マイクロ流体ベースのハイスループット循環腫瘍細胞選別およびシングルセルシーケンシング技術

Summary

循環腫瘍細胞 (CTC) は、がんの進行と転移の研究に重要です。この記事では、CTC濃縮とシングルCTCシーケンシングのためのハイスループットの統合プロトコルを紹介し、汚染とシーケンシングのコストを削減しながら、捕捉効率とCTC純度を向上させ、それによって精密腫瘍学の研究と臨床応用を前進させます。

Abstract

循環腫瘍細胞 (CTC) は、がんの転移、進行、再発を追跡するための有望なバイオマーカーとして機能します。CTC 検出を中心としたリキッドバイオプシー技術は、その非侵襲的な性質と腫瘍動態のリアルタイムモニタリングを提供する能力により、大きな可能性を実証しています。しかし、従来のバルク CTC 分析では、CTC 集団間の固有の不均一性を捉えることができず、腫瘍生物学に関する重要な洞察が不明瞭になります。シングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)は、CTCの不均一性の高分解能特性評価を可能にし、腫瘍進行の精密腫瘍学およびメカニズム研究に新たな機会を提供します。これらの利点にもかかわらず、単一CTCシーケンシングの既存の方法論は、回収率の低さ、労働集約的なワークフロー、複数の手作業による処理ステップに関連する汚染リスクなど、非効率性に悩まされる傾向があります。これらの制限に対処するために、CTCの濃縮、精製、およびシングルセルシーケンシングを統一されたワークフローに統合する統合マイクロ流体プロトコルを提示します。この方法は、ヘリンボーン構造のチップ内で動的に制御された磁気捕捉を採用しており、ボルテックス混合と累積免疫磁気ビーズ結合により、細胞損傷を最小限に抑えた堅牢でハイスループットのCTC単離が可能になります。その後、白血球抗体でコーティングされたマイクロ流体チップを使用した精製により、非標的細胞が効果的に除去され、ネガティブセレクションによってCTCの純度がさらに高まります。最後に、差動流抵抗の原理に基づいて設計された高精度のシングルセルシーケンシングチップにより、効率的なシングルセルのキャプチャと、独自のバーコード化されたマイクロビーズとのペアリングが容易になります。この新しいプラットフォームは、ポアソン分布ベースの方法の限界を克服し、マイクロビーズの消費とシーケンスコストを最小限に抑えながら、CTC の利用率を向上させます。当社の統合プロトコルは、CTC キャプチャの効率、純度、および単一細胞シーケンシングのスループットを大幅に向上させ、臨床応用や大規模ながん研究に適しています。この方法は、CTC の不均一性のより正確かつスケーラブルな分析を可能にすることで、がんの早期診断、治療モニタリング、転移のメカニズム研究を改良し、最終的には精密腫瘍学の分野を前進させる可能性があります。

Introduction

腫瘍転移は、播種から始まり、原発腫瘍内の腫瘍細胞による休眠とコロニー形成を経る、複雑で多段階のプロセスです。これらの細胞は、基底膜を通って徐々により深い組織に侵入し、その後血管またはリンパ管に血管内侵入します。循環に入ると、これらの細胞は循環腫瘍細胞 (CTC) になり、遠隔臓器に移動する可能性があります¹。CTC の出現は、遠隔転移の種子として機能するため、転移カスケードにおける重要なステップです¹。近年、CTC ベースのリキッドバイオプシー技術は、手順の非侵襲的で便利な性質や、リアルタイムの動的モニタリング機能などのメリットにより、大きな注目を集めています。この技術は、腫瘍生物学の正確、リアルタイム、包括的な評価を容易にし、治療効果の監視、再発の予測、治療の指導において独自の利点をもたらします ^2,3,4。さらに、研究では、CTC は、早期がん、早期転移、再発などの腫瘍負荷の低い段階でも末梢血に存在することが示されています ^5,6。その結果、CTC リキッドバイオプシーは、画像検査で検出可能な固形腫瘍に限定された従来の組織生検の限界を克服します⁷。これは、がんの早期診断、再発および転移のモニタリング、治療指導、および腫瘍の発生、進行、および転移のメカニズムの解明のための新しい視点と技術的サポートを提供します。たとえば、末梢血中の CTC の数は、がん患者の無増悪生存期間と全生存期間の両方の独立した予測因子として機能することが示されており、CTC 数が多いほど予後が悪いことを示します⁸。CTC 数の動的変化は、治療後の疾患の進行および腫瘍量とも密接に関連しています ^9,10。

最近の研究では、CTC を分離するための革新的なツールとしてマイクロ流体ベースの技術が強調されています。これらのテクノロジーは、物理ベースのアプローチと生物学ベースのアプローチに大別でき、それぞれが特定の課題に直面しながらも明確な利点を提供します。物理ベースの方法は、サイズと変形性の違いを利用してCTCを分離し、高スループットでラベルフリーの選別を可能にします。ただし、この非特異的分離戦略は、CTCの固有の不均一性により、捕捉効率と純度の両方を損なう可能性があります。例えば、Luらは、焦点分離および減速設計をトラップアレイと統合したマイクロ流体チップを報告し、CTCの濃縮と精製の点でほとんどの従来の物理ベースの技術を上回りました¹¹。それにもかかわらず、このチップは白血球 (WBC) の 3-4 対数の枯渇しか達成せず、臨床応用には依然として不十分です。一方、免疫親和性ベースのCTC単離戦略では、通常、より高い標的細胞回収率と純度が得られます。ただし、キャプチャ分子とCTCの間の結合相互作用は、多くの場合、そのようなアプローチのスループットを制限します^12,13。したがって、希少なCTC集団を含む臨床サンプルを効果的に処理するには、高い濃縮効率とスループットの両方のバランスをとる単離法が不可欠です。

さらに、CTC間の実質的な不均一性は、従来のバルクCTC分析では個々の細胞の区別が不明瞭になることが多いため、下流の分析^10、14、15に重大な課題をもたらします。シングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)は、CTC遺伝子発現の不均一性の包括的な分子レベルの特性評価を容易にし、CTCの分類、状態、機能についての洞察を提供します。この技術は、精密腫瘍学のための新しいアプローチを提供し、腫瘍の発生、進行、および転移メカニズムの研究を促進します¹⁶。たとえば、Fan らは、肝細胞癌患者のさまざまな血管部位から単一 CTC トランスクリプトーム アトラスを構築し、CTC 間の空間的不均一性を明らかにし、免疫回避の主要なメディエーターを特定しました¹⁷。同時に、宮本らは、前立腺がん患者のCTCにおけるアンドロゲン受容体遺伝子変異とスプライス変異体を同定し、それによって薬剤耐性の根底にあるメカニズムを解明しました¹⁸。

しかし、シングルCTCトランスクリプトームシーケンシングの開発はゆっくりと進んでいます。既存の方法論は自動化と統合に欠陥があり、その結果、CTC 回収効率が低く、手順が複雑になり、実験の成功率が低くなります¹⁹。たとえば、現在のプロトコルでは、CTC濃縮、精製、単一細胞単離、および核酸増幅を含む逐次プロセスが必要です。これらのステップは別々の遠心分離管内で実行されるため、複数のピペッティングと移送ステップが必要です。労働集約的な手順は、効率を低下させるだけでなく、CTC の損失と汚染のリスクも高めます²⁰。キャピラリーベースの細胞ピッキングなどの従来のアプローチでは、単一細胞単離中のスループットと分析効率がさらに制限されます²¹。さらに、従来の方法は、細胞のランダムなカプセル化を記述する統計的現象であるポアソン分布によっても制約されます。これにより、空の液滴の割合が高くなったり、液滴ごとに複数の細胞が発生したりして、捕捉効率が制限されます。これらの課題に対処するために、研究者らは単一細胞 CTC トランスクリプトーム解析用の統合マイクロ流体チップを開発しました。これらのプラットフォームは、複数のステップをシングルチップのワークフローに統合し、汚染リスクを軽減し、分析効率を向上させます。例えば、Euisik Yoonらは、流体力学に基づくサイズ選択を採用してCTCをマイクロチャンバーに単離し、個々のCTCを一意にバーコード化されたマイクロビーズと効率的にペアリングするHydro-Seq法を開発しました²²。このアプローチにより、複数のCTCのハイスループットの並列シングルセル分析が可能になります。ただし、この方法はサイズベースのCTC分離に依存しているため、CTC純度が低く、スループットが制限されることが多く(10 μL/min)、大量の臨床サンプルの処理には適していません。したがって、統合されたハイスループット、少量、耐汚染性のシングルセルCTC分析システムの開発が急務となっています。

ここでは、CTCソーティング、精製、およびシングルセルシーケンシングチップの3つの主要コンポーネントで構成される、CTC濃縮およびシングルセルシーケンシングのためのハイスループットで効率的なプロトコルについて説明します(図1)。CTC選別マイクロ流体チップは、動的に調整された磁気捕捉力の原理に基づいて設計されています(図2A)。ヘリンボーン構造内のボルテックス混合によるハイスループットCTC濃縮と、免疫磁気ビーズによる累積捕捉を可能にします。CTC の非破壊放出は、その後、磁場の正確な変調によって達成されます。次に、精製チップを使用し、白血球抗体でコーティングされたマイクロチャネルをネガティブセレクションに使用し、高度に精製されたCTCを生成します(図2B)。最後に、差動流抵抗に基づく高効率のシングルセル操作プラットフォームが採用され、ポアソン分布の限界を克服することに成功し、効率的なシングルセル/エンコードされたマイクロスフェアのペアリングとキャプチャを可能にしました(図3A)。マイクロビーズの消費量とシーケンシングコストを削減しながら、CTC の利用率を大幅に向上させます。

図1:マイクロ流体ベースのCTCソーティングおよびシングルセルシーケンシング技術の概略図。 このワークフローは、腫瘍細胞が腫瘍病変から剥離し、血流に入り、CTCを形成するプロセスを示しています。CTCを含む末梢血またはロイコパックサンプルは、CTCキャプチャー、精製、およびscRNA-seqチップを介して順次処理され、最終的にCTCのトランスクリプトームシーケンシングとバイオインフォマティクス解析が可能になります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Protocol

1. 方法 1: マイクロ流体ベースの CTC 単離

1. ヘリンボーンチップ(HB-chip)製造
   1. マスター金型の準備
      1. きれいなシリコンウエハーを用意し、135°Cで一晩焼き上げて水分を取り除きます。室温まで冷却した後、酸素プラズマクリーナーを150Wで1分間処理し、表面を活性化します。
      2. SU-8フォトレジストを使用して、チップの最初の層をパターン化して、サポートピラーアレイ(28列×7行、流れ方向に沿って#1から#28までの番号が付けられます)を形成します。スピンコーターを500rpmで10秒、2350rpmで55秒、500rpmで10秒ずつ順次作動するように設定します。この層の高さが50μmであることを確認します。
      3. 最初の層を65°Cで1分間ソフトベイクし、続いて95°Cで20分間溶媒を蒸発させます。室温まで冷まします。
      4. 対応する支持柱設計のフォトマスクを使用して、最初のレイヤーを露出させます。被ばく線量を130 mJ/cm²に設定します。
      5. 露光後、65°Cで1分間焼き、続いて95°Cで6分間焼きます。
      6. 冷却後、SU-8現像液をウェーハ表面に塗布し、架橋されていないフォトレジストを除去し、最下層を取得します。30秒間水たまりにしてから、脱イオン水ですすいでください。
      7. 手順1.1.1.2と同じスピンパラメータを使用して、最初の層の上に2番目のSU-8層をスピンコートします。2番目の層をパターン化して、溝幅100μm、ピッチ200μm、サイクルごとに6つのリッジで、チャネル壁に対して45°の角度でヘリンボーン構造を形成します。この層の高さも50μmであることを確認してください。
         注:微細構造の特徴(支持柱アレイおよびヘリンボーン溝を含む)のすべての関連する寸法を示す概略図は、 補足図1に提供されています。
      8. 最初の層を65°Cで1分間ソフトベイクし、続いて95°Cで20分間溶媒を蒸発させます。室温まで冷まします。
      9. ヘリンボーンデザインのフォトマスクを使用して、2番目のレイヤーを露出させます。被ばく線量を130 mJ/cm²に設定します。
      10. 露光後、65°Cで1分間焼き、続いて95°Cで6分間焼きます。
      11. 冷却後、SU-8 現像液を使用して架橋されていない領域を除去し、完全な 2 層微細構造を明らかにします。
   2. PDMSレプリカの準備
      1. プレポリマーと架橋剤を10:1の重量比で組み合わせてPDMS混合物を配合します。1つのチップ用に10〜15 mLの混合物を準備します。
      2. 混合物をマスターモールドに注ぎ、脱気によって閉じ込められた空気を取り除きます。金型を95°Cのオーブンに30分間入れてPDMSを硬化させます。
      3. 硬化したPDMSレプリカを金型から取り出します。直径1mmのPDMSパンチャーを使用して、1つの入口と1つの出口を作成します。
   3. HBチップアセンブリ
      1. 酸素プラズマクリーナーを150Wの電力に3分間設定します。PDMSレプリカとプレボンドされたPDMS層の両方をクリーンなスライドガラス上で処理して、表面を活性化します。
         注:PDMSポリマー鎖にはSi-O結合が豊富にあるため、プラズマ活性化によりPDMSとガラス、シリコンなどの基板との間の共有結合が可能になり、チップのシールが容易になります。
      2. 処理したPDMS構造を整列させ、しっかりと接着します。サポートピラーアレイとヘリンボーン機能がガラス基板と完全に統合されていることを確認し、HBチップを完成させます。
2. 免疫磁気ビーズ(IMB)の調製
   1. 25 μLの洗浄および再懸濁したストレプトアビジン修飾磁気ビーズ(SA-MB)(1 μm)(≈4 × 10 8^ビーズ/ mL)を1 μgのビオチン化EpCAM(上皮細胞接着分子)抗体とともに室温で20 rpmで40分間回転させてインキュベートし、IMBを調製します。
   2. 磁気ラック上で磁気分離した後、上清を取り除き、ビーズを25 μLの分離バッファー(1%BSA、2 mM EDTA、D-PBS)に再懸濁します。
3. 絶縁チップ動作
   1. 1〜2秒以内に20 μLの磁気ビーズ懸濁液をピペットで移動し、気泡が入らないようにします。
   2. すぐにチップを磁石の上に垂直に置き、ビーズを邪魔することなく5分間沈殿させます。
   3. 血液サンプル(末梢血または実験用ロイコパックサンプル)を採取し、すぐに4 mLを注射器に引き込み、気泡が確実に除去されるようにします。チップの入口と出口を液体で密閉して気泡を除去します。サンプルの入口チューブと出口チューブをチップに挿入します。
      注: 生体サンプルを取り扱うときは、基本的な個人保護対策が講じられていることを確認してください。
   4. シリンジポンプでサンプルを1.5mL/hの流量で注入します。
   5. サンプルローディング後、60 μLのD-PBSを0.2 mL/hの流速でHBチップに注入し、結合していない細胞を洗い流します。
   6. 磁石を取り外し、1.5 mLのBSA(D-PBSでは5%w / v)を手動で注入してチップを洗浄し、捕捉した腫瘍細胞をHBチップから放出します。

2. 方法 2: マイクロ流体ベースの CTC 精製

1. HBチップの改造
   1. 体積分率(v / v)が10%のエタノール中で(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン(MPTS)溶液を調製します。直ちに20 μLのMPTS溶液をHBチップに導入し、室温で1時間インキュベートします。
   2. 無水エタノールで一度すすぎ、100°Cで1時間乾燥させる。
   3. N-γ-マレイイドブチリル-オキシコハクシンイミドエステル(GMBS)溶液をエタノール中で0.5 mg / mLの濃度で調製します。チップを37°Cに冷却し、GMBS溶液を導入し、室温で30分間インキュベートします。
      注: MPTS および GMBS を使用する場合は、常に手袋、白衣、マスクを着用してください。これらの試薬は毒性と粘膜刺激性を持っているため、換気の良い場所で慎重に取り扱う必要があります。
   4. ddH₂Oで2回すすぎ、続いてD-PBSで2回すすぎます。
   5. すぐに15 μg/mLのストレプトアビジン(SA)を加え、室温で1時間または4°Cで一晩インキュベートします。
   6. D-PBSで2回すすいでください。
   7. CD45抗体バッファーを調製します:0.2%(w / v)BSAおよび20 μg/mLのビオチン化CD45抗体、D-PBSで体積まで希釈します。
   8. 20 μLのCD45抗体バッファーをHBチップに注入して、白血球のネガティブセレクションを行います。室温で1時間インキュベートし、D-PBSですすいでください。
   9. 3%(w / v)BSAおよび0.05%(w / v)Tween-20を含むブロッキング溶液を加え、室温で1時間インキュベートします。サンプルをロードする前に、D-PBSですすいでください。
2. サンプルのローディング
   1. シリンジを使用してサンプルを吸引し、気泡が確実に除去されるようにします。チップの入口と出口を液体で密閉して気泡を除去します。サンプルの入口チューブと出口チューブをチップに挿入します。
   2. シリンジポンプでサンプルを注入し、流量を0.6mL/hに設定します。
   3. 精製された腫瘍細胞を出口から収集し、計数と単一細胞シーケンシングを行います。

3. 方法 3: マイクロウェルベースのシングルセルバーコードおよびシーケンシング技術

1. 試薬と材料の調製
   1. チップ前処理
      1. 200 μLの1x D-PBSおよび0.5%F-68溶液をチップインレットに加えます。
      2. チップを保持しながらウォーターバス超音波処理を実行します。微多孔質領域全体に気泡が見える場合は、超音波処理を30秒間続けて、デュアルウェルから気泡を除去します。
   2. バーコードビーズの調製
      1. バーコード付き磁気ビーズの原液を完全に混合し、200 μLを遠心分離管に移します。溶液が透明になるまで磁気分離を適用し、上清を廃棄します。
      2. バーコード付きビーズを500 μLのTE-TW(10 mM Tris-HCl pH = 8.0、1 mM EDTA、0.01%Tween-20)で2回洗浄します。
      3. バーコード付きビーズを200 μLの20x TE(10 mM Tris-HCl pH = 7.5、1 mM EDTA)および50 mM DTT溶液で洗浄して再懸濁し、氷上に置きます。
   3. 単一細胞懸濁液の調製
      1. 精製した腫瘍細胞を1.5 mL遠心分離管に移し、室温で400 × g で3分間遠心分離します。ペレットを洗浄し、1 mLの1x D-PBSに再懸濁します。
      2. 細胞計数を実行し、それに応じて単一細胞懸濁液を調製します。サンプルローディング量は200 μLで、合計80,000細胞(400細胞/μL)である必要があります。
   4. 1x 生理食塩水クエン酸ナトリウム(SSC)、0.5 M LiCl、0.6% Triton X-100、10 mM EDTA、5 mM DTT、および 1 U/μL RNase 阻害剤を含む細胞溶解バッファーを調製します。
2. マイクロ流体チップの操作
   1. セルキャプチャー
      1. 200 μLの腫瘍細胞懸濁液をチップ(60000デュアルウェル)に注入し、脱色シェーカーで10 rpmで5分間振とうして、細胞が重力によってキャプチャウェルに沈殿できるようにします。
      2. チップ内の細胞懸濁液を上下に2回静かにピペットで移動させます。次に、チップを脱色シェーカーに10rpmで5分間置き、捕捉されていない細胞を再懸濁させ、再び沈降させます。
      3. 200 μLの1x D-PBSおよび0.5%F-68溶液を入口から加え、出口から溶液を吸引します。チップを合計3回洗浄するために2回繰り返します。
   2. バーコードビーズキャプチャ
      1. バーコード付きビーズ懸濁液を再懸濁し、すぐに200 μLの懸濁液を入口からチップに注入します。10 rpmで20秒間振とうします。
      2. ビーズ懸濁液を2回静かにピペットで移し、10rpmで20秒間振とうします。この手順を一度繰り返します。
      3. バーコード付きビーズ懸濁液を出口から取り出し、200 μLの20x TE(pH = 7.5)と50 mM DTT溶液を加えてから、液体を出口から取り出します。この手順を2回繰り返し、合計3回洗浄します。
   3. 細胞溶解とmRNA捕捉
      1. 200 μLの細胞溶解バッファーを入口からチップにゆっくりと加えます。直後に、200 μLの鉱物油をゆっくりと加えて、デュアルウェルを密閉します。
         注意: 汚染を防ぐために、すぐにシーリングを行う必要があります。
      2. チップ出口から廃棄物リザーバーに流れ出る溶液を取り除きます。チップを水平に置き、室温で5分間放置します。
   4. バーコードビーズの回収
      1. 溶解後、200 μLの6x SSCを入口からゆっくりと加え、廃液を除去し、残りの溶液をチップ出口から吸引します。
      2. 200 μL の 6x SSC をゆっくりと加えて、チップを充填します。磁石をチップの表面に近づけ、入口から出口までゆっくりと動かして、キャプチャウェルからバーコード付きのビーズを集めます。次に、溶液とバーコード付きビーズをチップから6x SSCをプリロードした遠心分離管にすばやく吸引します。
      3. 200 μLの6x SSCで3回洗浄し、続いて1x RTバッファーで1回洗浄します( 材料表を参照)。
3. 逆転写(RT)、エキソヌクレアーゼI処理、PCR
   1. RT
      1. 1× RTバッファー、1 mM GTP、1 mM dNTP、5%PEG 8000、2.5 μMテンプレートスイッチオリゴ( 材料表を参照)、1 U/μL RNase阻害剤、および10 U / μL逆転写酵素を含む100 μLの逆転写反応ミックスにバーコードビーズを再懸濁します。溶液を42°Cで120分間インキュベートします。
   2. エキソヌクレアーゼ治療
      1. 逆転写後、ビーズを200 μLの1x TE-SDS(10 mM Tris-HCl pH = 8.0、1 mM EDTA、0.5%SDS)で1回、200 μLの1x TE-TWで1回、および200 μLの10 mM Tris-HCl(pH = 8.0)で1回洗浄します。
      2. 1xエキソヌクレアーゼIバッファーと1 U/μLエキソヌクレアーゼIを含む100 μLのエキソヌクレアーゼミックスにビーズを再懸濁し、37°Cで45分間インキュベートします。
   3. セカンドストランド合成
      1. ビーズを200 μLの1x TE-SDSで1回洗浄します。ビーズを200 μLの0.1 M NaOHに再懸濁し、室温で30 rpmで回転させながら5分間インキュベートして、mRNA-cDNAハイブリッド産物を変性させます。次に、ビーズを200 μLの1x TE-TWで1回、200 μLの10 mM Tris-HCl(pH = 8.0)で1回洗浄します。
      2. ビーズを、1x RTバッファー、1 mM dNTP、5%PEG 8000、0.5 μMセカンドストランド合成プライマー( 材料表を参照)、および0.125 U / μLのKlenowフラグメントを含む100 μLの反応混合物に再懸濁します。溶液を37°Cで60分間インキュベートします。
   4. cDNA増幅
      1. ビーズを200 μLの1x TE-SDSで1回、200 μLの1x TE-TWで1回、200 μLの10 mM Tris-HCl(pH = 8.0)で1回洗浄します。
      2. 1x PCR反応ミックスと0.8 μMのISPCRオリゴを含む150 μLのPCRミックスにビーズを再懸濁します( 材料表を参照)。PCRプログラムを次のように設定します:95°Cで3分間。98°Cで20秒、65°Cで30秒、72°Cで3分間の4サイクル。98°Cで20秒、67°Cで20秒、72°Cで3分間の8サイクル。72°Cで5分間。
      3. 製造元の指示に従って、DNA精製用の0.6x固相可逆固定化(SPRI)磁気ビーズでPCR産物を2回精製し、20.5 μLのH₂Oで溶出します。蛍光ベースのDNA定量アッセイを使用して、精製されたPCR産物の濃度を測定します。
      4. 1x PCR反応ミックスと0.8 μMのISPCRオリゴを含むPCRミックスを使用して、精製されたPCR産物の2回目の増幅を行います( 材料表を参照)。PCRプログラムを次のように設定します:98°Cで3分間。98°Cで20秒、67°Cで20秒、72°Cで3分間の5サイクル。72°Cで5分間。
      5. 製造元の指示に従って、DNA精製用の0.6x SPRI磁気ビーズでPCR産物を2回精製し、20.5 μLのH₂Oで溶出します。蛍光ベースのDNA定量アッセイを使用して、精製されたPCR産物の濃度を測定します²³。
   5. cDNAライブラリーの構築
      1. 製造元の指示に従って、標準的なDNAライブラリ調製キット( 材料 表を参照)でライブラリを構築します。
      2. プライマーペアN70X / P5を使用してPCRでライブラリを増幅します( 補足表を参照)。PCRプログラムを次のように設定します:72°Cで3分間。98°Cで30秒間。98°Cで15秒間、58°Cで30秒間、72°Cで3分間の12サイクル。72°Cで5分間。
      3. 製造元の指示に従って、DNA精製用の0.6x SPRI磁気ビーズでライブラリーを精製し、20 μLのH₂Oで溶出します。蛍光ベースのDNA定量アッセイを使用して、精製されたPCR産物の濃度を測定します。
         注:一般に、最終的なDNAライブラリー濃度は≥2 ng / μL、総量は50 ng≥許容できると見なされます²⁴。

Results

CTCキャプチャインターフェースの組み立てと解放は、顕微鏡で評価できます。磁場下でのHBチップの底部にある磁気ビーズ(MB)の均一な分布は、組み立ての成功を示し、残留MBが最小限またはまったくない場合は、放出が成功したことを確認します(図2C)。このステップは、捕捉されたCTCの収量と純度を決定するために重要です。CTC分離チップの捕捉効率を検証するために、スパイクイン実験を実施しました。EpCAM発現が高い少数の腫瘍細胞(PC3またはLNCaP)を、EpCAM発現が低いJurkat細胞の大量集団を含むPBSにスパイクし、循環中の豊富な血球の存在をシミュレートしました。CTC単離チップは、1 mLと10 mLの両方のサンプルから腫瘍細胞を効率的に捕捉し、そのハイスループットで効率的なCTC選別能力を実証しました(図2D)。IMBベースのキャプチャーの特異性を評価するために、EpCAM抗体結合を欠くSA-MBで修飾されたコントロールチップを使用しました。有意な腫瘍細胞捕捉がなかったため、IMBを介したCTC単離の特異性が確認されました(図2D)。

捕捉効率に加えて、純度もCTC分離プラットフォームを評価するための重要なパラメータです。キャプチャチップまたは精製チップのみを使用して単離された腫瘍細胞の純度と、連続したポジティブおよびネガティブセレクションによって達成された純度を比較しました(図2E)。どちらのチップも対照群と比較して腫瘍細胞の純度を大幅に改善し、CTC の単離における有効性を実証しました。さらに重要なことは、ポジティブセレクションとネガティブセレクションの両方を組み合わせて使用することで、単一の方法を使用した場合と比較して、腫瘍細胞の純度と収量がさらに向上したことです。

臨床現場でのCTCキャプチャーおよび選別チップの性能をさらに評価するために、6人の健康なドナーから末梢血(PB)サンプルを収集し、スパイク実験を実施しました。臨床サンプル中のCTCの存在量が極端に低いことを考えると、約500〜1000個のLNCaP細胞をPBサンプルの10 mLごとにスパイクしました。採取されたすべてのPBサンプルのWBC数は、正常範囲内(4〜10×10⁶細胞/ mL)内でした。結果は、CTC選別システムが臨床サンプルを処理する場合でも、腫瘍細胞の高い捕捉効率と純度を維持することを実証しました(図2F-G、および補足図2)。

図2:ヘリンボーン構造のCTCキャプチャおよび精製プラットフォーム。 (A)CTC分離チップのワークフロー。まず、安定した磁場とEpCAM抗体結合IMBがキャプチャインターフェースを組み立てます。次に、HB チップ内のボルテックス混合により、CTC と IMB 間の物質移動効率が向上し、蓄積された捕捉が容易になります。最後に、磁場を除去することにより、CTC の穏やかな放出が達成されます。(B)CTC精製チップのワークフロー。HBチップはネガティブセレクション抗体で修飾され、ボルテックスミックスにより白血球と抗体の相互作用がさらに促進され、最終的に高度に精製されたCTCが得られます。スケールバー、100 μm。(C)顕微鏡イメージングは、キャプチャーチップの組み立てと放出が成功していることを示しています。(D)棒グラフは、非官能化SA-MBをコントロールとして使用して、異なるサンプル量にわたる分離プラットフォームのCTC捕捉効率を比較します。誤差線、平均±SD、n = 3。(E)棒グラフは、単一のHBチップのみを使用して得られたCTCの純度と、連続したキャプチャおよび精製を受けるCTCの純度を比較します。対照群は、未処理の CTC 純度を表します。誤差バー、平均±SD、n = 3。(F)CTC分離チップでの細胞同定。LNCaP細胞はHoechstとCalcein AMで染色し、血球はHoechstのみで染色しました。スケールバー、100 μm。(G)1 mLまたは10 mLの末梢血を使用したスパイク実験における腫瘍細胞の純度と捕捉効率。誤差線、平均±SD、n = 3。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

単離された腫瘍細胞は、その後、ハイスループットの単一細胞シーケンシングにかけられました。私たちのプロトコルには、60,000のネストされたマイクロウェルで構成される単一セルバーコードシステムが組み込まれています(図3A-B)。下部の正方形のマイクロウェルは個々の細胞を捕捉するのに役立ち、上部のマイクロウェルはビーズローディング用に設計されています。各下部マイクロウェルの長さ、幅、高さは25 μmで、ほとんどの細胞タイプに適しています。上部の六角形のウェルは、通常30〜50 μmの範囲のビーズを収容するために、内接円の直径と高さが50 μmです。このシステムは、サイズ排除マイクロウェルによる細胞ダブレットを回避しながら、累積捕捉に基づいて細胞捕捉効率を高めます。セルローディングプロトコルを最適化するために、さまざまな細胞入力条件下での細胞捕捉効率とマイクロウェル占有率を調査しました(図3C)。結果は、セルインプットを増やしても捕獲効率が低下しないことを示しました。むしろ、占有率を大幅に向上させました。60,000ウェルのキャプチャチップの場合、セル入力量が80,000に達するとマイクロウェル占有率は横ばいになり、追加の入力量によってそれ以上増加することは見られませんでした。過剰なセル負荷によるダブレットの発生を最小限に抑えるために、最適なインプットとして80,000セルを選択しました。図3Dに示すように、シングルセルバーコードチップは85.6%のセル占有率と95.7%のバーコードビーズ占有率を達成し、ペアリング率は81.9%でした。さらに、プロトコルに従って複数のセトリングが実行され、累積捕獲効果を通じて捕獲効率とペアリング率が大幅に向上しました(図3D)。特に、細胞とビーズの間で観察された占有率の違いは、細胞と比較してビーズの密度と質量が大きいことに起因しており、これによりビーズは重力下でより効率的にマイクロウェルに沈殿することができます。したがって、最適化された積載条件下では、約80%のペアリング占有率が一般的に理想的であると考えられています。

図3:マイクロウェルベースのハイスループットシングルセルバーコードおよびシーケンシング技術。 (A)シングルCTCシーケンシングプロトコルのワークフロー。(B)マイクロコピーは、マイクロ流体シングルセル/バーコードビーズキャプチャウェル構造を示しています。細胞捕捉、ビーズ捕捉、ビーズ回収のプロセスを左から右に示します。スケールバー 30 μm。(C) 折れ線グラフは、さまざまなセル入力条件下でのシングルセルバーコードチップ(60000デュアルウェル)のセルキャプチャ効率とマイクロウェル占有率を示しています。(D)最適化された細胞入力条件下での細胞およびバーコードビーズの占有率、および対応する細胞-ビーズペアリング比。左パネルと右パネルは、それぞれ複数回のセトリング試行とシングルセトリングのみを利用したキャプチャーアプローチを示しています。誤差線、平均±SD、n = 3。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

最後に、CTCソーティングとscRNA-seqの統合プロトコルを検証するために、PC3、LNCaP、およびJurkat細胞を1:3:4000の推定比率で混合し、腫瘍細胞の捕捉、精製、および単一細胞シーケンシングのためにマイクロ流体チップにロードしました。効率的な腫瘍細胞単離プラットフォームを通じて、高純度のEpCAM陽性腫瘍細胞が得られました(図4B)。同時に、マイクロ流体ベースのscRNA-seqチップは、正確な細胞型プロファイリング機能を実証し、その結果はt-Distributed Stochastic Neighbor Embedding(t-SNE)解析によって視覚化されました(図4A)。3つの異なる細胞集団を同定することに成功し、それぞれが固有のマーカーによって区別できました(図4C)。さらに、最終出力の細胞の割合は精製された入力の割合とほぼ一致し、単一細胞のバーコード処理に偏りがなく、汚染がないことが確認されました(図4B)。1つのクラスターは、TRBC1、IGLL1、CD1E、およびCD3Dの特異的発現に基づいてJurkat細胞として同定されました(図4D)。経路濃縮分析により、この分類の堅牢性がさらに確認されました(図4E)。さらに、2つの前立腺がん細胞株は、差次的に発現する遺伝子(DEG)に従って個々のクラスターに明確に分離されました(図4F-G)。PC3クラスターは、PC3分泌マイクロタンパク質としても知られるミクロセミノタンパク質(MSMP)の高発現によって特徴付けられました。一方、LNCaPクラスターは、NEDD4、CTNNA1(α-カテニン1)、RBBP7など、細胞の接着、増殖、多能性に関連するマーカーを独自に発現させました。

図4:スパイクイン実験を使用したCTCソーティングとシングルセルシーケンシングの検証。 (A)捕捉および精製された細胞の細胞型プロファイリングを示すt-SNEプロット。(B)初期入力、精製後、および最終シーケンシング出力の3つの段階での3つの細胞型の比率を示す棒グラフ。(C)異なる細胞クラスターにわたる固有のマーカー遺伝子の発現を示すドットプロット。(D)すべての細胞にわたるTRBC1、IGLL1、CD1E、およびCD3Dの発現レベル。(E)Jurkatクラスターにおける差次発現遺伝子(DEG)のGOおよびKEGG経路濃縮解析。(F)すべての細胞におけるNEDD4およびMSMPの発現パターン。(G)PC3クラスターとLNCaPクラスターの間のDEGを示す火山プロット。赤い点は、PC3でアップレギュレーションされた遺伝子を表します。青い点は、LNCaPでアップレギュレーションされたものを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

マスターミックス	試薬	最終希釈	バッファーの種類
0.5% F-68	F-68	0.50%	DEPC処理水
	PBSの	1×
TE-TWの	トリス-HCl(pH=8.0)	10ミリメートル	DEPC処理水
	EDTAの	1ミリメートル
	トゥイーン-20	0.01%
20×TE(pH = 7.5)	トリス-HCl(pH=7.5)	200ミリメートル	DEPC処理水
	EDTAの	20ミリメートル
TE-SDSの	トリス-HCl(pH=8.0)	10ミリメートル	DEPC処理水
	EDTAの	1ミリメートル
	SDSの	0.50%

表1:シングルCTCシーケンシング調製用の試薬混合物の組成。 scRNA-seqに必要な試薬の一部は、チップ操作の前に準備して、迅速かつスムーズなプロセスを確保できるものです。

補足図1:HBチップの設計。 (A)2層マイクロ流体構造の概略図。上:ヘリンボーン構造が特徴の最上層。拡大された挿入図は、溝幅100μm、ピッチ200μmで、チャネル壁に対して45°の角度で配向されたヘリンボーンの詳細な形状を示しています。下:流れ方向に沿って#1から#28までの番号が付けられた支持柱アレイ(28列×7行)で構成される最下層。(B)ヘリンボーンチップの側面図。ヘリンボーン溝の幅は100μmです。ヘリンボーン構造と支柱の両方の高さは50μmです。(C)ヘリンボーンチップの上面図。各支柱の幅は500μm、長さは1150μmで、隣接する柱の間には550μmの隙間があります。(D)製造されたHBチップの写真。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:蛍光染色された腫瘍細胞およびCTC単離チップの出口から採取された廃液中に存在する血球を示す代表的な画像。 LNCaP細胞はHoechstとCalcein AMで染色し、血球はHoechstのみで染色しました。スケールバー 100 μm。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表:逆転写およびライブラリ調製に使用されるオリゴヌクレオチド配列この ファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

CTC は、がんの診断、治療指導、および腫瘍の発生、進行、および転移に関する研究のための貴重なバイオマーカーとして機能します²⁵。しかし、既存のCTC分離法では、高効率と高スループットの両方を達成できません²⁶。さらに、CTCの放出効率が低いと、純度が低く、細胞損傷が大きくなることが多く、下流の分析との適合性が制限されます²⁷。ここでは、CTCキャプチャ、精製、scRNA-seqの3つの主要な手順からなる、ハイスループットCTCソーティングとシングルCTCシーケンシングのための統合プロトコルを提案しました。

このマイクロ流体ベースのプラットフォームは、柔軟性と拡張性を提供します。HBチップのパラレルチャンネル数とバーコードチップのキャプチャウェルは、さまざまなサンプル要件に応じて調整できるため、ハイスループットの要求を満たすことができます。CTC キャプチャ チップでは、特定のがんの種類に応じて IMB を最適化できます。たとえば、前立腺がん患者のサンプルでは、EpCAM抗体とPSMA抗体のカクテルでIMBを官能化して、捕捉効率を高めることができます。さらに、EpCAM ベースのキャプチャのみに依存すると、上皮間葉転換 (EMT) を経た間葉系 CTC が失われる可能性があります。この問題に対処するために、熱ショックタンパク質70(HSP-70)または細胞表面ビメンチン(CSV)に対する追加の抗体を組み込んで、さまざまなEMT段階でCTCを捕捉することができます。

CTCの捕捉と精製用のHBチップはマイクロ流体ベースであるため、実験中は慎重な取り扱いが不可欠です。チップ入口に試薬を導入する前に、すべての気泡を除去する必要があり、入口と出口の両方を密閉して閉じ込められた空気を排除できます。さらに、捕捉された気泡はIMBや細胞の通過を妨げ、捕捉効率と純度を大幅に低下させる可能性があるため、試薬を迅速に(1〜2秒以内に)導入する必要があります。さらに、前述したように、CTC の捕捉を成功させるには、IMB の均一な分布が重要です。IMB をロードした後、磁場の変化によって IMB の分布が妨げられないように、チップを磁石の上に垂直に置き、少なくとも 5 分間所定の位置に固定する必要があります。特に、プロトコルで指定されたセルローディング流量は、さまざまなサンプルタイプに基づいて最適化する必要があります。たとえば、ロイコパックサンプルは、白血球濃度と粘度の上昇を示します。流量が速すぎると、CTC と IMB 間の効率的な相互作用が妨げられ、蓄積された磁気捕捉が妨げられ、CTC の純度が低下する可能性があります。臨床血液サンプルの処理におけるCTC単離および精製プラットフォームの性能を評価するために、数人の健康なドナーからPBを収集し、少数のLNCaP細胞(mLあたり約50〜100細胞)をサンプルにスパイクしました。特に、このプラットフォームはPBサンプル中の腫瘍細胞に対して高い捕捉効率と純度を示しましたが、その性能はPBSベースの細胞サンプルで観察されたものよりもわずかに低かったです(図2D、 図2E、 および図2G)。この不一致は、PBSと比較して血液の粘度が高く、豊富な赤血球と血小板が存在することによるものであると推測しています。したがって、臨床血液サンプルを取り扱う場合、性能を向上させるために、赤血球溶解や PBMC 抽出などの前処理ステップを検討できます。

HBチップと同様に、マイクロ流体ベースのシングルセルバーコードチップは、気泡の形成を防ぐために慎重な取り扱いが必要です。関連する試薬の種類が多様であることを考えると、一部の試薬はチップ操作を開始する前に事前に準備することができます(表1)。セルとビーズをロードする場合、セルは密度が低く、バーコード付きビーズは密度が高いため、均一な分布を確保するために注入速度を慎重に制御する必要があります。通常、細胞懸濁液は3~5秒かけてゆっくりと添加し、その後1~2秒以内にビーズ懸濁液を急速に添加する必要があります。セルとビーズをロードした後、吸引と分注を 2 回行い、チップをシェーカーに置いて累積捕捉プロセスを完了します。このステップは、稼働率とペアリング率を向上させるために重要です。細胞溶解中は、オイルシール法を使用してマイクロウェル表面を分離し、ウェル間の相互汚染を防ぎます。特に、鉱物油は溶解後すぐに遅滞なく添加する必要があります。溶解後、磁石を入口から出口までゆっくりと動かすことでバーコードビーズ回収を行い、高いビーズ回収率を確保します。必要に応じて、このステップを複数回繰り返すことができます。最後に、遠心分離管内で回収された磁気ビーズは、RT、セカンドストランド合成、PCR増幅、ライブラリ構築を受け、続いて次世代シーケンシング(NGS)が行われます。

この統合されたマイクロ流体プラットフォームは、臨床応用に大きな可能性を秘めています。CTC 分離の効率とスループットを向上させることで、腫瘍量の少ない段階での CTC 検出が増加し、CTC 数と腫瘍病期分類を関連付ける分類モデルの確立が可能になります。この進歩により、がんの診断、治療モニタリング、予後評価、再発予測のための新しいアプローチが提供されます。さらに、CTC の単一細胞トランスクリプトーム解析により、必須遺伝子経路、相互作用ネットワーク、バイオマーカー遺伝子などの主要な分子特徴の同定が可能になります。この分析は、早期がん転移を引き起こす重要な要因についての洞察を提供し、転移病変形成の根底にある分子メカニズムを明らかにし、再発がんまたは転移性がん患者に潜在的な治療標的を提供します。さらに、このプラットフォームは拡張性に優れています。特定の分析要件を満たすように適応し、トランスクリプトミクスやゲノミクスなどのマルチオミクス解析をサポートするように拡張できます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン	シグマ・オルドリッチ	175617-100G	MPTS解法
20回以上;SSCバッファ	サンゴン・バイオテック	B548109-0200
5×RTバッファ	サンゴン・バイオテック	B610020-0500
ビオチニル化CD45モノクローナル抗体	eバイオサイエンス	13-0459-82	2&度の保管;Cから8°へ;注記;
ビオチン化EpCAMモノクローナル抗体	eバイオサイエンス	13-9326-82	2&度の保管;Cから8°へ;注記;
牛血清アルブミン(BSA)	サンゴン・バイオテック	A600332-0100	2&度の保管;Cから8°へ;注記;
デコーダーカートリッジチップ	動的バイオシステム	2203106	2&度の保管;Cから8°へ;注記;
デコーダーカートリッジ試薬キット	動的バイオシステム	2203206	2&度の保管;Cから8°へ;注記;
DEPC処理水	サンゴン・バイオテック	B501005-0500
D-PBS	サンゴン・バイオテック	E607009-0500	含有量:NaCl 136.89mM;KCl 2.67 mM;Na2HPO4 8.10 m;KH2PO4 1.47 mM。pH=7.2-7.4
DTT	サーモ・サイエンティフィック	R0861	2&度の保管;Cから8°へ;注記;
ダイナビーズ MyOne SA T1	インビトロジェン	65602	SA-MBs、1およびmu;m
EDTA	サンゴン・バイオテック	B540625-0500	0.5 M、pH=8.0
KAPA HiFi ホットスタート レディミックス	ロシュ	KK2601	2×PCR反応ミックス
塩化リチウム沈殿ソルン。	インビトロジェン	AM9480	0.2 & micro;mフィルタリング
N-&γ;-マレイミドブチリル-オキシシニミドエステル	サーモ・サイエンティフィック	22309	GMBSの解法
プルロニック F-68	サンゴン・バイオテック	A600749-0025
Qubit 1×dsDNA HSアッセイキット	サーモ・サイエンティフィック	Q33231
SDSソリューション	サンゴン・バイオテック	B648118-0100	SDS 10%
ストレプタビジン	シグマ・オルドリッチ	189730	2&度の保管;Cから8°へ;注記;
SU-8フォトレジスト	微生物化学	SU-8 3050
SYLGARD 184 シリコーンエラストマーキット	ダウコーニング	4019862
トリスHCl(pH 7.5)	リージェン	NR0072	1 mol/L、pH=7.5、RNaseフリー
トリスHCl(pH 8.0)	リージェン	NR0073	1 mol/L、pH=8.0、Rnase遊離
トライトン X-100	サンゴン・バイオテック	A600198-0500
Trueprep DNA ライブラリ Prep Kit V2 for Illumina	ヴァイジーム	TD502	DNAライブラリー調製キット
トゥイーン-20	サンゴン・バイオテック	A600560-0500
VAHTS DNA クリーンビーズ	ヴァイジーム	N411	DNA精製のための固体可逆固定(SPRI)磁気ビーズ