神経線維腫症 1 型 (NF1) は、成長に特定の神経微小環境を必要とする良性末梢神経鞘腫瘍 (神経線維腫) を引き起こします。NSGマウスへのヒトシュワン細胞の神経内注射を使用して、最適化された同所性異種移植モデルが開発されました。このモデルはヒト神経線維腫を要約し、治療戦略を評価するための貴重なプラットフォームを提供します。
方法論記事
神経線維腫症 1 型神経線維腫に対する同所性坐骨神経異種移植片
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
神経線維腫症 1 型 (NF1) は、 NF1 遺伝子の病原性多様体によって引き起こされる遺伝性疾患であり、神経線維腫機能の喪失と神経線維腫として知られる良性末梢神経鞘腫瘍の発症につながります。遺伝子操作マウスモデル(GEMM)は、NF1の病態生理学の理解を深めましたが、患者由来の神経線維腫の自然な腫瘍形成と微小環境の複雑さを再現できないことがよくあります。良性神経線維腫のモデル化における重要な課題は、従来の異種移植アプローチでは概略されない神経微小環境への依存性です。ここでは、NF1関連神経線維腫に対して最適化された同所性異種移植モデルが開発されました。このモデルは、NSG免疫不全マウスの坐骨神経への不死化神経線維腫由来のヒトシュワン細胞の神経内注射を使用して、神経依存性成長や腫瘍微小環境相互作用など、ヒト神経線維腫生物学の主要な特徴を要約しています。このプロトコルにより、生物発光イメージング による 腫瘍の進行を動的かつリアルタイムにモニタリングでき、神経線維腫の増殖を評価するための再現性のある定量的な方法が提供されます。GEMM とは異なり、このモデルでは、制御された腫瘍の開始と前臨床治療戦略の正確な評価が可能になります。さらに、GEMM と患者由来の異種移植モデルの間の架け橋としても機能し、神経線維腫研究の翻訳的関連性を高めます。このモデルは、腫瘍と神経の相互作用を研究するための生理学的に関連する設定を提供することにより、神経線維腫の生物学を調査し、潜在的な治療介入を評価するための貴重なプラットフォームを提供します。免疫成分の統合や高度なイメージング技術などの将来の改良により、NF1 研究への応用がさらに強化される可能性があります。
概要
神経線維腫症 1 型 (NF1) は、 NF1 遺伝子の病原性多様体によって引き起こされる遺伝性疾患であり、RAS-マイトジェン活性化プロテインキナーゼ (MAPK) シグナル伝達経路1 をダウンレギュレートする重要な腫瘍抑制因子であるニューロフィブロミンの機能喪失につながります。NF1 は、神経系、皮膚、骨格系が関与する主要な臨床症状を伴う腫瘍素因症候群2 であり、主に神経堤由来組織に影響を及ぼします。NF1 の特徴は、神経線維腫として知られる良性末梢神経腫瘍の発生です。これらの腫瘍は、主に両対立遺伝子 NF1 不活性化(NF1-/-)3を有するシュワン細胞と、 NF1+/- 線維芽細胞、神経周囲細胞、免疫細胞、細胞外マトリックス成分を含む他の間質要素で構成されています4。
動物モデルは、神経線維腫の病態生理学を理解し、治療戦略をテストするために不可欠です。Nf1ノックアウト(KO)変異(Nf1-/-)のホモ接合性マウスは子宮内で死亡した。Nf1+/−マウスは、ヒトの対応物と同様に、生存可能で、生殖能力があり、発がん性があります5。しかし、これらの動物はヒトNF1疾患の特徴的な特徴を発達させません:Nf1 + / -マウスは色素沈着異常も神経線維腫も示さなかった。過去10年間に、条件付きKOアプローチを通じて症状の一部を独立してモデル化するために、多種多様な遺伝子操作マウスモデル(GEMM)が確立されました。いくつかのGEMMは、シュワン細胞前駆体6,7,8のNf1を条件付きで不活性化することにより、神経線維腫形成を誘導するように開発されています。
これらのGEMMはNF19の理解を大幅に進めましたが、その表現型の複雑さと不均一性には、治療アッセイのための代替的で補完的なマウスモデルが必要です。同所性異種移植片は、ヒト細胞を本来の解剖学的ニッチに直接移植できるようにすることで、貴重な代替手段を提供し、より生理学的に関連するモデルを提供します。しかし、ほとんどの異種移植片ベースの研究は、おそらく神経線維腫が異所的に移植されないため、良性腫瘍のモデル化にギャップを残しているため、悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)10に焦点を当てています。
この研究では、NOD SCID ガンマ (NSG) 免疫不全マウスの坐骨神経への不死化神経線維腫由来ヒトシュワン細胞 (hTERT NF1 ipNF04.4 CVCL_UI78 細胞株) の神経内注射に基づく、新しい同所性 NF1 神経線維腫モデルについて説明します。このアプローチは、ネイティブの神経微小環境を最大限に活用し、良性腫瘍の形成を可能にすると同時に、生物発光イメージング (BLI) による動的モニタリングを可能にします。
このプロトコルは、(1)NF1の再現性のある同所性神経線維腫モデルを確立する、(2)腫瘍と神経の相互作用を研究し、新しい治療法を評価するための堅牢な前臨床プラットフォームを提供し、(3)中間の制御された実験システムを提供することにより、GEMM11,12と患者由来の異種移植片(PDX)13の間のギャップを埋めることを目的としています。このモデルは、トランスジェニックマウス株の生成を必要とせずに、通常は注射後5日以内に迅速かつ費用対効果の高い腫瘍発生を可能にし、それによって異種移植片のアクセシビリティと同所性配置の解剖学的関連性を組み合わせます。
この神経線維腫同所性細胞株由来腫瘍異種移植片(CDX)マウスモデルは、他の方法に比べていくつかの利点を提供します。腫瘍形成を促進するために遺伝的素因に依存する GEMM とは異なり、このモデルでは腫瘍の発生と進行を直接制御できます。
悪性末梢神経鞘腫瘍 (MPNST)10 の同所性生着のプロトコルは、良性神経線維腫のモデルに適応されました。これは、トランスレーショナル NF1 研究における重要な前進を表しており、新しい治療標的の特定や革新的な治療戦略のテストにおける潜在的な応用が可能です。
プロトコル
すべての手順は、国際ガイドラインに従ってキュ リー研究所 の倫理委員会 CEEA-IC #118 (国家当局によって与えられた認可 #50186) によって審査および承認され、動物研究の倫理ガイドラインに従って訓練を受けた担当者によって実施されました。NOD SCIDガンマ(NSG)マウス(NOD.Cg-PrkdcIl2rg/SzJ)は、ヒト細胞の生着を成功させる重度の免疫不全により、この研究に選択されました。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。
1. 動物モデルと細胞株の調製
- 移植前日に電気カミソリを使用して手術部位で脱毛を行い、NSGマウスの大規模なコホートの手順を合理化します。
- 両側後肢障害を防ぐために、すべての実験でマウス1つにつき坐骨神経(左側)を1つだけ注入します。マウスに苦痛、体重減少、運動障害の兆候がないか監視します。
- 手順の後、寝具材の誤った吸入を防ぐために、寝具のないケージ内の加熱パッドの上でマウスが完全に回復するのを待ちます。マウスが完全に動き、ふらふらした兆候が見られなくなったら、動物施設に再導入します。
- 異種移植には、NF1患者14に由来するhTERT不死化ヒトシュワン細胞株であるNF1 ipNF04.4(CVCL_UI78)細胞株を使用します。これらの細胞は、CMV-ルシフェラーゼコンストラクトであるpLenti CMV Puro LUC(w168-1)で安定して形質導入され、市販のルシフェラーゼアッセイシステムを使用したBLI による 縦断的追跡が可能になりました。
- 5%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを37°C、5%CO2で添加したDMEMの細胞を維持します。細胞を80%のコンフルエントまで増殖させ、最適な増殖条件を維持します。
- 移植当日に、細胞をトリプシン化します(37°Cで≤4分)。マウスあたり4 μLの5×103細胞で計数し、再懸濁します。
2. 同所性異種移植のための外科的処置
- 術前の準備
- 麻酔導入前に、作業領域を徹底的に消毒して手術ステーションを準備します。手術用顕微鏡と照明システムのすべての接触面を滅菌透明フィルムで覆い、すべての手術器具が事前にオートクレーブ滅菌されていることを確認します。
- 適切な初期鎮痛を確保するために、手術の30分前にブプレノルフィン(0.1 mg / kg)を皮下投与でマウスを術前鎮痛で前処理します。
- 滅菌生理食塩水で新たに調製し、体重に基づいて調整されたケタミン (80 mg/kg) とキシラジン (15 mg/kg) の腹腔内注射 によって 麻酔を誘導および維持します (施設で承認されたプロトコルに従って)。続行する前に、つま先ピンチ反射で麻酔の深さを確認してください。
- 麻酔、移植、回復を含む処置全体を通して、温熱パッドを使用して体温を維持します。
- 角膜の乾燥を防ぐために、目に潤滑剤を点眼します。
- 注射手順
- マウスを右側に置き、後ろ足をそっと広げます。切開を開始する前に、手術領域を滅菌ドレープで覆います。
- ポビドンヨードを使用して無菌手術野を準備します。
- 切開と解剖:細いはさみを使用して、大腿骨と平行に小さな皮膚切開(~5 mm)を行います。坐骨神経を露出させるために下にある筋肉を慎重に分離します:細い鉗子とマイクロハサミを使用して、血管を損傷しないように注意しながら、筋肉層を優しく分離します。坐骨神経を大腿骨の内側に位置する白い臍帯状の構造として識別します。
- 細胞懸濁液を1.5 mLチューブに保存し、静かにフリックして沈降した細胞を再懸濁します。4 μLの細胞懸濁液を33 G針を備えた10 μLハミルトンシリンジにロードします(高い細胞生存率を維持しながら神経外傷を最小限に抑えるために選択されました)。
- 坐骨神経軸に平行に針を(穿孔を防ぐため)~2 mmの深さまで挿入します。ゆっくりと注入を開始して、神経と末梢鞘の間に圧力と隙間を作ります。針をさらに4〜5mmゆっくりと進めます。次に、神経から針を引き抜きながら懸濁液をゆっくりと注入します。神経の緊張や動きを避けてください。
- 損傷を防ぐために坐骨神経を伸ばさずに手順を実行し、クランプを使用しないでください。逆流を最小限に抑えるために、針をゆっくりと引き抜く前に10〜15秒待ちます。
- 注射後、坐骨神経が注射部位でわずかに腫れ、漏れや変色がないことを確認してください。注射の成功は、血管外漏出のない安定した神経の外観によって示されます。
- 手術部位の炎症を避けるために、非吸収性材料(3-0、30 mm、3/8 c)を使用した3〜4本の単純な断続縫合糸を使用して外科的切開部を閉じます。手術が10分以上続く場合は、乳酸リンゲル(s.c.)1mLを投与します。一日の終わりにメロキシカム(5 mg / kg、皮下)を投与します。.
- 手術直後、麻酔から回復する前に、イヤーパンチまたはタグを使用して、各マウスに固有の識別のためにタグを付けます。
- マウスが温度管理された環境で回復できるようにし、術後の合併症を監視します。
3. 生着および腫瘍増殖モニタリングのための生物発光イメージング
- 生着の成功と腫瘍の進行を評価するには、複数の時点で BLI を実行します。 in vivo モニタリングでは、 in vivo イメージングシステムを使用して、腫瘍細胞によって発現するホタルルシフェラーゼとその基質であるD-ルシフェリンとの間の酵素反応から放出される光をキャプチャします。このアプローチは、腫瘍活動を視覚化および定量化するための正確な方法を提供し、長期にわたる腫瘍動態に関する貴重な洞察を提供します。
- 移植後5、12、19、26、30、33日目など、移植後の特定の時点で生物発光シグナルを定量化します(図1)。通常、5 匹のマウスを同時に画像化して、プロセスを合理化し、測定全体の一貫性を維持します。
4. イメージングのセットアップ
- 画像取得中にマウスを2%イソフルランで麻酔し、IVISイメージャーに統合された加熱パッドを使用します。
- マウスを一貫して同じ向きに配置し、10 μL/g体重の用量でD-ルシフェリンを腹腔内注射してから10分後に画像化します(ストック濃度:PBS中で15 mg / mL、新たに調製およびろ過)。
- データ収集ソフトウェアを使用して1分間画像を取得し、プロセス中にピクセルが飽和しないようにします。
- 生物発光信号強度を相対光子数/秒として測定します。次の設定でイメージングシステムを使用してください。露光時間:自動;ビニング:中;F/ストップ: 1.2;視野:12.5cm;ソフトウェア: Living Image Software v4.7.3.
- 独自のソフトウェアを使用して、腫瘍領域からの発光を測定し、1秒あたりの相対光子数として報告します。同時に撮影された白黒画像に重ね合わせた擬似カラースケーリングを使用して、生物発光強度を視覚化します。
5. 生着成功の基準
- マウスが検出可能な生物発光を示さない場合、またはシグナルが時間の経過とともに減少する場合は、マウスを除外します。
- 5日目から12日目の間に発光が徐々に増加するマウスのみを含めます。
- 代表的な結果のセクションで説明されているように、生物発光イメージングを使用して腫瘍モニタリングに進みます。
結果
上記の手順を使用して、不死化神経線維腫由来細胞(ipNF04.4)を有するNSGマウスで同所性坐骨神経腫瘍モデルの確立に成功しました。D-ルシフェリンによる生物発光イメージングにより、5日目という早い時期に坐骨神経における腫瘍の明確な局在が明らかになり、時間の経過とともに指数関数的に成長する証拠が見られました。注射されたマウスの90%(37/41)で生着が成功しました。腫瘍の進行は5、12、19、26、30、および33日目にモニタリングされ(図1A)、モニタリング期間を通じて非特異的シグナルは観察されませんでした。マウスは、施設のガイドラインに従って、苦痛または過剰な腫瘍量の最初の兆候で 33 日目に安楽死させました。解剖すると、腫瘍はよく発達し、坐骨神経内に統合されているように見え、膿瘍形成の兆候はありませんでした(図1B)。特に、マウスは麻酔から回復した直後に正常な歩行を示しました。
図1:NSGマウスにおける同所性坐骨神経異種移植片の生物発光イメージングと肉眼的分析。 (A)ipNF04.4細胞を左坐骨神経に神経内注射した2匹のNSGマウスの縦方向生物発光イメージング(BLI)。画像は注射後5、12、19、26、30、および33日目に撮影され、2匹の同じマウスにおける経時的な進行性腫瘍増殖を示しました。生物発光シグナル強度の増加は、神経微小環境内での生着と腫瘍の拡大の成功を反映しています。(B)移植後33日目の坐骨神経の巨視で、膿瘍形成の兆候のないよく発達した統合腫瘍が示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:腫瘍の増殖と焦点浸潤を示すこのマウスの移植片部位の顕微鏡写真。 ヘマトキシリンとエオシン(H&E)で染色したパラフィン包埋組織切片。3匹のマウスの典型的な腫瘍の例を示します。スケールバー:2000 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:異種移植実験の過程におけるNSGマウス(n = 15)の代表的な体重変化。 有意な体重減少は観察されませんでした。 この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ディスカッション
NSG マウスにおける同所性神経線維腫細胞株由来異種移植片 (CDX) モデルの確立の成功は、NF1 研究における大きな進歩を表しており、既存のモデルの主要な限界に対処します。このプロトコルは、ヒト不死化NF1関連シュワン細胞(ipNF04.4)14,15,16が免疫不全マウスの坐骨神経に効率的に生着し、生理学的に関連する微小環境内で再現性のある腫瘍発生につながることを確認しています。シュワン細胞株の同所性異種移植片は、ヒトシュワン細胞株14,15を確立した元の研究で言及されており、詳細なプロトコルがここに提供されています。
このプロトコルの成功の鍵は、細胞成分と宿主動物の両方の細心の注意を払った準備とモニタリングでした。処置中、麻酔は慎重に管理され、マウスが大きなストレスを受けることなく適切な麻酔状態に保たれるようにしました。潜在的な損傷を最小限に抑えるために、坐骨神経はクランプや鉗子で伸ばさず、組織への機械的ストレスを避けるために細心の注意が払われました。ルシフェラーゼベースのBLIを使用することで、腫瘍増殖の非侵襲的で縦断的なモニタリングが可能になり、定量的で再現性のあるデータが得られました。このイメージング戦略により、移植片の生存率が確認されただけでなく、腫瘍動態の初期の逸脱の特定も可能になりました。マウスに有意な体重減少(補足 図1)、運動機能障害、またはその他の苦痛の兆候がないことは、このプロトコルと動物福祉の倫理原則および3R(交換、削減、改良)との互換性を強調しています。
条件付きNf1不活性化に依存するGEMMと比較して6,7,9、このアプローチにはいくつかの明確な利点があります。GEMMは特定の遺伝子改変を必要としますが、ヒト神経線維腫で観察される複雑な腫瘍間質相互作用を完全に再現できない可能性があります1,17。このモデルにより、細胞外因性因子を保存しながら、ネイティブ神経ニッチにおけるヒトシュワン細胞の直接研究が可能になります4。腫瘍が時間の経過とともに予測不能に発症するGEMMとは異なり、異種移植モデルでは腫瘍形成を正確に時空間制御できます。このモデルは、BLI により腫瘍の進行と治療反応のリアルタイム監視を可能にする、候補治療法をテストするための迅速かつ再現性のあるプラットフォームを提供します。
さらに、これらの発見は、同所性異種移植が腫瘍モデルの忠実度を高めることが示されているMPNSTに関する以前の研究と一致しています5。しかし、良性神経線維腫は、その増殖が特定の神経相互作用に大きく依存するため、従来の皮下移植法では再現できないため、特有の課題を引き起こします6。この結果は、神経内注射が持続的な神経線維腫の発生に最適な環境を提供することを確認しています。
したがって、この in vivo モデルは、前臨床治療試験において、GEMM に関連する補完的な代替手段と見なすことができます。ただし、モデルには制限があります。神経線維腫に由来するヒトシュワン細胞は不死化されており、叢状神経線維腫よりも攻撃的であり、細胞が密に増殖すると考えられる腫瘍表現型を示します(図2)。動物では遠隔播種の証拠は観察されておらず、完全な悪性形質転換は実証されていません。細胞表現型が、生物学的可能性が不明な非定型神経線維腫性新生物(ANNUBP)18のように、非定型神経線維腫を彷彿とさせる「中間」表現型に対応しることができるかどうかを示すには、さらなる研究が必要です。このモデルのもう一つの重大な制限は、免疫不全マウスへの依存にあります。NSGマウスに適応免疫系がないため、免疫と腫瘍の相互作用の研究が制限され、神経線維腫生物学の主要な寄与者としてますます認識されています7,19,20,21。将来の改良には、病気の免疫学的側面をよりよく捉えるためのヒト化マウスモデルや代替戦略が組み込まれる可能性があります。さらに、腫瘍モニタリングのためのルシフェラーゼ発現への依存は非常に効果的ですが、BLI 機器にアクセスできない実験セットアップへのこのプロトコルの適用性を制限する可能性があります。BLI は高感度で非侵襲的な方法ですが、組織病理学的変化に関する直接的な洞察を提供するものではありません。MRI や高度な組織学などの補完的な分析により、神経線維腫の進行の特徴付けがさらに改善される可能性があります。
腫瘍生留を確実に成功させるために、いくつかの手順ステップで最適化が必要になる場合があります。注射の失敗は、針の位置が不適切であるか、細胞懸濁液が過剰に漏れることが原因である可能性があります。これを軽減するには、針を坐骨神経と平行に慎重に挿入し、注射後にゆっくりと引き抜く必要があります。生物発光シグナルのばらつきは、一貫性のないルシフェリン投与またはイメージング中の位置ずれから生じる可能性があります。ルシフェリン注射後のタイミング(10分)を標準化し、すべての動物で同一のイメージング設定を維持することをお勧めします。腫瘍増殖のばらつきが依然として高い場合は、注射前に細胞の生存率を確認し、取り扱い中の動物のストレスを最小限に抑えます。
結論として、この研究は、新規で再現性のある同所性神経線維腫異種移植モデルを確立し、NF1 関連良性腫瘍を研究するための効果的な前臨床プラットフォームを提供します。このモデルは、ヒトシュワン細胞を自然な神経微小環境で活用することにより、ヒト神経線維腫の生物学を厳密に模倣しながら、リアルタイムの腫瘍モニタリングと制御された治療介入を可能にします。このモデルは、GEMM と患者由来モデル (PDX) の間の重要なステップを表しており、神経線維腫の研究と治療に対するより臨床的に関連するアプローチへの道を開きます。
将来の改良は、腫瘍微小環境の役割を研究するために、ヒト化マウスモデルなどの免疫成分を統合することを目指す必要があります6。MRI や PET スキャンなどの画像診断法を拡大することで、構造的および代謝的洞察で BLI を補完できる可能性があります22。実験スケジュールの延長は、長期的な神経線維腫の発症と潜在的な悪性形質転換リスクを調査するために不可欠です。このプラットフォームは、GEMM モデルと PDX モデルの間のギャップを埋めることで、NF1 のトランスレーショナル研究を強化し、良性末梢神経鞘腫瘍における治療革新の新たな機会を提供します。
開示事項
著者は、競合する金銭的利益がないと宣言しています
謝辞
この研究は、 国立がん 研究所(Inca_18828)によって支援されました。コー チン研究所のHistIMプラットフォーム(メリーリン・ファヴィエ監督)とピエール・ソヒエに感謝したいと思います。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ブプレノルフィン | ブプレケア | 術前鎮痛のために | |
| 加熱マット | アニフィ | VI-653246 | マウス手術中の正常な母症維持のために |
| hTERT NF1 ipNF04.4(CVCL_UI78)細胞株およびnbsp; | 応用生物材料 | T0194 | 不死化ヒトNF1-ヌルシュワン細胞株 |
| イソフルラン | イソベテッド | 生物発光イメージング中のマウス麻酔用 | |
| IVIS ルミナ シリーズIII | リヴヴィティ | 生物発光イメージングのために | |
| ケタミン | ケタミン1000 バーバック | マウスの外科的麻酔のために | |
| リビングイメージソフトウェア | リヴヴィティ | IVISに含まれる | 画像取得および定量化のために |
| ルシフェラーズ検査システム | プロメガ | E1500 | BLI検出のために |
| メロキシカム | メタカム | 非ステロイド性抗炎症薬(NSAID) | |
| モノフィラメント非吸収性縫合 | エティロン | F2419H | 切開部の縫合のために |
| 注射器用の針 | ハミルトン | 習慣 | GA33/12,7mm/PST4-12° |
| NOD SCIDガンマ(NSG)マウス | チャールズ川 | 614NSG | |
| pLenti CMV Puro LUC(w168-1) | アッドジーネ | 17477 | ホタルルシフェラーゼの発現について |
| ポビドン・イオド&エアキュート;e dermique 10% | ヴィアトリス | 330200775 | 皮膚消毒用の外用消毒剤 |
| メスブレード | FST | 10015-00 | 手術中の皮膚切開のために |
| ステレオ顕微鏡 L125 | ライカ | 坐骨神経の細胞注入部位の可視化のために | |
| シリンジ10とマイクロ;l | ハミルトン | 1701RN | 坐骨神経への細胞注射のために |
| シラジン | ロンプン 2% | マウスの外科的麻酔のために |
参考文献
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再版と許可
