方法論記事

マウス両側腎リンパ節摘出術

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DOI：

10.3791/68695

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2025年12月30日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Yale University School of Medicine, 2Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, 3Department of Internal Medicine, Section of Rheumatology, Yale University, 4Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、安全かつ耐容性の高いマウスの両側性腎リンパ節摘出術の生存手技を説明しています。

要約

自己免疫疾患は、免疫細胞が自己組織を不適切に標的にし、病理や重要な臓器への損傷を引き起こす結果です。二次リンパ器官は、局所リンパを通じた抗原排出および抗原提示細胞(APC)輸送の結果として、B細胞およびT細胞の活性化および末梢免疫寛容の場として機能します。リンパ球活性化の初期部位としての局所的な排水リンパ節の役割は、腫瘍、感染症、臓器特異的自己免疫疾患の状況では説明されていますが、全身性自己免疫では説明されていません。全身性エリテマトーデスはそのような疾患の一つで、腎臓によく関与し、腎障害や最終的に不全を引き起こす広範な自己免疫疾患です。腎リンパ節の役割についてのさらなる理解は、抗原排出および腎臓からのAPC輸送の主な部位であるため、選択的にこの組織を妨害できないため制限されています。ここでは、安全で耐容性の高いマウスの両側腎リンパ節摘出術の生存手技を説明します。詳細な説明書、視覚的な補助、成功率向上のための役立つヒント、手順上の落とし穴のトラブルシューティングが含まれています。長期生存率は優れており、術後少なくとも4か月間は観察されています。切除された腎リンパ節は無傷で、すぐに後処理に備えられます。この手法は腎リンパ節の局所的影響の研究に最適です。

概要

自己免疫疾患は、自己免疫性肝炎、ぶどう膜炎、1型糖尿病のような比較的器官制限のある疾患から、全身性硬化症やシェーグレン症候群のような広範囲にわたる疾患まで、人間のあらゆる臓器に及びます。免疫耐性は自己反応性を防ぐためにBおよびT細胞の発生において重要な段階です。胸腺のクローナル欠失による中心耐性は必要かつ効果的ですが、それだけで自己免疫に対する防御に隙間が残ります7,8。末梢寛容は、抗原排出後の局所組織排出リンパ節を含む二次リンパ系器官で起こる、B細胞およびT細胞の欠失、欠失、またはT細胞枯渇による自己反応性に対する二次的な障壁です。しかし、遺伝的および/または環境的に不適切な活性化後に感受性のある個人において、自己反応性細胞がこれらのリンパ節内に存在し、そこから移動する可能性もますます明らかになっています(11,12)。

全身性エリテマトーデスはそのような自己免疫疾患の一つであり、複数の臓器系に明確に関与するB細胞およびT細胞が関与しています13。特に一般的で病的な症状としてはループス腎炎と末期腎疾患への進行が挙げられます。自己免疫駆動の腎疾患における局所的なBおよびT細胞の直接的な影響を理解する能力は、循環する全身病態生理とは対照的に、これらのリンパ節を選択的に攪乱できないために現時点で制限されています。このギャップを踏まえ、マウスの両側腎リンパ節摘出術の生存手術が開発され、ここで説明します。

このプロトコルの全体的な目標は、高い術後生存率と耐性を持つマウスにおいて、両側性腎リンパ節の安全かつ信頼性の高い切除を達成することです。この手法は、腎リンパ節が腎臓病に関連する免疫細胞のプライム化、活性化、耐容性に与える局所的な影響の研究に最適です。この手術は、腎臓に影響を与える自己免疫または腫瘍学的モデルと組み合わせることで理想的です。

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プロトコル

すべての処置はイェール大学の施設動物ケア・使用委員会のプロトコルに準拠して実施されます。この手法の開発にあたり、8〜12週齢のBalb/c株、ループスかかりやすいマウス(MRL/MpJ-Faslpr/J /J)および年齢・性別・遺伝子型一致の偽対照群が用いられました。さらに、8〜12週齢の野生型C57BL/6株マウスも試験し、リンパ節は安全に摘出されました。オスとメスのマウスの両方が含まれていました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 器具、動物、手術室の準備

  1. すべての手術器具を滅菌しろ。手術面と麻酔鼻のコーンは70%エタノールで洗浄されていることを確認してください。
  2. 手術用顕微鏡を設置し、手術医が快適に人間工学的に対応できるようにしましょう。
  3. 吸入式麻酔ヴェポライザーを設置し、鼻のコーンと吸引機能を備えたものを設置し、過剰な麻酔薬の吸収を防いでいます。動物の体温と備蓄を便利で無菌の場所に設置し、温水循環パッドを備えた作業台を設置しましょう。
  4. 吸入麻酔用ヴェポライザー装置から鼻錐から酸素流量2L/分の2%-3%の吸入イソフルランを投与し(機関承認プロトコルに従い)、麻酔を誘発します。
    1. 呼吸数が約30〜40回/分で、後足のつねりに反応がないことを確認することで、適切な麻酔の面を確保しましょう。適切な麻酔面を定期的に再確認し、イソフルランの流量を調整してください。
      注意:あるいは、注射麻酔薬も適切です。
  5. 適切な鎮痛および局所麻酔については、所属機関のガイドラインに従ってください。例えば、3.25 mg/kgのブプレノルフィンXRのような長時間作用型鎮痛剤を皮下投与し、計画された切開部位に最大0.04 mL/5 gの1mg/mLリドカイン溶液を皮下投与することができます。
  6. 処置の準備として、目の潤滑剤を塗布し、両側の毛を抜くか後ろの毛を切り、背中をポボジン/ヨウ素溶液で滅菌し、その後70%エタノールを投与し、右側のデキュービトゥス(右側を下)に位置させます。
    1. 左腕の上方と尾を下側に固定して、リラックスしつつも伸ばした姿勢を作り出します(図1A)。これにより腎臓がより下位に押し出され、視覚化と曝露が改善されます。
  7. 滅菌手袋を着用し、手術室に窓を設けて滅菌のカーテンを動物に貼りましょう。処置中は無菌性を保ちましょう。
    1. 任意:動物の体位調整前に、両側の後足パッドにリン酸塩緩衝塩水に10〜20μLの無菌・ろ過済みエバンスブルーを注射し、腸骨リンパ路16に沿った排液による腎リンパ節の特定を改善させる(図1D-G)。
      注意:この染料は染色やフローサイトメトリー分析に干渉する可能性があるので注意してください。さらに、時間が経つにつれてエバンスブルーはシスターナキリにも浸透します(詳細は「トラブルシューティング」参照)(表1参照)。

figure-protocol-1
図1:マウスと臓器の解剖学的配置と任意のエバンスブルー注射。 (A) 動物の位置取りおよび左側腎臓曝露の固定。(B) 手術期間内の解剖学的向き。左腎リンパ節鎖は副腎血管と大動脈に隣接し、腎血管よりも上方に位置します。右腎リンパ節は腎血管のすぐ上にあります。(C) 動物の位置取りと右側腎曝出の固定。(D-G)20μL、5%エバンスブルー注入の実装。(D)染色前の左後足および左腎リンパ節鎖(白い矢印)。シスターン・キリ(破線箱)の大まかな位置に注目してください。これはしばしば透明で、リンパでふっくらしないと識別が難しいです。(E) 造影剤注射後5分後の左後足および左腎リンパ節鎖(白い矢印)。求心性リンパ管(黒い矢印)に注目してください。(女性)染薬前の右後足と右腎リンパ節(白い矢印)。G) 造影剤注射後5分後の右後足と右腎リンパ節(白い矢印)。求心性リンパ管(黒い矢印)に注目してください。スケールバー:A,C = 1.0 cm;D-G(後足の視点)= 0.5 cm;D-G(内部図)= 0.1 cm。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

2. 左腎リンパ節摘出術

  1. 脾臓のすぐ下(最終肋骨より約1cm下)に皮膚に1cm斜めの切開を入れます。腹部や胸壁から皮膚を鈍く剥離し、腹部内の脾臓を特定します。
    1. 腹壁の筋肉、脾臓のすぐ下に1cmの切開を入れて腹膜腔にアクセスします(図2A,B)。
      注:無色素のマウスでは、脾臓は準備された皮膚を通して腹部の側面に位置し、最終肋骨より少し下に位置する暗く可動性のある臓器として容易に見えます。
  2. 左腎臓は後腹壁に沿って滑らかな器官として位置し、脾臓のすぐ下にあると特定してください。腎臓および関連する腎リンパ節は後腹膜に存在します。2つの角度のある鉗子を使い、左腎の後方を鈍く切り離して後腹膜にアクセスします(図2C)。
    注意:適切かつ安全な鈍的解離技術は、閉じた鉗子で目的の組織面に微小な圧力をかけ、器具を優しく開いて組織面を引き離すことを含みます。
  3. 左腎を前内側に反映させます。
  4. 解離顕微鏡を用いて、左腎リンパ節を包む脂肪パッドを特定します。これは左腎の後方、左腎血管の上方にあります。副腎は上方、大動脈は後方、胸胸骨は前内側に位置し避けます(図1B、D)。
  5. 細かい鉗子を使い、リンパ節包の周囲を鈍く切り離し(周囲の血管から分離)、角度のある鉗子で優しくカウンターテンションをかけます(図2E)。また、細かいはさみを使ってこの平面を直接解剖することもできます。
  6. 細かい先端の直線鉗子を使い、左腎リンパ節の頭を引っ込み、細い先端のハサミでリンパ節の後内側付着部を鋭く切開します。近くの血管やシスターナ・キリリ/胸管を損傷しないように注意してください(図2F)。
  7. 止血の部位を観察してください(図2G)。
  8. 腎臓を解剖学的な位置に戻し、腹部を2層(腹壁と皮膚)に分けて、6-0モノフィラメントポリプロピレン縫合糸で走るように縫合します。傷口に滅菌手術用接着剤を塗りましょう。

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図2:左腎リンパ節摘出術。 (A) 脾陰影のすぐ下、後方にある左斜切開。(B) 脾臓を上方(白線)、左副腎後方(黒い矢印)、左腎を下側(黒線)で特定すること。(C) 腎臓のすぐ後方を鈍く剥離することで後腹膜への平面が形成されます(黒い矢印)。(D) 左側の腎リンパ節(白い矢印)が脂肪鞘内ですぐに見える。(E) 近くの血管とノードの間に平面(白い矢印)が作成されます。(F) 節を優しく引き戻し、形成された面に沿って鋭く切除します。(G)止血が確認され、(D)の空白部分(白い矢印)が以前存在していた空白部分(白い矢印)には残留リンパ節がないことが確認されます。(H) 左リンパ節はしばしば複数のリンパ節(白い矢印)の連鎖です。挿入は生 体外 の左リンパ節鎖(1 mm x 3.5 mm)です。スケールバー:0.2 cm。ティック=1 mm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

3. 右腎リンパ節摘出術

  1. 動物を左側のデキュービトゥス(左側下)に再配置します。再び、右腕の上方と尾側を下側に固定して、リラックスしつつも伸ばした姿勢を作り出します。特に右側では肝臓が曝露を妨げるため(図1C参照)、
  2. 皮膚に1cmの斜めの切開を入れます。これは最終肋骨のすぐ下(左側よりやや上位)です。腹腔・胸壁から皮膚を鈍く切り離し、腹壁の筋肉に1cmの切開を入れて腹膜腔にアクセスします(図3A)。
  3. 右腎臓は後腹壁に沿って滑らかな器官として位置し、肝臓のすぐ下にあると特定してください。肝臓の頭を引っ張るために綿先の綿棒を使う必要があるかもしれません。2つの角度のある鉗子を用いて右腎臓の後方を鈍く切り離し、後腹膜にアクセスします(図3B,C)。
  4. 右腎臓を前内側に反映させます。
  5. 解離顕微鏡を用いて、右腎リンパ節を包む脂肪パッドを特定します。これは右腎の後方、右腎血管の上方に位置します。副腎を上位で特定し避けてください(図1B、D)。
  6. 細かい鉗子や細かい先端のハサミを使い、リンパ節嚢の周囲を鈍く切り離し(周囲の血管から分離)、斜めの鉗子で優しく逆引っ張りをかけます(図3E)。
  7. 細かい先端の直線鉗子を使い、右腎リンパ節の頭を引っ張りながら、細かい先端のハサミでリンパ節の後内側付着部を鋭く切開します(図3F)。リンパ節のすぐ下を走る腎血管を破壊しないように注意してください。
  8. 止血の部位を観察してください(図3G)。
    注:一般的に、右腎リンパ節はより大きく後方に排出する血管を持ち、リンパ節の採取に成功した際に出血しやすいことがわかります。この血管からの出血は、綿先端の綿棒で優しく圧迫することで止血を達成できます。
  9. 腎臓を解剖学的な位置に戻し、腹部を2層(腹壁と皮膚)に分けて、6-0モノフィラメントポリプロピレン縫合糸で走るように縫合します。傷口に滅菌手術用接着剤を塗りましょう。

figure-protocol-3
図3:右腎リンパ節摘出術。 (A) 右斜切開、最終肋骨のすぐ下および後方に位置する。(b) 肝縁が上方(白線)、左腎臓が下側(黒線)で識別される。右副腎は肝縁に隠れています。(C) 腎臓のすぐ後方を鈍く剥離することで後腹膜への平面が形成されます(黒い矢印)。(D) 右腎リンパ節(白い矢印)は脂肪鞘の中ですぐに見えます。(E) ノード(白い矢印)の周りに平面を作成します。(F) 節を優しく引き戻し、形成された面に沿って鋭く切除します。(G)止血が確認され、(D)の空白部分(白い矢印)が以前存在していた空白部分(白い矢印)には残留リンパ節がないことが確認されます。(H) 右リンパ節は単一の球状のリンパ節(白い矢印)です。挿入部位は体 外 リンパ節(2 mm x 1.5 mm)です。スケールバー:0.2 cm。ティック=1 mm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

4. 術後ケア

  1. 動物を清潔なケージに移し、温水の循環パッドが半分オン、半分オフで、食べ物や水は 自由に提供できます。
  2. 動物が麻酔から回復するまで(~10〜15分)、苦痛の兆候を注意深く観察してください。動物が適切な行動(呼吸数の増加、自己復位、歩行、グルーミング)で麻酔から迅速に回復しない場合は、機関で承認されたプロトコルに従い人道的に安楽死させてください。
  3. すべての動物が麻酔から回復したら、ケージを動物ケア施設に戻し、水、餌、寝具、リッチング用品を 自由に提供してください。
  4. 術後12時間ごとに3日間、マウスの痛みや苦痛の兆候(前かがみ姿勢、活動減少、関与の低下、グルーミングの不備)を評価する。苦痛の兆候を示すマウスは人道的に安楽死させてください。
  5. 永久縫合糸(6-0モノフィラメントポリプロピレンなど)を使用する場合は、術後10日目に切開部を確認し、残留した縫合材を除去してください。

5. リンパ節の処理

注意:切除されたリンパ節はすぐにパイプラインに投入され、今後の応用に備えます。

  1. この手順と解剖学を初めて学ぶ際は、組織学またはフローサイトメトリー で 選択した抗体染色でリンパ節切除を確認しましょう。
  2. 組織を細胞培養培地(例:DMEM、RPMI)または氷上に置くリン酸塩緩衝生食塩水(PBS)を生細胞技術で、計画的な組織学では固定液(例:中性緩衝ホルマリン10%、パラホルムアルデヒド4%)に置きます。
    注:リンパ節を素早く確認する、しかし精度は低い方法として、切除したサンプルをPBSに置くことがあります。一般的に、主にリンパ節で構成されるサンプルは沈み、脂肪組織が多いサンプルは浮遊します。ただし、この手順を最適化する際には、さらなる確認検査が推奨されます。

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結果

この処置は1匹あたり15〜20分で行うことができます。この手術の正確性を確認するため、8〜12週齢の年齢・性別・遺伝子型が一致した5頭の兄弟姉妹に対して両側腎リンパ節摘出術を実施しました。すべてのマウスは手術に良好に耐え、周術期生存率は100%でした。切除したサンプルはPBSに氷置きされました。すべてのサンプルは即座に沈み、低脂肪濃度が確認されました。切除されたサンプル(および4つの別々の内臓脂肪対照群)は100μmの細胞ストレーナーで粉砕し、PBSで洗浄されました。細胞懸濁液は450 x g で4°Cで5分間遠心分離し、その後100 μL PBSで氷上で20分間染色し、以下の抗体/濃度を投与しました:FITC結合抗マウスCD45.2(104)、マウスモノクローナル抗体(1:100; 5 μg/mL)、および生存可能性のためのDAPI(1:100; 15 μg/mL)。細胞懸濁液は再びPBSで洗浄され、450 x g で4°Cで5分間遠心分離し、PBSで再懸濁されました。

イェー...

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ディスカッション

ここでは、安全で耐容性の高いマウスの両側腎リンパ節摘出術の生存手技を説明します。この手法の主な制約は、腎リンパ節の比較的小さいため、顕微鏡での手術が必要です。手術用顕微鏡がなければ、自信を持って切除するのは難しいことがあります。一部の遺伝子マウスモデルはリンパ節が肥大しており、同定や技術学習が容易になっています17。健康な野生型マウスでは、リンパ節は小さくて識別が難しいことがあります。この手順を学ぶ際や、リンパ節の特定が難しいマウスでは、視認性を高めるために5%エバンスブルー染料を加えることを検討してください(オプションステップ1.7.1)。エバンスブルーは切開5分以内に注射でき、20分間の施術中ずっと視認性が保たれます(図1D-G)。

解剖学的変異
左腎リンパ節は、1つの孤立した長方形のリンパ節または...

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開示事項

R.A.F.はグラクソ・スミスクライン、プリセラ社、ベントゥス・セラピューティクスのアドバイザーを務めています。他のすべての著者は競合する利害関係を一切表明していない。

謝辞

管理支援をしてくれたJ. Alderman、B. Cadugan、E. Hughes-Picard、J. Horrocksに感謝し、マウスコロニー管理にはC. Hughesに感謝します。H.N.B.はイェール外科科学者訓練プログラムのフェローであり、このプロジェクトの一部資金提供と支援を受けました。この研究はハワード・ヒューズ医学研究所(R.A.F.)およびアメリカ外科医学会レジデント研究賞(H.N.B.)からも資金提供を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
麻酔回路どんな人でもあるいは注射麻酔
BD LSRIIフローサイトメーター(または同等品)BDバイオサイエンスFACS Divaソフトウェアを搭載
ブプレノルフィンXRどんな人でも鎮痛のために
細胞培養培地およびどんな人でも(生細胞技術の場合、すなわちDMEMまたはRPMI)
ダピバイオレジェンド422801作動濃度:15 ug/mL
デュアル/ツインのグースネック顕微鏡LEDライトどんな人でも
エタノール(水中で70%)どんな人でも掃除用
FITC共役抗マウスCD45.2(104)バイオレジェンド109806作動濃度:5 ug/mL
ピンセット:角度のある細かいピンセット(2回)ロボズRS-5058素材:デュモクセル;パターン#5、45度角;先端サイズ 0.1 X 0.06mm
鉗子:細かい先端の鉗子ロボズRS-4960素材:デュモスター;パターン#1;先端サイズ:0.20 × 0.12mm
鉗子:細かい先端の鉗子ロボズRS-4966素材:Dumostar、Biologieのヒント;パターン#3;先端サイズ:0.08 x 0.04mm
リドカインどんな人でも鎮痛のために
ネズミジャックスC57BL/6株、野生型マウス:ジャクソン研究所#000664
ニードルドライバーロボズRS-6410カストロビエホの針ホルダー;まっすぐ
操作顕微鏡ライカMZ9.5ライカ Mz9.5 ステレオヘッド操作顕微鏡
OPTIONAL:エバンスブルーダイシグマE2129-10Gリンパトレーシングのために。
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)どんな人でも
ポビドン/ヨウ素溶液どんな人でも皮膚の準備や滅菌のために
ハサミ:先端が細かいはさみロボズRS-5605マクファーソン・ヴァナス;3mmの切断刃;曲線
ハサミ:中くそくはさみロボズRS-5676ノイズ;13mmの切断刃;まっすぐだ
サージカルグルーどんな人でも例:3M Vetbond組織接着剤
縫合線:6-0ブルーモノフィラメントポリプロピレンどんな人でも
組織固定剤どんな人でも(計画組織学の場合、例えば中性バッファリングホルマリン10%またはパラホルムアルデヒド4%)
温水循環式ヒーターパッドどんな人でも
マウス  ジャクソン研究所Balb/c株、ループス傾向マウス(MRL/MpJ-Fas-lpr/J):#000485

参考文献

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