方法論記事

中赤外顕微鏡誘導質量分析イメージングによるマルチモーダル空間メタボロミクス

DOI：

10.3791/68709

⸱

2025年7月25日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, 2Shanghai Xuhui Central Hospital, Zhongshan-Xuhui Hospital, 3Children's Hospital of Fudan University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

空間分解代謝および生化学分析のために、質量分析イメージング (MSI) と中赤外線 (MIR) イメージングを同じ組織切片に統合するマルチモーダル空間メタボロミクス ワークフローを提示します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

空間メタボロミクスは、組織、臓器、さらには単一細胞内の代謝産物の分布をマッピングするために急速に進化している分野です。このアプローチは、生物学的システムの生化学的不均一性を理解するために重要な、状況に応じた代謝情報を提供します。中赤外 (MIR) イメージングと質量分析イメージング (MSI) は、空間メタボロミクスの強力なアプローチとして登場しており、それぞれが独自の補完的な利点を提供します。本研究では、実験手順、イメージングの共同登録、データ統合、バイオインフォマティクス解析など、MIRイメージングとマトリックス支援レーザー脱離イオン化MSI(MALDI-MSI)を同じ組織切片で実行するためのワークフローを紹介します。MIR イメージングは上流のモダリティとして採用されており、組織の非破壊生化学分析を可能にします。続いて、MIRイメージングから得られた空間情報に基づいて、マトリックスがMALDI-MSIの組織に沈着します。画像は共同登録後に統合され、Seuratなどの高度なバイオインフォマティクスツールを使用したマルチモーダル空間メタボロミクス解析が可能になります。MIR イメージングと MSI の統合は、空間メタボロミクスにおける革新的な進歩を表しており、健康と病気の両方における代謝プロセスの空間的および化学的複雑さを調査する前例のない機会を提供します。このマルチモーダルなアプローチは、バイオマーカーの発見、疾患診断、治療法開発におけるイノベーションを推進する大きな可能性を秘めています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

空間メタボロミクスでは、質量分析イメージング(MSI)やその他の空間分解技術を代謝分析と統合することにより、代謝産物を天然組織のコンテキスト内でマッピングし、組織下、細胞、または細胞内分解能での代謝に関する洞察を提供します1,2,3,4,5,6,7,8 .これらのイメージングモダリティの中で、中赤外(MIR)顕微鏡は、分子振動コントラスト4,7,9,10,11,12に基づいて生体分子を化学的にマッピングする能力でますます注目を集めています。非破壊、ラベルフリー、高速、費用対効果の高い性質4,7,9,10,11,12により、MIRイメージングはMSIとの統合に特に適しており、包括的な空間分析のための有望なマルチモーダルアプローチを形成します。

マトリックス支援レーザー脱離イオン化MSI(MALDI-MSI)は、空間メタボロミクスで最も広く使用されている技術の1つです(図1A)13。脂質、アミノ酸、糖、ヌクレオチド、二次代謝物など、幅広い代謝産物を高感度で検出できます1。マトリックス選択(例えば、2,5-ジヒドロキシ安息香酸[DHB]、9-アミノアクリジン[9AA]、またはN-(1-ナフチル)エチレンジアミン二塩酸塩[NEDC])およびイオン化技術(例えば、ポストイオン化法)の進歩により、特に存在量が少なくイオン化性の低い種の検出範囲がさらに拡大しました14。最新のMALDI-MSIシステムは、空間分解能と使用する質量分析装置の種類(飛行時間型[TOF]、Orbitrap、またはフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴[FT-IRC]など)に応じて、通常5〜50ピクセル/秒の範囲のイメージング速度をサポートします。特に、高速 MALDI-TOF 機器は毎秒 100 ピクセルを超える速度を達成しており、数時間以内に大面積のイメージングを可能にしています15。MALDI-MSIの空間分解能は一般に5〜50μm以内であり、細胞および細胞内構造を分離するのに十分である16,17。ただし、空間分解能が高くなると、通常、取得時間が長くなり、信号対雑音比が低下し、データ処理中の計算要求が大きくなります。

MSIとは異なり、MIRイメージングは広視野光学アプローチ4であり、本質的に非破壊でハイスループットです。高出力量子カスケードレーザー(QCL)の最近の進歩により、離散周波数赤外線(DFIR)イメージングとして知られる新しいフレームワークが可能になり、ビデオレートまでイメージング速度が大幅に向上します(図1B)12,18。さらに、QCLソースにより、非冷却マイクロボロメーター検出器がMIRイメージングに実行可能になり、より大きな焦点面アレイ(FPA)検出器の使用が可能になりました12。その結果、1 cm2 領域にわたる単一周波数の MIR 画像をセル分解能 (~5 μm) でわずか数秒で取得できます。MIRイメージングは、ラベルフリーモードとラベル付きモードの両方で動作できます。以前の研究4,19,20では、その場でのさまざまな代謝活動の動態を監視するために、小型のIR活性振動プローブが導入されています。これらのプローブは、独自のMIRスペクトルバンド4を介してグローバルな化学変換を報告することにより、代謝経路のリアルタイム追跡を可能にします。したがって、MIRイメージングは、静的な生化学的プロファイリングと動的代謝モニタリングの両方を、高い空間分解能と迅速な取得速度で提供します。

この原稿では、MIRガイド付きMALDI-MSI空間メタボロミクスを実行するための包括的なワークフローを紹介し、同じ標本から両方のモダリティを取得する実現可能性を実証します(図2、 図3)。MIRイメージングとMSIを統合することで、各技術の補完的な強みを活用したマルチモーダルアプローチを確立します。MIRイメージングは、細胞分解能でスライド全体のラベルフリーの生化学的マッピングを迅速に提供し、その後のMSI取得における関心領域(ROI)選択の貴重なガイドとして機能します。この戦略により、より的を絞った効率的なMSIワークフローが可能になり、空間メタボロミクスデータの解釈可能性と生物学的関連性を高めながら、取得時間とコストが削減されます。次に、MSIはMIRハイパースペクトル画像の非常に詳細な分子アノテーションを提供し、組織生化学のより深い理解を可能にします。全体として、この統合されたアプローチは、バイオマーカーの発見、疾患診断、治療法の開発を前進させる大きな可能性を秘めています。

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プロトコル

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このプロトコルは、復旦大学実験動物資源センターの施設動物管理および使用委員会 (IACUC) によって承認された動物実験プロトコル (DSF-2024-004) に従って実施されました。

注:この研究は、同じ組織切片でMIRイメージングとMALDI-MSIを実行するためのワークフローを提供します。この統合アプローチには、実験手順、画像の共同登録、データ融合、および下流のバイオインフォマティクス分析が含まれます(図1C)。MIRイメージングは上流のモダリティとして利用され、組織の非破壊的でラベルフリーの生化学的マッピングを可能にします。MIRイメージングからの空間情報に基づいて、マトリックスはその後、MALDI-MSI取得に適用されます。正確な共登録に続いて、データセットは多変量共解析のために統合され(図4)、高度な計算ツールによる包括的な空間メタボロミクスが可能になります。

1. サンプル調製

  1. 組織サンプルの調製
    1. マウス組織の収集
      1. C57BL/6Jマウス(20週齢、40g)を特定の病原体フリー(SPF)条件下でハウスし、12時間の明暗サイクルに維持し、実験前に最適な健康状態を確保するために、食物と水への自由なアクセスを提供します。
      2. 深い麻酔を確保するために、50 mg / kg体重の用量でペントバルビタールナトリウムを腹腔内注射することによりマウスを麻酔します。灌流を続行する前に、動物を監視し、ペダル反射と角膜反射がないことを確認してください。
      3. ヘパリンを含む約20〜30 mLの冷たいPBS(5 IU / mL)を150 mmHgの制御された圧力で左心室に6分間灌流し、血液を洗い流し、除去する前に臓器を放血します。
      4. 収集したすべての組織をすぐに液体窒素で急冷し、さらなる分析のために-80°Cで保存します。
        注:組織の形態を歪める可能性のある氷の結晶形成を防ぐためには、急速凍結が不可欠です。
    2. 組織包埋と凍結切片
      1. ミクロトームを-20°Cに設定し、チャンバーとブレードをエタノール(EtOH)で除染して、残留包埋培地を除去します。CaF2 スライド、スライドメーラー、検体ホルダー、および組織サンプルをクライオスタット内で平衡化させます。
      2. 組織を約5mm×5mm×3mmにトリミングします。-20 °Cの標準クライオモールド内の10%ゼラチンに包込み、セクショニングの適切な方向を確保します。埋め込まれたサンプルをドライアイス上でスナップフリーズし、凍結切片まで-80°Cで保存します。
      3. 型から組織を抽出し、余分な材料をトリミングして切片を最適化し、超純水を使用して検体ホルダーに貼り付けて安定した接着を確保します。
      4. 厚さ10μmの切片を切断し、その切片をプレコートされたCaF2 基質に固定化し、-80°Cで保存します。
      5. 中赤外線イメージングの前に、取り付けられた組織切片を真空凍結乾燥機に入れます。チャンバー圧力を0.1mPa、温度を-100°Cに設定します。 サンプルを30分間乾燥させます。
  2. 細胞サンプル前処理
    1. 1.25×105 HeLa細胞を、標準培養プレートに配置された直径13 mmの円形CaF2 基質に播種します。10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した高グルコースダルベッコの修正イーグル培地(DMEM)を使用してください。標準培養条件(37°C、5%CO2)で細胞を24時間インキュベートします。
    2. 24時間後、培地を慎重に取り除き、PBSバッファーに溶解した4%パラホルムアルデヒド(PFA)で室温(RT)で20分間インキュベートして細胞を固定します。
    3. 固定細胞をHBSSバッファーで3回すすぎ、次にddH2Oでさらに3回洗浄します。
    4. MIRイメージングに進む前に、CaF2 基質をRTで完全に自然乾燥させます。

2. マルチモーダル画像取得

  1. 量子カスケードレーザー(QCL)MIR画像取得
    1. 非N2液冷マイクロボロメーター520 × 480焦点面アレイ(FPA)検出器と空間コヒーレンス低減技術を搭載したQCL-MIR顕微鏡を使用して、QCL MIRイメージング顕微鏡を実行します。
    2. スペクトル範囲は950 cm-1 から1800 cm-1まで選択できます。
    3. 開口数(NA)が0.6の4×対物レンズを使用すると、公称ピクセルサイズは4.25μmになります。
    4. クリーンなCaF2 基板上のバックグラウンドスペクトルを4 cm-1 のスペクトル分解能で収集します。
    5. 組織形態に基づいて取得領域を選択し、4 cm-1のスペクトル分解能でスペクトルデータを収集します。このスペクトル分解能では、画像取得速度は約0.3mm2/sです。
      注意: すべての測定は、手動フォーカス調整を備えたCaF2 スライドを使用して送信モードで実行されます。
  2. 質量分析画像取得
    1. マトリックスアプリケーション
      1. MIR後の組織切片をMALDI-MSIに使用し、Tippexペンを使用して組織の周囲に基準マーカーを適用し、画像登録のためにフラットベッドスキャナーでMSI前の光学画像をキャプチャします。
      2. メタノール/アセトニトリル/脱イオン水(V/V/V=75:25:5)で7 mg/mLのNEDCマトリックスを調製し、0.2 μmの膜でろ過して微粒子を除去します。
      3. マークされた組織スライドを自動マトリックス噴霧器にロードします。事前定義されたパラメーターを使用して、NEDCマトリックスをサンプルに分注します。
    2. MALDI-MSI測定
      1. 0.2 μL の赤リン懸濁液を CaF2 スライドに堆積させ、外部質量校正標準として使用します。
      2. マトリックスコーティングされたスライドをスライドアダプターに固定し、ホルダーとの最適な電気的接触を確保します。プレートをMALDI-MSIシステムにロードします。
      3. 基準マーカーを使用して、スライドの光学画像をMALDIステージのXYモーター座標に合わせます。組織分析のROIを定義し、「マトリックスのみ」の領域をネガティブコントロールとして含めます。
      4. 装置を20×〜20μm2のピクセルサイズで負イオンモードで構成し、50〜1000の m/z 範囲をカバーします。データ収集を開始する前に、赤リンスポットを使用して質量校正を実行します。商用データ分析プラットフォームを使用してデータ取得を実行します。

3. 画像データの前処理と解析

注: MATLAB カスタム コードは、 補足ファイル 1 としてアップロードされます。

  1. QCL-MIRデータの前処理と解析
    1. データの前処理
      1. ハイパースペクトルデータを適切な形式でエクスポートして、さらに分析します。
      2. CytoSpec と MATLAB を使用して、次の手順 3.1.1.3-3.1.1.8 に従ってデータの前処理を実行します。
      3. MIRスペクトルデータをCytoSpec v2.00.07にインポートして前処理します。
      4. CytoSpecに組み込まれている 品質テスト モジュールを使用して、スペクトル品質を評価します。 基準 2 (サンプルの厚さ) を選択して、サンプルの一貫性を評価します。 スペクトル積分範囲 を 950-1800 cm-1 に設定します。吸光度のしきい値を 50 から 1000 単位の間で定義して、過度に薄い領域または厚い領域からスペクトルを除外します。
      5. CytoSpecのPCAベースのフィルタリングを使用してノイズを低減します。最初の10の主成分(PC)を保持して、主要な生化学的差異を維持しながら高周波ノイズを除去します。
      6. MATLABでさらに解析するために、前処理されたスペクトルデータをCytoSpecから.mat形式でエクスポートします。
      7. 950-1800 cm-1 のスペクトル範囲にわたって輪ゴム補正アルゴリズムを使用して MATLAB でベースライン補正を実行し、ベースライン ドリフトを排除し、スペクトル精度を向上させます。
      8. 同じスペクトル範囲で最小-最大スケーリングを使用してスペクトル正規化を適用し、すべてのスペクトルにわたって強度を標準化し、データセット全体の比較可能性を確保します。
    2. データ分析
      1. 1,550 cm-1 および1,650 cm-1でタンパク質関連の特徴を同定し、それぞれアミドIIおよびアミドIバンドに対応します。1,740 cm-1で、エステルC=Oの伸張振動を表す脂質関連の特徴を特定します。
      2. アミドIバンド(1650 cm-1)とエステルC=Oストレッチ(1740 cm-1)の強度比を計算し、比マップを生成して、空間的な脂質とタンパク質の分布を視覚化します。
      3. 教師なしクラスター分析: ユークリッド距離とウォードの連鎖を使用してハイパースペクトル データに対して階層的クラスタリング分析 (HCA) を実行し、スペクトルの類似性に基づいて領域を分類します。クラスターマップを生成して、生化学的に異なる領域を特定し、構造的または病理学的な違いを明らかにします。
  2. MSIデータの前処理と分析
    1. 生のMSIデータを商用データ分析プラットフォームにインポートします。
    2. 相対強度>0.01%でピークピッキングを実行します。
    3. マトリックス由来のピークを、マトリックスのみのコントロール領域から得られたスペクトルと比較して、実験ピークリストから除外します。制御スペクトルに現れ、信号対雑音比(SNR)が3未満のピークをすべて除去します。
    4. データセットを二乗平均平方根(RMS)に正規化して、ピクセルとサンプル間のイオン信号強度の変動を考慮します。
    5. 組織分布に基づいて特徴をフィルタリングし、ヒトメタボロームデータベース(HMDB)のエントリと照合し、理論上のm/z値と一致させることで、代謝物の同定を絞り込みます。
    6. 実験目標と組織の状況に基づいて、関連する代謝産物を選択します。
    7. すべてのピクセルについて選択した特徴の強度を CSV ファイルとしてエクスポートします。
    8. 次元削減技術 (PCA、t-SNE、UMAP など) を適用して、データの複雑さを軽減し、Seurat や Banksy などのバイオインフォマティクス ツールを使用して同様の代謝シグネチャを持つピクセルのクラスターを識別し、空間代謝の不均一性の視覚化を容易にします。

4. マルチモーダル画像の共登録と共解析

  1. 1650 cm-1 で取得したMIR画像を、共登録の空間基準として選択します。この特定の波数はアミド I タンパク質バンドを強調し、組織の強いコントラストを提供します。
  2. MIR 画像と MSI 画像の両方の強度値を正規化して、視覚的な比較可能性を高めます。MATLAB で histeq 関数を使用したヒストグラム均等化などのコントラスト強調技術を適用して、画像強度を再配分し、ランドマークの選択に重要な構造的特徴の視認性を向上させます。
  3. Image Processing Toolbox の関数 cpselect を使用して、MIR 画像と MSI 画像の両方を MATLAB に読み込みます。この機能は、ランドマーク選択のための対話型インターフェイスを開きます。
  4. cpselect機能を使用して、MIR画像とMSI画像の両方に解剖学的に関連性があり、適切に分布した制御点を5〜10個手動で注釈付けします。これらのランドマークは、組織境界などの明確な形態学的特徴に対応する必要があります。
    メモ: 局所的な歪みを最小限に抑えるために、コントロールポイントを画像フィールド全体に均等に分散します。
  5. 両方の画像から注釈付きの制御点の座標をエクスポートして記録します。変換計算のために 2 つの一致する配列 (移動点や固定点など) として格納します。
  6. アフィンモードで MATLAB 関数 fitgeotrans を使用してアフィン変換行列を計算します。この変換では、スケーリング、回転、移動、およびせん断が考慮されます。
  7. MATLAB の関数 imwarp を使用して、計算された変換を MSI 画像に適用します。このステップでは、MIR 参照フレームに幾何学的に整列された空間的に登録された MSI 画像が生成されます。
  8. ブレンドモードでimshowpair関数を使用してアライメントを目視検査し、MSI画像とMIR画像をオーバーレイし、構造的特徴の正しいレジストレーションを確認します。
  9. MATLABの imbinarize 関数を使用して、登録したMSI画像と参照MIR画像の両方をバイナリマスクに変換します。
  10. サイコロ類似係数 (DSC) を計算して、2 つのバイナリ マスク間の空間的重複を定量化します。DSC は次のように定義されます: DSC = 2 × (オーバーラップの面積)/(両方のマスクの合計面積)。DSC値が1.0に近づくと、空間的オーバーラップとレジストレーション精度が高いことを示します。
    メモ: 必要に応じて、制御点の数または配置を調整し、変換プロセスを繰り返して、登録を絞り込みます。局所的なミスアライメントが続く場合は、非剛性レジストレーション方法を検討してください。
  11. 登録した画像、変換パラメーター、およびランドマーク座標を保存して、生化学的および構造的特徴の空間相関などの下流のマルチモーダル画像解析を行います。

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結果

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上記のマルチモーダル空間メタボロミクス戦略を検証するために、がんのマウスモデルに実装しました。腫瘍細胞は緑色蛍光タンパク質 (GFP) を発現するように遺伝子組み換えされ、蛍光イメージングによる腫瘍領域の正確な位置特定が可能になりました。図2Aは、「指紋領域」として知られる950〜1800 cm-1のスペクトルカバレッジを持つラベルフリーのQCL-MIRイメージング結果を示しています。P=Oストレッチ(1240 cm-1、核酸およびリン酸脂質)、アミドII(1550 cm-1、タンパク質)、アミドI(1650 cm-1、タンパク質)、エステルC=Oストレッチ(1740 cm-1、グリセロ脂質)など、代表的なMIRバンドが図2Aにマークされています。

GFP蛍光シグナルは、腫瘍領域の空間的対応を評価するための内部参照として機能しました(

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、MSIとMIRイメージングを統合して、同じ検体でハイスループットで分子特異的な代謝プロファイリングを可能にするマルチモーダル空間メタボロミクス戦略を紹介します。MIRイメージングは、分子振動に基づくラベルフリーの非破壊化学マッピングを可能にし、詳細な構造基および官能基情報を提供します。対照的に、MSI は代謝物の同定と定量に高い感度と特異性を提供し、メタボロミクス研究の基礎としての地位を確立しています。これら 2 つのモダリティを統合することで、MIR イメージングの化学的特異性と MSI の分子精度の補完的な強みを活用して、代謝の不均一性をより包括的に理解できます。

提案されたマルチモーダルプラットフォームの主な利点は、ターゲットMSI取得のために空間的に分解された関心領域(ROI)の識別を実行できることです。ハイスループットMIRイメージングは、ROIの選択を導くための迅速でラベルフリーの非侵襲的なモダリティとして機能します21。空間的ミスアライメントを...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MALDI2-MSIイメージングに関するサポートを提供してくれたWestlake UniversityのYilong Zou博士と、QCLベースのMIRイメージングに関する支援を提供してくれたBruker Scientific Technology Co., Ltd.上海オフィスに感謝します。また、KrasLSL-G12D/+ Tp53fl/fl Rb1fl/fl ZsgreenLSL マウスを提供してくださった華中科技大学の Shuguo Sun 博士にも感謝します。この研究は、非感染性慢性疾患-国家科学技術専攻プログラム(2023ZD0500400 to L.S.、G.W.、D.Y.)、中国国家自然科学基金(No.22377016 to L.S.)、復旦大学および曹峨江基礎研究基金(No. 24FCA08 to L.S.)からの助成金によって支援されています。また、復旦大学上海医科大学の中核施設にも感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4%パラホルムアルデヒド、組織固定液SangonBiotech E672002
シ血清アルブミンSigma Aldrich126615
C57BL/6JNifdc マウスCharles River219
CaF2 スライドCrystranCAFP25-1
クライオスタットミクロトームDakewe BiotechCT520
CytospecPeter Laschバージョン 2.10.01ベースライン補正、正規化、画像生成、ハイパースペクトル解析など、MIRデータ解析用のソフトウェア。
DPBSバッファーフィッシャーサイエンティフィック 14-190-250
ウシ胎児血清Gibco10270106
凍結乾燥機LABCONCOFreeZone
ゼラチン Sigma-AldrichG1890タイプ A、ブタの皮膚
HBSS 緩衝液Sangon Biotech  由来。A003210
高グルコースDMEMThermoFisher Scientific 10564011
ライン補正、正規化、画像生成、ハイパースペクトル分析などの MIR データ分析用のMatlabMathWorksMatlab R2024a
マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析イメージング (MALDI-MSI) システムBruker Daltonics GmbH timsTOF fleX MALDI-2
メタノールシノファーム化学試薬10014108
mMass昆虫学研究所、チェコ科学アカデミー生物学センター、チェコ共和国バージョン5.5.0MSI データ分析用ソフトウェア。生のMSIデータをSCILS Labにインポートして前処理します。相対強度 0.01% の mMass >ピークピッキングを実行します。
N-(1-ナフチル)エチレンジアミン二塩酸塩(NEDC)マトリックス シグマ アルドリッチ222488
ペニシリン - ストレプトマイシンサーモフィッシャー サイエンティフィック 15140122
量子カスケードレーザー 中赤外(QCL-MIR)顕微鏡nbsp;Bruker Optics GmbHLUMOS II ILIM
赤リンSigma-Aldrich8.0727
SCiLS LabBruker DaltonicsSCiLS Lab 2024bMSI データ分析用ソフトウェア。生のMSIデータをSCILS Labにインポートして前処理します。相対強度 0.01% の mMass >ピークピッキングを実行します。
噴霧器HTX TechnologiesTM
トリプシン、0.25% EDTAThermoFisher Scientific C25200072
ウベース ソフトウェア。&

参考文献

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