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方法論記事

中赤外顕微鏡誘導質量分析イメージングによるマルチモーダル空間メタボロミクス

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DOI:

10.3791/68709

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2025年7月25日

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* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

空間分解代謝および生化学分析のために、質量分析イメージング (MSI) と中赤外線 (MIR) イメージングを同じ組織切片に統合するマルチモーダル空間メタボロミクス ワークフローを提示します。

要約

空間メタボロミクスは、組織、臓器、さらには単一細胞内の代謝産物の分布をマッピングするために急速に進化している分野です。このアプローチは、生物学的システムの生化学的不均一性を理解するために重要な、状況に応じた代謝情報を提供します。中赤外 (MIR) イメージングと質量分析イメージング (MSI) は、空間メタボロミクスの強力なアプローチとして登場しており、それぞれが独自の補完的な利点を提供します。本研究では、実験手順、イメージングの共同登録、データ統合、バイオインフォマティクス解析など、MIRイメージングとマトリックス支援レーザー脱離イオン化MSI(MALDI-MSI)を同じ組織切片で実行するためのワークフローを紹介します。MIR イメージングは上流のモダリティとして採用されており、組織の非破壊生化学分析を可能にします。続いて、MIRイメージングから得られた空間情報に基づいて、マトリックスがMALDI-MSIの組織に沈着します。画像は共同登録後に統合され、Seuratなどの高度なバイオインフォマティクスツールを使用したマルチモーダル空間メタボロミクス解析が可能になります。MIR イメージングと MSI の統合は、空間メタボロミクスにおける革新的な進歩を表しており、健康と病気の両方における代謝プロセスの空間的および化学的複雑さを調査する前例のない機会を提供します。このマルチモーダルなアプローチは、バイオマーカーの発見、疾患診断、治療法開発におけるイノベーションを推進する大きな可能性を秘めています。

概要

空間メタボロミクスでは、質量分析イメージング(MSI)やその他の空間分解技術を代謝分析と統合することにより、代謝産物を天然組織のコンテキスト内でマッピングし、組織下、細胞、または細胞内分解能での代謝に関する洞察を提供します1,2,3,4,5,6,7,8 .これらのイメージングモダリティの中で、中赤外(MIR)顕微鏡は、分子振動コントラスト4,7,9,10,11,12に基づいて生体分子を化学的にマッピングする能力でますます注目を集めています。

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プロトコル

このプロトコルは、復旦大学実験動物資源センターの施設動物管理および使用委員会 (IACUC) によって承認された動物実験プロトコル (DSF-2024-004) に従って実施されました。

注:この研究は、同じ組織切片でMIRイメージングとMALDI-MSIを実行するためのワークフローを提供します。この統合アプローチには、実験手順、画像の共同登録、データ融合、および下流のバイオインフォマティクス分析が含まれます(図1C)。MIRイメージングは上流のモダリティとして利用され、組織の非破壊的でラベルフリーの生化学的マッピングを可能にします。MIRイメージングからの空間情報に基づいて、マトリックスはその後、MALDI-MSI取得に適用されます。正確な共登録に続いて、データセットは多変量共解析のために統合され(図4)、高度な計算ツールによる包括的な空間メタボロミクスが可能になります。

1. サンプル調製

  1. 組織サンプルの調製
    1. マウス組織の収集
      1. C57BL/6Jマウス(20週齢、40g)を特定の病原体フリー(SPF)条件下でハウスし、12時間の明暗サイ....

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結果

上記のマルチモーダル空間メタボロミクス戦略を検証するために、がんのマウスモデルに実装しました。腫瘍細胞は緑色蛍光タンパク質 (GFP) を発現するように遺伝子組み換えされ、蛍光イメージングによる腫瘍領域の正確な位置特定が可能になりました。図2Aは、「指紋領域」として知られる950〜1800 cm-1のスペクトルカバレッジを持つラベルフリーのQCL-MIRイメージング結果を示しています。P=Oストレッチ(1240 cm-1、核酸およびリン酸脂質)、アミドII(1550 cm-1、タンパク質)、アミドI(1650 cm-1、タンパク質)、エステルC=Oストレッチ(1740 cm-1、グリセロ脂質)など、代表的なMIRバンドが図2Aにマークされています。

GFP蛍光シグナルは、腫瘍領域の空間的対応を評価するための内部参照として機能しました(

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ディスカッション

ここでは、MSIとMIRイメージングを統合して、同じ検体でハイスループットで分子特異的な代謝プロファイリングを可能にするマルチモーダル空間メタボロミクス戦略を紹介します。MIRイメージングは、分子振動に基づくラベルフリーの非破壊化学マッピングを可能にし、詳細な構造基および官能基情報を提供します。対照的に、MSI は代謝物の同定と定量に高い感度と特異性を提供し、メタボロミクス研究の基礎としての地位を確立しています。これら 2 つのモダリティを統合することで、MIR イメージングの化学的特異性と MSI の分子精度の補完的な強みを活用して、代謝の不均一性をより包括的に理解できます。

提案されたマルチモーダルプラットフォームの主な利点は、ターゲットMSI取得のために空間的に分解された関心領域(ROI)の識別を実行できることです。ハイスループットMIRイメージングは、ROIの選択を導くための迅速でラベルフリーの非侵襲的なモダリティとして機能します21。空間的ミスアライメントを.......

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

MALDI2-MSIイメージングに関するサポートを提供してくれたWestlake UniversityのYilong Zou博士と、QCLベースのMIRイメージングに関する支援を提供してくれたBruker Scientific Technology Co., Ltd.上海オフィスに感謝します。また、KrasLSL-G12D/+ Tp53fl/fl Rb1fl/fl ZsgreenLSL マウスを提供してくださった華中科技大学の Shuguo Sun 博士にも感謝します。この研究は、非感染性慢性疾患-国家科学技術専攻プログラム(2023ZD0500400 to L.S.、G.W.、D.Y.)、中国国家自然科学基金(No.22377016 to L.S.)、復旦大学および曹峨江基礎研究基金(No. 24FCA08 to L.S.)からの助成金によって支援されています。また、復旦大学上海医科大学の中核施設にも感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4%パラホルムアルデヒド、組織固定液SangonBiotech E672002
シ血清アルブミンSigma Aldrich126615
C57BL/6JNifdc マウスCharles River219
CaF2 スライドCrystranCAFP25-1
クライオスタットミクロトームDakewe BiotechCT520
CytospecPeter Laschバージョン 2.10.01ベースライン補正、正規化、画像生成、ハイパースペクトル解析など、MIRデータ解析用のソフトウェア。
DPBSバッファーフィッシャーサイエンティフィック 14-190-250
ウシ胎児血清Gibco10270106
凍結乾燥機LABCONCOFreeZone
ゼラチン Sigma-AldrichG1890タイプ A、ブタの皮膚
HBSS 緩衝液Sangon Biotech  由来。A003210
高グルコースDMEMThermoFisher Scientific 10564011
ライン補正、正規化、画像生成、ハイパースペクトル分析などの MIR データ分析用のMatlabMathWorksMatlab R2024a
マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析イメージング (MALDI-MSI) システムBruker Daltonics GmbH timsTOF fleX MALDI-2
メタノールシノファーム化学試薬10014108
mMass昆虫学研究所、チェコ科学アカデミー生物学センター、チェコ共和国バージョン5.5.0MSI データ分析用ソフトウェア。生のMSIデータをSCILS Labにインポートして前処理します。相対強度 0.01% の mMass >ピークピッキングを実行します。
N-(1-ナフチル)エチレンジアミン二塩酸塩(NEDC)マトリックス シグマ アルドリッチ222488
ペニシリン - ストレプトマイシンサーモフィッシャー サイエンティフィック 15140122
量子カスケードレーザー 中赤外(QCL-MIR)顕微鏡nbsp;Bruker Optics GmbHLUMOS II ILIM
赤リンSigma-Aldrich8.0727
SCiLS LabBruker DaltonicsSCiLS Lab 2024bMSI データ分析用ソフトウェア。生のMSIデータをSCILS Labにインポートして前処理します。相対強度 0.01% の mMass >ピークピッキングを実行します。
噴霧器HTX TechnologiesTM
トリプシン、0.25% EDTAThermoFisher Scientific C25200072
ウベース ソフトウェア。&

参考文献

  1. Alexandrov, T. Spatial metabolomics: From a niche field towards a driver of innovation. Nat Metab. 5 (9), 1443-1445 (2023).
  2. Gilmore, I. S., Heiles, S., Pieterse, C. L. Metabolic imaging at the single-cell scale: Recent advances in mass spectrometry im....

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