全肺がん症例のほぼ 90% を占めており、治療状況はここ数年で大幅に改善されましたが、転帰を改善する新しい治療法の開発には引き続き多くの関心が寄せられています⁴。特定のドライバー変異に対する標的療法や反応性NSCLCサブタイプの免疫療法の開発には多くの進歩がありましたが、全体的な5年生存率は依然として低く、^{肺がんのすべての}病期で約20%にとどまっています2,5,6,7。さらに、免疫療法は進行性疾患の生存率の改善において大きな進歩を遂げましたが、これらの改善は針を 6.8% の 5 年全生存率から 10.7% に動かし、生存期間を 7 か月から 8 か月に延長しただけです⁸。この疾患の作用機序を理解し、現在の標準治療と相乗効果を発揮する新しい治療法を開発することが依然として大きな必要性があります。NSCLCの自然な進行と新しい治療法への反応のメカニズムを理解するには、確実に再現性があり、誘発が容易で、がんが発生する腫瘍微小環境をカプセル化する前臨床モデルが必要です。

過去数十年にわたり、げっ歯類の肺がんの同所性モデルを評価するために、さまざまな手順が開発されてきました。処置は、胸腔を開く肺内移植または移植処置など、高度な専門知識を必要とする非常に侵襲的なものから多岐にわたります^{9、10、11、12、13};気管内および経口気管処置のような中程度の侵襲性^{14、15、16、17};経皮注射、尾静脈、鼻腔内導入などの低侵襲処置まで^{18、19、20、21}。すべての手順には異なるリスクと利点があり、より侵襲的な技術により精度は向上しますが、消耗率は高くなる可能性があり、侵襲性の低い技術により生存率は向上しますが、腫瘍移植部位の変動性が高くなります。これらのさまざまなプロトコルのうち、腫瘍の増殖を in vivo で追跡せず、腫瘍の ex vivo 9^{、11、12、16} の評価のみを完了することを選択するものもあります。経時的な腫瘍増殖を追跡するプロトコルのうち、初期のプロトコルは、コンピューター断層撮影(CT)^14,19、位置放出断層撮影(PET)¹⁸、磁気共鳴画像法(MRI)¹⁷などのシステムに大きく依存していましたが、後のプロトコルでは、生物発光イメージング(BLI)システムおよび遺伝子組み換え細胞がより容易に利用可能になった後、^BLI20を使用して経時的な腫瘍増殖を追跡することを選択します^。21.

このプロトコルを開発する目的は、これらの他の手順から学び、腫瘍が肺に限定されている初期疾患から始まるNSCLCの進行を研究するために、孤立性肺腫瘍を誘発するシンプルかつ信頼性の高い方法を作成することでした。この論文の全体的な目標は、 in vivo イメージングを使用して監視でき、研究者が疾患が発生する臓器の肺がんを研究できるようにする、信頼性が高く低侵襲の同系同所性マウスモデルを生成する方法を説明することです。この方法は、ヒト肺がん細胞株を用いた異種移植同所性マウスモデルと、免疫系が損なわれていないマウスにおけるマウス肺がん細胞株を用いた同系同所性マウスモデルの作製に有効であり、ヒトがんの種類と免疫系とNSCLCの複雑な相互作用の両方を研究する手法に汎用性を与えています。

このモデルにより、研究者は化学療法、放射線療法、免疫療法、その他の標的療法などの現在の治療法の有無にかかわらず免疫系の反応をよりよく理解できるため、免疫能力のあるNSCLCマウスモデルであるLewis Lung Carcinoma(LLC)でこのプロトコルを最適化することに焦点を当てました22,23,24,25.このプロトコルは、腫瘍が肺実質を超えて他の組織に種をまくことが多いため、接種時の早期疾患(肺実質の腫瘍)と研究の終わりに向かって転移を代表するモデルを生成します。

同所性モデルを研究する上で重要な側面は、動物へのストレスを最小限に抑えながら腫瘍の増殖を繰り返し追跡し、研究の各動物を単一の時点で迅速に評価できることです。MRIやCTなどのイメージング技術により腫瘍の解像度を高めることができますが、これらのイメージングモダリティは高価で時間がかかり、マウスなどの小動物モデルにおける初期の腫瘍増殖を追跡することが困難です^{26、27、28、29、30、31}。したがって、ルシフェラーゼで操作されたがん細胞を使用して、生物発光を通じて腫瘍の増殖を監視することを選択しました。このプロトコルでは、ホタルルシフェラーゼ(LLC-luc)で操作された25,000〜50,000個のLLC細胞を注入し、BLIによって翌日に腫瘍を検出しました。ルシフェリン-ルシフェラーゼ反応は、スペクトルイメージング装置を使用して in vivo で 腫瘍増殖を追跡するための有用なツールです。光の光子を追跡するこれらのイメージングシステムの感度により、ルシフェラーゼを発現するがん細胞は、多くの場合、MRIまたはCTによってマウスモデルで腫瘍が検出される前に、早期にin vivo で追跡することができ、多くの場合、^{26、32、33、34}。

プロトコル

動物が関与するすべての手順は、アイオワ大学施設動物管理および使用委員会 (IACUC) によって審査され、承認されます。C57BL6/N マウス (生後 4-6 週) を購入し、手術の少なくとも 1 週間前に順応させます。すべての動物は12時間の明暗サイクルにあります。動物はケージごとに4匹収容され、麻酔時まで餌と水に完全にアクセスできます。

1. 注射用細胞の選択と増殖

1. ルシフェラーゼアッセイを実行して、³⁵に記載されているように細胞株を選択する。
   1. 10%ウシ胎児血清(FBS)、L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)でLLC-luc細胞を、37°C、高湿度の5%_CO2 インキュベーターで増殖させます。細胞が50%〜100%コンフルエントになったときにアッセイを実行します。
   2. アッセイを実行する前に、細胞を1x PBSで洗浄します。
   3. 200 μLの溶解バッファー/ウェル(25 mM Tris/リン酸塩、4 mM EGTA、1%Triton X-100、10%グリセロール)を6ウェルプレートに加えます。ウェルから細胞をこすり落とし、微量遠心チューブに移します。細胞を室温で16,000 × g で5分間スピンします。チューブの底にコンパクトな細胞ペレットが形成されることを確認し、上清を新しい微量遠心チューブに集めます。
   4. 細胞抽出物の半分を新しい微量遠心チューブに移し、タンパク質定量のために保存します。残りの半分に2 mMジチオスレイトールを加え、よく混ぜます。
   5. 2 mMジチオスレイトールを含む8 μLの細胞抽出物を42 μLのアッセイバッファー(25 mM Tris/リン酸、20 mM MgSO₄、4 mM EGTA、2 mM ATP、1 mMジチオスレイトール)と混合します。50 μLの0.5〜1 mMルシフェリンを加えます。
   6. 相対光単位(RLU)として報告されたピーク発光を測定し、好ましいタンパク質定量法でタンパク質含有量を評価して、タンパク質 mg あたりの RLU (RLU/mg) として発光を報告します。
2. 発光が8,000〜15,000 RLU/mgの細胞株を選択します。
   注:より高いルシフェラーゼ発現(>15,000 RLU / mg)の選択は、BLI装置を飽和させる可能性があるため避けてください。

2. 細胞調製

1. 10%FBS、L-グルタミン、およびペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEMでLLC-luc細胞を、使用前に高湿度の37°Cの5%CO₂ インキュベーターで少なくとも1週間増殖させます。
   注:成長を監視してコンフルエントを70%〜80%に制限し、必要に応じて0.25%トリプシン-EDTAを使用して分割して、前述のように注射に必要な量に達します³⁶。

3. 術前の準備

1. 毛皮のあるマウスの場合は、手術の1日前に髭を剃ってください。
2. マウスを誘導チャンバーに入れ、イソフルランを使用して麻酔します。酸素流量を2.0 L / minに設定し、気化器を2%イソフルランに設定します。誘導されるマウスのサイズに基づいてこれを調整します。
3. マウスの呼吸を監視し、ペダル引き抜き反射を使用して適切な麻酔を確認します。
4. マウスを IACUC 承認の加温装置の腹臥位のノーズコーンに置きます。続行する前に、ペダル引き抜き反射を使用してマウスが適切に麻酔されていることを確認してください。
5. 両目に眼科用軟膏を塗ります。
6. マウスが適切に麻酔されたら、電動バリカンを使用して、マウスの左背側部分の大きな長方形の領域(2 cm x 3 cm)を取り除きます。背骨を内側に剃り、毛皮が見えなくなるまでテーブルを横に剃り、最後の肋骨(13番目)を下に剃り、肩甲骨の上端を頭に向かって剃ります。
7. マウスをIACUC承認の加温装置の空のケージに入れ、マウスが目覚めて警戒するまでマウスの呼吸を観察します。このとき、手術までマウスをホームケージに戻します。

4. 注射用細胞懸濁液の調製

1. 細胞採取の日(ステップ2.2)に、収集の3〜4時間前に50 mg / mLゲンタマイシンを含む新鮮な培地を追加して、死んだ細胞と剥離した細胞を除去します。
2. 培地を吸引し、細胞を1x PBSで洗浄します。トリプシン-EDTAを加え、37°Cで1〜2分間インキュベートします。
3. 細胞を分散させ、トリプシンを中和するために培地を加えます。50 mLのコニカルチューブに細胞を採取します。
4. 室温で1,200 × g で3分間回転させます。チューブの底にコンパクトな細胞ペレットが形成されることを確認し、上清を吸引し、ペレットを1x PBSで洗浄します。この手順を 3 回繰り返します。
5. 細胞ペレットを1x PBSに約1〜200万細胞/mLで再懸濁して計数します。計数する前に、40 μmのセルストレーナーでろ過します。
6. 10 μLの細胞懸濁液と10 μLのトリパンブルーを混ぜ合わせ、血球計算盤を使用してカウントします。細胞懸濁液を2回作り、両方をカウントして細胞数を確認します。総細胞数と生存率を計算します。
7. 細胞を室温で1,200 × g で3分間スピンダウンし、最終注入量で再懸濁します。PBSを吸引します。
8. 細胞を1x PBS中の0.5 mg/mLマトリゲルに50 μLの容量で注射ごとに所望の細胞数に再懸濁します。固化を防ぐために、手順全体を通して最終的な細胞懸濁液を氷上に保ちます。
   注:このプロトコルはLLC-lucセルを使用します。マウスあたり50 μLの容量で25,000〜50,000個の細胞を注入します。

5.外科的準備

1. 無菌処置のためにIACUC承認の手術室で処置を行います。獣医師が承認した消毒剤で手術台を掃除します。
2. 消毒されたIACUC承認の加熱パッドを手術エリアに置きます。加熱パッドの上に滅菌手術用ドレープを置きます。

6.外科的麻酔

1. マウスを誘導チャンバーに入れ、イソフルランを使用して麻酔します。酸素流量を2.0 L / minに設定し、気化器を2%イソフルランに設定します。
   注:イソフルラン濃度は、マウスのサイズに基づいて調整できます。
2. マウスの呼吸を監視し、ペダル引き抜き反射を使用して適切な麻酔を確認します。
3. マウスをノーズコーンに置き、滅菌外科用ドレープの右側横臥位に置きます。続行する前に、ペダル引き抜き反射を使用してマウスが適切に麻酔されていることを確認してください。
4. 術前鎮痛剤、メロキシカム(2mg/kg体重)を皮下投与し、眼科用軟膏を両眼に投与する。

7.同所性肺注射

1. 滅菌ガーゼを使用して、70% エタノールとベタジンを交互に使用して、手術部位を 3 回洗浄します。3 cm x 4 cmの開口部を持つ滅菌済みの有窓手術用ドレープをマウスの上に置きます。オートクレーブ滅菌した滅菌器具を手術用ドレープの上に置きます。
2. 鉗子を使用して肩甲骨の頭蓋縁と胸郭の尾縁を配置して、切開する場所を決定します。外科医の親指と人差し指を使用して皮膚がぴんと張っていることを確認し、サイズ 10 のブレードで肩甲骨の真下の皮膚のみに表面 5 mm の切開を行います。
   注:外科医は滅菌手袋を着用する必要があります。
3. 115mmのストレートハサミを使用して、肋骨と肋間筋から皮下脂肪を鈍く解剖します。肋間筋を切断しないでください。
   注:肩甲骨の近くにある胸背動脈と頸横動脈の深部枝を損傷しないように注意してください。皮膚内の毛細血管や皮下脂肪の切断により、軽い出血が発生することがあります。滅菌済みの綿の先端のアプリケーターで軽く圧迫して出血を止めます。
4. Micro-Adson 鉗子を使用して切開部を開いたままにします。7番目の真のリブから始めて、湾曲した中点鉗子を使用して上向きに数え、リブ4と5を識別します。この領域を注入することに注意してください。
5. 細胞懸濁液を3〜4倍に静かに反転させて混合します。注射の直前に、滅菌済みの300 μL 31 G 8 mmインスリンシリンジを使用して、50 μLの細胞懸濁液を抽出し、気泡が存在しないことを確認します。
6. 滅菌した厚さ4 mmの金属テープを針に追加し、注射器と同じ高さにして、ストッパーとして機能します。これにより、針は肺に4mmの深さしか入りません。
7. 50 μLの細胞懸濁液を、肺に対して垂直な90°の角度で、肋骨4と5の間の肋間腔の第4肋骨の真下に注入します。細胞懸濁液を注入した後、針を2〜3秒間所定の位置に保持して、マトリゲルが硬化し、細胞が注射部位から出るのを防ぎます。
8. 同じ角度で針をゆっくりと取り外し、鋭利物容器に捨てます。
9. 2〜3針のステッチを使用して皮膚を縫合し、四角い結び目で閉じ、動物用接着剤を追加して傷が十分に閉じられるようにします。

8. 術後の処置

1. マウスをIACUC承認の加熱装置の空のケージに入れます。マウスが麻酔から完全に回復するまで、1〜2分かかります。
2. マウスが警戒して動いたら、新しい寝具を入れたケージに入れます。最初の24時間以内にマウスを頻繁に観察し、痛みや感染の兆候がないか確認します。
3. NSAID鎮痛剤であるメロキシカム(2 mg / kg体重)を手術後2日間皮下注射で投与します。

9. in vivo BLIによる腫瘍増殖のモニタリング

1. BLIを使用して、手術の翌日から1日に1回程度の頻度で、肺の腫瘍の増殖を監視します。
2. in vivo イメージング システム (IVIS) を使用して in vivo イメージングを実行します。
   1. ルシフェリンを15 mg / mLで1x PBSに含めます マグネシウムまたはカルシウムを含まない。20 gのマウスの場合、これは15 mg / mLのルシフェリン溶液の200 μLを注射することに相当します。
      注:調製したルシフェリン溶液は光に敏感であるため、使用しないときはアルミホイルで覆い、光から保護します。
   2. ソフトウェアを開き、 生物発光イメージングのパラメータを設定します。 露光時間(Exposure Time) を 自動(Auto)に設定します。 [ビニング係数] を 4 に設定します。
   3. 体重1kgあたり150mgのルシフェリンをマウスに腹腔内注射します。
   4. 新しいがん細胞モデルを初めてイメージングする場合は、速度論的曲線を実行して、発光が頭打ちになり始める前にピークに達するタイミングによって示される最適なルシフェリン取り込み時間を特定します。
      1. マウスにルシフェリンを注射します。ルシフェリンが取り込まれるまで3分間待ちます。
      2. マウスを5〜10分ごとに60分間画像化します。
         注:異なる細胞株の最適な取り込み時間は、通常5〜15分で変化します。
   5. その後のすべてのイメージングセッションでは、最適なルシフェリン取り込み時間を使用してください。この間、イメージングの準備としてマウスを麻酔します。マウスを2.0 L / minの流量で2%イソフルランの誘導チャンバーに入れます。
   6. 取り込みが完了したら、[ 取得]を選択して2枚の画像を撮影します。
      1. 最初に、右側の横臥位で横たわっているマウスを画像化します。これにより、カメラはマウスの左側部分にある注射部位をキャプチャできます。このビューを使用して、腫瘍の増殖を定量化します。この位置で撮影された画像は、ここから左 横図として示されます。
      2. 最初の画像が完成した直後に、仰臥位のマウスの2番目の画像を撮影します。これにより、カメラは胸腔内の腫瘍から放出される光子を腹側から捉えることができます。このビュー(ここでは 腹側ビューと表記)を使用して、胸腔内のがんの位置を推定します。
3. 画像を解析するには、単位を [カウント] から [放射輝度] に変更します。
4. ツール パレートを開きます。[画像調整]に移動し、[手動]を選択します。撮影した画像に最適なカラーバーの最小値と最大値を選択します。
5. ROI ツールを開きます。円のドロップダウンを選択して、関心領域 (ROI) の円を画像に追加します。左側の側面図の場合は切開部の上に円を移動し、腹側図の場合は胸の中央の上に円を移動します。
6. [ROI の測定] を選択します。

10. 包含基準と除外基準の評価

1. まず、左側面図画像を観察して、肺に腫瘍発光が存在することを確認します。
2. 次に、腹側図画像で左胸腔に腫瘍発光が存在することを確認します。次に、腹側図の画像から発光の部位が 1 つしかないことを確認します。
3. これら 2 つの基準 (ステップ 10.1、10.2) が満たされている場合は、腹側図画像で発光が胸腔内の正中線を横切らないようにして、除外基準を評価します。手術後4日間に2回連続したIVIS画像の後、左側の側面図画像で発光が検出されない場合は、がん細胞が取らなかった可能性が高いため、このマウスをさらなる研究から除外します。

11. 研究終了時の腫瘍の評価

1. 腫瘍発光の総フラックスが1×10⁸ 光子/秒(p/s)以上に達したら、エンドポイント評価のためにマウスを採取します。
2. 前述のように、肺の麻酔および灌流のために以下のステップを実行して、肉眼的解剖学的分析または組織学のために腫瘍を採取します³⁷。
   1. マウスを誘導チャンバーに入れ、イソフルランを使用して麻酔します。酸素流量を2.0 L / minに設定し、気化器を2%イソフルランに設定します。マウスの呼吸を監視し、ペダル引き抜き反射を使用して適切な麻酔を確認します。
      注:イソフルラン濃度は、マウスのサイズに基づいて調整できます。
   2. マウスを仰臥位のノーズコーンに置きます。続行する前に、ペダル引き抜き反射を使用してマウスが適切に麻酔されていることを確認してください。
   3. マウスの胸腔を開き、横隔膜の後ろにある肺と心臓を視覚化します。
   4. マウスの正中線に沿って下に長い垂直切り込みを入れます。腸を動かして左腎動脈を視覚化します。
   5. 横隔膜を切り裂いて心臓を視覚化します。
   6. 左腎動脈を切断します。
   7. 約5〜10 mLの1x PBSを心臓の右心室に約5 mL /分の速度で注射します。
   8. 首に沿って切開します。気管の上にある皮下脂肪を取り除きます。気管を切らないように注意してください。
   9. 針で気管を平行に突き刺し、10%のホルマリンを気管に直接注入し、肺を膨らませて固定します。
   10. 肺の頂点より上の気管を切断して胸腔から肺を調達し、胸腔に肺を付着させる胸膜と靭帯を切断します。
   11. 10%ホルマリンを入れて固定します。

結果

この研究では、提示されたプロトコルに従ってC57BL6 / Nマウスを注射しました(図1)。ルシフェラーゼ(LLC-luc)を発現するように遺伝子操作されたLLC細胞を使用しました。さらに、偽マウスにがん細胞のないマトリゲルを注射しました。IVIS の BLI は、手術後 1 日で開始できます。この LLC-luc 研究は、早期肺がんを評価するために BLI で最適化されました。この論文で使用したBLIシステムは、メーカーの技術仕様に従って、10光子∙^s-1∙^cm-2∙sr-1の最小検出可能放射輝度(MDR)と50μmの最小画像ピクセル解像度を備えています。

ディスカッション

このプロトコルは、迅速な回復時間とほぼ即時の腫瘍モニタリングを可能にする最適化された低侵襲手順を説明しており、これは、以前に説明したより外科的に集中的な方法とは異なります 10,11,20,38,39,40,41,42,43,44,45...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.25% トリプシン-EDTA(1倍)	ギブコ	25200-056
10%中性緩衝ホルマリン	VWR	16004-112
100mm x 20mm 組織培養処理皿	ドット・サイエンティフィック社	667621
190プルーフ 純エタノール	デコン・ラボ	2801
3/10mLのインスリン注射器、BDウルトラファイン針、31G x 5/16インチ。	ベックトン・ディキンソン	328438
3Mベットボンド	3歳	1469SB
ATP	シグマ	A5394
ベタジン溶液 10%ポビドン-ヨウ素消毒剤	アルヴィオ・ヘルスL.P.	67618-150-04
C57BL6/Nマウス	チャールズリバー研究所
セルストレーナー40umナイロン	隼	352340
コンパクト麻酔装置	ベタマック麻酔
コントローラー付きの遠赤外線ウォーミングパッド	ケント・サイエンティフィック・コーポレーション
従来の手術用ブレードハンドル、サイズ3	ブラッド・パーカー	371030
曲面中点汎用鉗子	フィッシャーブランド	16-100-110
ジチオスレイトール	リサーチプロダクツ・インターナショナル	D11000
D-ルシフェリン(ナトリウム塩)	ケイマン・ケミカル	14682
ドレープ、外科 18インチ×26"非フェネストリード、不妊	ディールメッド	783410
ダルベッコs モディファイドイーグル中型(1両)	ギブコ	11965-092
ダルベッコリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)1回	ギブコ	14190-144
EGTA	シグマ	E3389
胎児用牛血清	ギブコ	A5670402
FL150 光ファイバー顕微鏡光源	明治
ゲンタマイシン硫酸塩溶液	IBIサイエンティフィック	IB02030
グリセロール	リサーチプロダクツ・インターナショナル	G22025
イソフルラン	プライマル・ファーマ・リミテッド	66794-013-25
IVIS ルミナ S5	PerkinElmer
リビングイメージソフトウェア	PerkinElmer
LL/2(LLC1)	ATCC	CRL-1642	研究のニーズに最も適したがん細胞株を使い、nbsp;
硫酸マグネシウム	フィッシャー・サイエンティフィック	M63
マトリジェル基底膜マトリックス	コーニング	354234
メイヨー・ヘガー針ホルダー、6インチ、ギザギザの顎	ミルテックス	8-44TC
マイクロアドソン鉗子	ファインサイエンスツール	10018-12
N5 ドッグポートリマー(ダブルブレード付き)	Oneisall
非滅菌、12層のガーゼスポンジ	NDC	P157112
オプティクスケア アイローブ	アヴェンティクス	5914304
ペニシリン・ストレプトマイシン	ギブコ	15140-122
パーマハンドシルク縫合糸 6-0 1 x 18インチ	エティコン	K802H
リン酸 85%	フィッシャー・サイエンティフィック	A242
メス用刃サイズ10、ステンレス製、滅菌済み	シンシナティ・サージカル	110
スクリューキャップチューブ 円錐形 50 mL	サーステット	62.547.100
ティッシュシザーズ 4.5インチStaight Premium	オンスン	SCT115
トライトン X-100	シグマ	T6878
トリズマ基地	シグマ	T1503
トリパンブルーステイン(0.4%)	ギブコ	15250-061
ユーティリティアルミホイルテープ(ライナー付き)	IPG	ALF150L
木製シャフトコットンチップアプリケーター	NDC	76200