方法論記事

RNA In Situ ハイブリダイゼーションアッセイによるマウス脳内のインスリン受容体AおよびBの精密な可視化

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DOI：

10.3791/68677

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2025年7月15日

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1Diabetes Section/Laboratory of Clinical Investigation, National Institute on Aging, National Institutes of Health

この記事について

サマリー

私たちは、マウス脈絡叢のインスリン受容体アイソフォームIR-AおよびIR-BをマッピングするためのDuplex in situ ハイブリダイゼーションアッセイを確立し、従来の方法の限界を克服しました。この高解像度のアプローチにより、アイソフォーム特異的な発現が明らかになり、脳のインスリンシグナル伝達と神経疾患のアイソフォーム標的療法の可能性に関する新たな洞察が得られます。

要約

インスリン受容体(IR)は、すべての組織とすべての細胞タイプで広く発現しています。それは、選択的エクソン11スプライシングのために12アミノ酸が異なる2つの機能的に異なるアイソフォーム(IR-AおよびIR-B)で存在します。これらのアイソフォームは、組織および細胞特異的な発現パターンを示し、その相対的な存在量は発生、老化、および疾患を通じて変化します。その配列の類似性が高いため、従来の免疫学的方法を用いてIR-AとIR-Bを区別することは困難でした。ここでは、組織におけるIR-AおよびIR-B発現の可視化を可能にする新しいDuplex in situ ハイブリダイゼーション(ISH)アッセイについて説明します。このアプローチを使用して、両方のアイソフォームがマウスの脈絡叢で発現している一方で、IR-Aが優勢であることを初めて示します。この方法は、さまざまな組織にわたるインスリン受容体アイソフォーム のin situ 空間分布を調査するための強力なツールを提供します。リアルタイムqPCRは、単細胞 in vitro 培養中のIR-AおよびIR-B転写産物を検出できますが、複雑な組織内での空間的局在化の能力が不足しているため、デュプレックスISH技術の必要性と有用性が浮き彫りになっています。

概要

インスリン受容体(IR)は、インスリンの多様な生理学的効果を媒介するシングルパス膜貫通酵素受容体です。二量体タンパク質として機能し、各モノマーはジスルフィド結合によって結合された2つのペプチド鎖で構成されています:リガンド結合ドメインを含む細胞外αサブユニットと、細胞内配列が固有のチロシンキナーゼ活性を持つ膜貫通βサブユニット1。エクソン11の選択的スプライシングにより、IR遺伝子の転写により、2つのIR mRNAバリアントが生じます。IR-Aはエクソン11を欠いていますが、IR-Bはエクソン11を保持しています。その結果、IR-AとIR-Bは、αサブユニットのC末端付近で12アミノ酸配列が異なるため、成熟インスリン以外の成長因子の明確な結合が生じ、下流のシグナル伝達特性も変化します。どちらの変異体もインスリンに対して同様の親和性を示しますが、IR-AはIR-Bと比較してインスリン様成長因子-II(IGF-II)およびプロインスリンに対して高い親和性を示します。IR-AとIR-Bの発現パターンは、組織や細胞の種類、疾患状態によって異なります2。

組織や疾患におけるそれらの異なる発現は、生理学と病理学への彼らのユニークな貢献を強調しています。脈絡叢(CP)は、脳脊髄液(CSF)を生成し、血液CSF関門の一部を形成する特殊な構造であり、特に炎症時に、栄養素の輸送、老廃物の除去、および神経保護に重要な役割を果たします。どちらのIRアイソフォームもCPで発現し、CSFの量と組成を調節している可能性があります。IR-Aは、IGF-IIによる高親和性結合により、CP上皮の細胞増殖と組織修復を促進する可能性があります。一方、IR-Bは、血液-CSF関門を越えるインスリン輸送に関与しており、アストロサイト、ニューロン、グリア、およびグルコース恒常性に対する脳内のインスリンの利用可能性をサポートしています3,4。

糖尿病予備軍のIRレベルは、アルツハイマー病(AD)の遺伝的リスクがある無症候性の個人におけるCSFタウの上昇と関連しており5、IR-A/IR-B比の変化は、インスリン抵抗性、老化、およびがんやその他の病状に寄与する可能性のある増殖活性因子の増加に関連しています6。IR-AおよびIR-Bのアイソフォーム特異的発現パターンの同定は、複雑な中枢神経系障害に対する新たな治療戦略の開発に向けた重要なステップです。しかし、免疫染色やqPCRなどの現在のアプローチは限られており、バリデーションされた抗体がないためにすべてのタンパク質を確実に免疫標識できるわけではなく、qPCRは特異性が高いものの、空間分解能に欠けています。

これらの制限を克服するために、RNAscopeプラットフォームBaseScopeに基づく高度なRNA検出技術であるDuplex in situ ハイブリダイゼーション(ISH)を利用しました。このアッセイは、標的RNAへのタンデム結合を必要とする独自のdouble-Zプローブ設計を採用しており、低存在量の転写産物であっても高い特異性と感度を実現します。蛍光シグナルまたは発色シグナルは、複数のプローブ結合イベントを通じて増幅され、検出を強化し、バックグラウンドを減少させます7。標準的なRNAscopeとは異なり、このアッセイは短いRNA配列(50-300塩基)を検出するように最適化されているため、脳8のような複雑な組織における選択的スプライシングイベント、一塩基変異体、およびまれな転写産物の同定に特に適しています。

このアッセイは、明視野下でターゲットを異なる緑(C1)と赤(C2)の発色シグナルとして同時に可視化します。4%パラホルムアルデヒド(PFA)または10%中性緩衝ホルマリン(NBF)に固定し、5 μm-15 μm(凍結/FFPE)で切片化した組織(低存在量から高存在量のRNAを含む)を使用して成功を保証します。RNAの分解、過剰固定、プローブエラーに対する感度が高いため、特異性を最大化し、バックグラウンドを最小限に抑えるために、前処理、プローブ設計、および制御を最適化する必要があります。ここでは、このデュプレックスISHアッセイを適用して、マウスCPにおけるIR-AおよびIR-Bの発現パターンを特徴付け、IRアイソフォームの空間生物学と脳の健康と疾患におけるそれらの可能な役割についての新たな洞察を提供しました。

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プロトコル

すべての動物実験手順は、米国実験動物ケア認定協会(AAALAC)によって完全に認定されている国立老化研究所(NIA)によって承認されたプロトコルに準拠して実施されました。プロトコルは、NIA学内研究プログラム(IRP / NIA)の動物管理および使用委員会によってレビューされ、承認されました。マウスは、12時間の明暗サイクルの下で温度制御された施設に収容され、特に指定がない限り、水と標準的な食事に自由にアクセスしました。C57BL/6J雄マウスをジャクソン研究所から入手し、生後3〜4ヶ月で実験に使用しました。

1. 固定凍結サンプル調製

  1. 新たに調製した4% PFAを1x PBS溶液でマウスに灌流し、新たに調製した4% PFAに全脳を4°Cで17〜24時間浸します。
    注:組織を4%PFA(各脳に10 mL)に24時間以内置く。
  2. 組織が容器の底に沈むまで、組織を1x PBSの1x PBS中、4°Cで10%(10 mL)スクロースに浸します。次に、組織を20%スクロースに順次移し、最後に30%スクロースに移し、各ステップで組織を沈めるようにします。
    注:ティッシュが沈むのに必要な時間は、ティッシュの種類とサイズによって異なります。脳組織の場合、約18時間かかります。
  3. 組織をOCT包埋培地で凍結し、組織ブロックを-80°Cの密閉容器に保管します。
  4. ホルムアルデヒド固定された凍結脳組織を10μmのスライスに冠状に切片化し、使用するまで-80°Cで保存します。
    注:正に帯電した顕微鏡スライドにセクションを取り付けます。他のスライドタイプは、組織の損失を引き起こす可能性があります。スライドをすぐに使用しない場合は、-80°Cで最大3か月間保管してください。

2. デュプレックス検出アッセイ前の切片前処理

  1. アッセイ当日は、スライドを1x PBSで5分間洗浄し、スライドラックをゆっくりと上下に動かして残留OCTを除去します。
  2. スライドを60°Cで30分間焼きます。
  3. スライドを1x PBSで予冷した4% PFAに4°Cで15分間ポストフィックスします。
  4. スライドをEtOHシリーズを介して順番に転写します:RTで5分間5分間50%EtOH、RTで5分間70%EtOH、RTで5分間100%EtOH、RTで5分間再び100%EtOH。
  5. スライドをRTで5分間風乾します。
  6. 各切片に2〜4滴の過酸化水素を塗布し、RTで10分間インキュベートします。
  7. ビーカーに新鮮な1x Target Retrieval溶液700 mLを調製します。ホイルで覆い、沸騰させます(99〜100°C)。
    注意: 使用前に30分以上沸騰させないでください。その間、オーブン( 材料の表を参照)を40°Cに予熱します。
  8. スライドラックを沸騰したターゲット回収溶液に慎重に浸し、5分間インキュベートします。温度を98〜102°Cに維持し、注意深く監視します。
    注:組織の種類によっては、沸騰時間を調整する必要がある場合があります(5〜15分)。
  9. すぐにホットスライドラックを蒸留水を入れた皿に移し、ラックを3〜5倍上下に動かします。新鮮な蒸留水で繰り返します。
  10. スライドを新鮮な100%EtOHですすぎ、スライドを3〜5倍上下に動かします。
  11. 疎水性バリアペンを使用して、各組織切片の周りを2〜3回描きます。RTでバリアが完全に乾くのを待ちます。
  12. スライドをバッチスライドトレイに置きます。各切片にプロテアーゼ( 材料表を参照)を添加し、組織が十分に覆われていることを確認します。40°Cのオーブンで15分間インキュベートします。
    注:プロテアーゼのインキュベーション時間は、組織の種類と標的遺伝子によっては調整が必要な場合があります。
  13. スライドトレイをオーブンから取り出し、蒸留水に入れます。スライドを上下に動かして2分間静かに洗い、この手順を新鮮な蒸留水で2回繰り返します。

3. デュプレックス検出アッセイ

  1. プローブ
    1. ポジティブコントロールプローブとネガティブコントロールプローブ用に2つの追加セクションを準備します。
    2. ターゲットプローブと同じ数のZZペアを持つコントロールプローブを選択します。1 ZZペアの場合は、ポジティブコントロールとネガティブコントロールを使用します( 材料の表を参照)。
    3. 使用前に、プローブを40°Cで10分間平衡化し、AMP1-12試薬をRTに持ち込みます。
  2. プローブハイブリダイゼーション
    1. C2プローブを短時間スピンダウンし、C1プローブと1:50の比率で混合します。十分な量のプローブ(100〜200 μL)ミックスを各切片を完全に覆うように加え、スライドを40°Cのオーブンで2時間インキュベートします。スライドをRTの1x Wash bufferで2 x 2分間洗浄します。
    2. ベーススコープデュプレックスAMP1アプリケーション
      1. スライドから余分な洗浄バッファーを取り除き、AMP1(100〜200 μL)を添加して各切片を完全に覆います。オーブンに戻り、40°Cで 30分間インキュベートします。
      2. 1x Wash Bufferで2 x 2分間洗浄します。
    3. ベーススコープデュプレックスAMP2アプリケーション
      1. スライドから余分な洗浄バッファーを取り除き、AMP2(100〜200 μL)を添加して各切片を完全に覆います。オーブンに戻り、40°Cで 30分間インキュベートします。
      2. 1x Wash Bufferで2 x 2分間洗浄します。
    4. ベーススコープデュプレックスAMP3アプリケーション
      1. スライドから余分な洗浄バッファーを取り除き、AMP3(100〜200 μL)を添加して各切片を完全に覆います。オーブンに戻り、40°Cで 15分間インキュベートします。
      2. 1x Wash Bufferで2 x 2分間洗浄します。
        注:インキュベーションは15分を超えないようにしてください。
    5. ベーススコープデュプレックスAMP4アプリケーション
      1. スライドから余分な洗浄バッファーを取り除き、AMP4(100〜200 μL)を添加して各切片を完全に覆います。オーブンに戻り、40°Cで 15分間インキュベートします。
      2. 1x Wash Bufferで2 x 2分間洗浄します。
    6. ベーススコープデュプレックスAMP5アプリケーション
      1. スライドから余分な洗浄バッファーを取り除き、AMP5(100〜200 μL)を添加して各切片を完全に覆います。オーブンに戻り、40°Cで 30分間インキュベートします。
      2. 1x Wash Bufferで2 x 2分間洗浄します。
    7. ベーススコープデュプレックスAMP6アプリケーション
      1. スライドから余分な洗浄バッファーを取り除き、AMP6(100〜200 μL)を添加して各切片を完全に覆います。オーブンに戻り、40°Cで 15分間インキュベートします。
      2. 1x Wash Bufferで2 x 2分間洗浄します。
        注:AMP3については、インキュベーション時間が15分を超えないようにしてください。
    8. ベーススコープデュプレックスAMP7アプリケーション
      1. スライドから余分な洗浄バッファーを取り除き、AMP7(100–200 μL)を添加して各切片を完全に覆い、 室温 で 30分間インキュベートします。
        1. 1x Wash Bufferで2 x 2分間洗浄します。
          注:AMP7と室温(RT)で30分間インキュベートします。
    9. ベーススコープデュプレックスAMP8アプリケーション
      1. スライドから余分な洗浄バッファーを取り除き、AMP8(100–200 μL)を添加して各切片を完全に覆い、 室温 で 15分間インキュベートします。
      2. 1x Wash Bufferで2 x 2分間洗浄します。
        注:AMP8インキュベーションと併用して、RTで15分間インキュベートします。
    10. 赤信号検出(C2)
      1. Fast Red-Bを短時間スピンダウンし、Fast Red-Aと1:60の比率で混ぜます。
      2. 各切片(100〜200 μL)に塗布し、トレイに蓋をして、暗所の室温で10分間インキュベートします。
      3. 1x洗浄バッファーで2x洗浄します。
        注意: 5分以内に混合されたファストレッド溶液を使用してください。光(日光またはUV)から保護します。
    11. ベーススコープデュプレックスAMP9アプリケーション
      1. スライドから余分な洗浄バッファーを取り除き、AMP9(100〜200 μL)を添加して各切片を完全に覆います。オーブンに戻り、40°Cで 15分間インキュベートします。
      2. 1x Wash Bufferで2 x 2分間洗浄します。
    12. ベーススコープデュプレックスAMP10アプリケーション
      1. スライドから余分な洗浄バッファーを取り除き、AMP10(100〜200 μL)を添加して各切片を完全に覆います。オーブンに戻り、40°Cで 15分間インキュベートします。
      2. 1x Wash Bufferで2 x 2分間洗浄します。
    13. ベーススコープデュプレックスAMP11アプリケーション
      1. スライドから余分な洗浄バッファーを取り除き、AMP11(100〜200 μL)を添加して各切片を完全に覆います。 室温 で 30分間インキュベートします。
      2. 1x Wash Bufferで2 x 2分間洗浄します。
        注:AMP11と室温で30分間インキュベートします。
    14. ベーススコープデュプレックスAMP12アプリケーション
      1. スライドから余分な洗浄バッファーを取り除き、AMP12(100〜200 μL)を添加して各切片を完全に覆います。 室温 で 15分間インキュベートします。
      2. 1x Wash Bufferで2 x 2分間洗浄します。
        注:インキュベーションは15分を超えないようにしてください。
    15. グリーンシグナル検出(C1)
      1. Fast Green-Bチューブを短時間スピンダウンし、Fast Green-Aと1:50の比率で混合します。
      2. GREEN溶液を各切片(100〜200 μL)に塗布し、トレイを覆い、室温で10分間インキュベートします。
      3. 1x Wash Bufferで5分間洗浄し、蒸留水で短時間すすいでください。
        注意: 5分以内に混合されたファストグリーン溶液を使用してください。光から保護してください。緑のBとAの比率は1:50です。REDとGREENの基質はどちらも アルコール感受性です。アルコールを含む試薬は使用しないでください。

4.カウンターステイン

  1. スライドを50%ヘマトキシリン染色溶液に室温で1分間浸漬し、切片が紫色になるまで浸します。
  2. 上下に動かして水道水で3〜5回すすぎます。背景がクリアになるまで、新鮮な水道水で繰り返しますが、セクションは紫色のままです。
  3. 0.02%のアンモニア水を入れて、セクションが青色に変わるまで3回上下にスライドさせます。
  4. 水道水で再度3〜5回すすいでください。

5. 取り付け

  1. スライドを60°Cのドライオーブンで~15分間完全に乾燥させます。
  2. 新鮮なキシレンに浸します。
    注:封入剤は非常に粘性が高いため、埋込前にキシレンを少し浸すと、組織切片全体に培地が滑らかに広がり、カバースリップの下の気泡の形成が減少します。
  3. 埋込剤( 材料表を参照)をスライドとカバースリップに塗布し、気泡を避けます。
  4. 少なくとも5分間空気乾燥スライドします。

6. サンプルの評価

  1. 標準的な明視野顕微鏡で切片を20倍または40倍の倍率で画像化します。(図1)。
    注:ポジティブコントロールは、セルに句読点を表示する必要があります。ネガティブコントロールは、20倍の倍率で20セルあたり1ドット以下であれば許容されます。

7. 採点(オプション)

  1. 画像解析ソフトウェア(Halo、QuPathなど)を使用して、細胞あたりのRNAドットを定量化します。

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結果

インスリン受容体(IR)は、2つの細胞外αサブユニットと2つの膜貫通型βサブユニットからなる膜貫通型チロシンキナーゼ受容体であり、機能的なヘテロ四量体を形成しています。αサブユニットはインスリン結合を媒介し、βサブユニットは下流のシグナル伝達を開始する内因性チロシンキナーゼ活性を持っています。エクソン11のIR mRNA選択的スプライシングは、IR-AとIR-Bの2つのアイソフォームを生成します。このように、IR-Bは、α-サブユニットのC末端領域内にエクソン11によってコードされる12-アミノ酸セグメントを含むが、IR-Aはこのセグメントを欠いている。

脳組織におけるこれらのアイソフォームを区別するために、エクソン10-12接合部(エクソン11をスキップ)を標的とするIR-Aプローブと、エクソン11-12接合部を標的とするIR-Bプローブの2つの特異的プローブを使用しました。Duplex in situ ハイブリダイゼーション(IS...

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ディスカッション

脳内では、インスリン受容体(IR)の発現は不均一であり、嗅球、視床下部、海馬、脈絡叢などの領域で高密度が観察されます10。特定の脳領域および細胞型における変異発現パターンの包括的な特性評価は、重要な情報を提供し、シナプスの可塑性、学習、および記憶におけるインスリンおよびIGF-IIシグナル伝達の特定の役割を研究し理解することを可能にする12。さらに、これにより、複雑な神経障害に関与する病理学的プロセスについてより深い洞察を得ることができます。脳内のIR-AおよびIR-B発現の調節不全は、アルツハイマー病、うつ病、自閉症、統合失調症など、さまざまな神経学的および神経精神医学的障害にすでに関与しています6。アイソフォーム特異的な発現パターンの同定は、これらの複雑な中枢神経系疾患の治療において探求される全く新しい領域であるIR-AまたはIR-Bのいずれかを標的とした選択的治療戦略の開発に向けた基本的なステップとなるでしょう。

...

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開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、学内研究プログラム/国立老化研究所/国立衛生研究所の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アンモニウム水電子顕微鏡科学 26754-4A
BaseScope Dulplex検出試薬キットACDバイオ323810
BaseScope Dulplex デュプレックス ポジティブ コントロール プローブ - マウス (mm)-C1-PPIB-1ZZ/C2-Polr2A-1ZZACDバイオ700121
BaseScope Dulplex デュプレックス ポジティブ コントロール プローブ-C1-DapB-1ZZ/C2-DapB-1ZZACDバイオ700141
ギルのヘマトキシリン Iシグマ・アルドリッチGHS132-1L
ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) 高度交差吸着二次抗体、Alexa Fluor Plus 488インビトロゲンA32731
HybEZ オーブン、トレイ、ラック、ウォッシュトレイACDバイオ321721, 310012, 321716, 321717
ImmEdge 疎水性バリアペンベクターラボH-4000型
INSRアイソフォームAおよびBプローブ:BA-Mm-Insr-tv1-E10E11、BA-Mm-Insr-tv2-E11E12-C2ACDバイオ717411、717421-C2
インスリン受容体抗体細胞シグナル伝達 23413
RNAscope 10x ターゲット検索ACDバイオ322000
RNAscope 過酸化水素、プロテアーゼプラスACDバイオ322381
生理食塩水-クエン酸ナトリウム(SSC)20xフィッシャーサイエンティフィックBP1325-1
スーパーフロストプラススライドフィッシャーサイエンティフィック12-550-18
VectaMount パーマネント マウント メディアベクターラボH-5000型

参考文献

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IR A IR B ISH RNA

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