方法論記事

キメラ抗原受容体細胞外小胞 (CAR-EV) 技術の強化: がん治療の未来

DOI：

10.3791/68726

⸱

2025年9月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1INOVIQ Ltd., 2Centre for Clinical Research, Faculty of Medicine, The University of Queensland

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞外小胞 (EV) の治療応用は、がん治療と薬物送達に革命をもたらす可能性を秘めています。イオン交換クロマトグラフィーを使用して単離されたキメラ抗原受容体 (CAR) 細胞由来 EV (CAR-EV) は、カーゴ容量の増加を示し、その機能的有効性を大幅に高めます。この研究は、CAR-EVをさらに特徴付けて、その生物学的活性と治療の可能性を解明します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CAR 細胞療法は、いくつかの血液悪性腫瘍に対する個別化治療を大幅に進歩させました。現在、リンパ腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病の治療薬として、食品医薬品局(FDA)から7種類、欧州医薬品庁(EMA)から6種類が承認されています。サイトカイン放出症候群 (CRS) と免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群 (ICANS) が最も重要であるなど、いくつかの課題と限界が残っています。CAR-EV などの無細胞療法は、細胞療法に比べて実質的な利点をもたらします。これらには、腫瘍浸潤の強化と、CRS、ICANS、およびその他の有害な副作用のリスクを最小限に抑えながらの再投与の可能性が含まれます。さらに、CAR-EV の効力は、細胞毒性物質と機能修飾リボ核酸 (RNA) の組み込みを設計することによって調整できます。ここでは、チューナブルCAR-EVを製造するためのスケーラブルなCAR-EVプラットフォームの開発について報告します。このプラットフォームには、EV生産細胞(CAR-TおよびCARナチュラルキラー(CAR-NK)細胞など)のエンジニアリングとプレコンディショニング、適正製造基準(GMP)グレードのイオン交換クロマトグラフィー(IEX)プラットフォームを使用したCAR-EVの単離と濃縮、完全自動化されたハイスループットEV亜集団分析、およびin vitroが含まれますCAR-EVの機能的細胞毒性活性の評価。このプラットフォームは、血液腫瘍細胞株と固形腫瘍細胞株の両方に対して、CAR-NK-EVおよびCAR-T-EVを使用して検証されています。CAR-EVプラットフォームは、特定の疾患適応症に合わせた既製の治療用CAR-EVを迅速に開発するための有望なアプローチであり、CAR細胞ベースの治療に関連する有害な副作用を軽減する可能性を秘めています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CAR 細胞ベースの治療法は血液悪性腫瘍の治療に承認されていますが、重大な課題と限界が依然として残っています1.特に、CRS と ICANS のリスクは、CAR 療法に対する患者の適合性を評価する際の重要な要素であり、治療戦略の継続的な進歩の必要性が強調されています2。

CAR 細胞由来の EV (CAR-EV) は、より効果的で潜在的に安全な同種治療選択肢として浮上しています。このような EV には、免疫原性の低下、CRS のリスクの低下、腫瘍浸潤の強化、反復投与への適合性、併用療法の可能性、効率的な生産および保管プロセスなど、いくつかの利点があります3。生物学的に由来するEVは、がん細胞上の特定の表面受容体に高い親和性で結合するがん標的分子を発現するように操作できます。これらの設計用EVは、いったん改造されると、治療用貨物を選択的に送達するための有望な戦略を提示し、オフターゲット効果を最小限に抑える可能性を秘めている。CAR 細胞に由来するこれらの武器化された EV は、より正確で強力な治療送達を可能にする強化された機能特性を示します。それらの固有の機能は、総合的に治療効果の向上に貢献する複数の利点をもたらします。

臨床でEVを効果的に使用するための2つの主なハードルは、規模と有効性です。本明細書に示されている方法論は、固有の拡張性を示し、幅広い実験パラダイムに容易に適応できます。EV生産を臨床グレードの製造に拡大することは活発に開発されている分野ですが、十分な量の臨床グレードの材料を生成するにはさらなる最適化が必要です4。重要なことに、最近の研究では、インターロイキン(IL-7、IL-15、IL-21など)で親細胞をプレコンディショニングしたり、低酸素(1〜2%O2)条件下でEVを生成するなど、EVの有効性を改善するための有望なアプローチが実証されています5,6,7。

この研究の目的は、MCF-7 乳がん細胞と K562 骨髄性白血病細胞を使用して、上皮成長因子受容体 (EGFR) およびヒト上皮成長因子受容体 2 (HER2) を標的とする CAR EV の治療可能性を in vitro で調査することでした。EVは、IEX を介して CAR細胞条件付け培地(CM)から単離および濃縮され、ナノ粒子追跡とウェスタンブロット分析を使用して特徴付けられ、機能アッセイにかけられました。内因性細胞傷害性カーゴを含むCAR EVは、 in vitroで 効果的に細胞死を誘導しました。得られたデータは、治療用途向けのスケーラブルな標的EV生産の実現可能性を確立します。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注:適切なPPE(手袋、実験用ガウンなど)を使用して、認定されたバイオセーフティレベル2(BSL-2)キャビネット内のすべての生細胞を取り扱います。生細胞を含む細胞ペレットなどのバイオハザード物質は、最終的な10%次亜塩素酸ナトリウム(漂白剤)溶液を使用して除染する必要があります。

1. 細胞培養とCM採取

  1. CAR細胞の培養
    注:この研究で使用されたレンチウイルス形質導入CAR細胞はアウトソーシングされていますが、プロトコルは、標準的な細胞工学技術 を介して 社内で生成されたCAR-T / NK細胞に適用できます。
    1. CAR NK / T細胞を、37°C(5%CO2、21%O2)の加湿チャンバーで、0.5-1 x 10 6 / mLの密度で、0.5-1 x 106 / mLの密度でCAR NK / T細胞を維持します。継代容量の制約により、2〜3日ごとにモニタリングし、細胞数を週3回に制限します。
    2. 顕微鏡 で CAR発現を確認し、細胞が蛍光であることを確認します(適切にタグ付けされている場合)。健康な塊の細胞は、堅牢なCAR細胞培養を示しています。
  2. CMコレクション
    1. 細胞培養が80%のコンフルエンスに達したら、細胞生存率を評価し、トリパンブルー自動細胞計数分析 を介して 生細胞密度を測定します。
    2. 細胞を300× g (室温)で5分間遠心分離してペレットを形成します。
    3. 上清を注意深く回収し、3,000 × g で 4 °C で 10 分間遠心分離して清澄化します。
    4. EV濃縮の準備が整うまで、清澄化されたCMを-80°Cで保存します。

2. EVの分離と濃縮

注:以下の方法は、細胞外小胞(EV)濃縮のための2つのアプローチの概要を示しています:機能 的in vitro 分析のためのEV単離用に開発されたIEX法と、下流の特性評価研究用に最適化されたパンエクソソームキャプチャハイスループット法。

  1. IEX による 機能的なCAR EVの充実
    注:すべての体積仕様は、クロマトグラフィーカラム内の試薬容量と樹脂床容量の比例関係を反映して、カラム容量(CV)で表されます。
    1. IEXカラム(使用するカラムの詳細については 、材料表 を参照)を室温(RT)に戻し、使用前に15分間放置します。10 CVの再生バッファーを加え、続いて10 CVの等張平衡バッファー(pH 7.4)を使用して平衡化します(バッファーの詳細については、 材料表 を参照)。
      注:カラムを長時間乾燥させないでください。柱は常に直立させてください。
    2. CMを解凍し、0.22μmのポリエーテルスルホン(PES)フィルターを通過させます。
    3. サンプルを平衡化カラム(最大31.2 CV)に加え、続いて10 CVの等張洗浄バッファー(pH 7.4)を加えます。2.5 CVの高張溶出バッファー( 材料表を参照)を加え、これがEV溶出液サンプルであるため、フロースルーを収集します。
    4. 市販の限外ろ過遠心フィルター(30 kDaカットオフ)と希釈剤として等張溶液を使用してEV溶出液のバッファー交換を行い、希釈係数を100倍にします。バッファー交換後の目標容量は、実験パラメータに合わせてユーザーが決定できます。
    5. 0.22 μmフィルターを使用して最終ろ過ステップを実行し、濃縮されたEVを滅菌して in vitro 機能アッセイを行います。
    6. ナノ粒子追跡分析(NTA)8,9を使用して、CAR-EVのサイズ分布、濃度、および収量を決定します。
  2. 限られたサンプルまたは大規模なサンプル10,11の特性評価のためのハイスループットパンエクソソームEV単離(室温(RT)で実行される自動精製システムを介して)。
    1. ウェルあたり1 mLの1x PBSを含む3つの96ディープウェル(DW)プレートを調製します。
    2. 各ウェルに35 μLの1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)バッファーを加えて、「溶出」プレートを作成します。
    3. ウェルあたり1 mLのCMサンプルと30 μLのEXO-NETパンエクソソームキャプチャービーズを含む「結合」プレートを調製します。
    4. 自動隔離システムで次の設定を行います。
      1. ステップ 1: ピックアップ ヒント: 分離プロトコルが、装置が 96 深ウェルのチップ コームをかみ合わせることから開始され、分離プロセス全体を通じて磁気ビーズ操作が可能になることを確認します。
      2. ステップ2:CMサンプルと磁気ビーズを30分間連続低速条件下で混合し、EVを磁性粒子に効率的に捕捉できるようにします。混合後、磁気ビーズを確実に捕捉するために、それぞれ30秒の5サイクルが含まれます。
      3. ステップ3:3つの洗浄ステップのそれぞれが、結合したEVの完全性を維持しながら、非特異的に結合した汚染物質を除去するために、30秒の穏やかな低速混合を使用していることを確認します。前と同様に、このステップは、磁気ビーズを捕捉するために、それぞれ30秒の5サイクルで終了します。
      4. ステップ 4: EV タンパク質溶出 (溶解): 結合した EV が 2 段階プロセスを通じてタンパク質回収のために溶解されるようにします。30秒間の初期混合(ボトムミキシング)は、チップ位置をウェルの上に保持して、一時停止状態で7分間30秒間インキュベーションする前に実行されます。時間が経過すると、2番目の30秒の混合とさらに7分30秒の一時停止があります。最後に、それぞれ30秒の5サイクルが組み込まれます。
      5. ステップ5:この時点で、タンパク質含有量がバッファー内にあり、ビーズが先端に付着していることを確認します。溶出ステップに続いて、使用済みのチップコームを廃棄し、プロトコルを完了します。
        注:EXO-NETパンエクソソームキャプチャービーズには、0.05%(w/w)の防腐剤溶液が含まれています。労働安全衛生局 (OSHA) の規制では危険物として分類されていませんが、取り扱いの際には、特に生体液に関しては、適切な個人用保護具 (PPE) を使用する必要があります。

3. ウェスタンブロッティング による EVの特性評価

注:CAR-EVは、対照としての細胞と比較して、ウェスタンブロット(グランザイムBおよびカルネキシン)によって特徴付けられました。

  1. 106 細胞あたり10 μLの1x放射免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファー(プロテアーゼ阻害剤を含む)を添加することにより、細胞溶解物を調製×。氷上で30分間インキュベートし、14,000 × g(4°C)で15分間遠心分離して細胞破片を除去します。EVは、同じバッファーまたは1%SDSを使用して溶解できます。
  2. ビシンコニン酸(BCA)アッセイ(または適切なナノ分光光度計)を使用してタンパク質量を定量します。
  3. 4〜12%SDS-ポリアクリルアミドゲルを、メーカーのプロトコルに従って電気泳動装置で組み立てます。Laemmliのバッファーを使用してタンパク質ライセートを調製します。
    注意: ゲルシステムはブランドによって異なる場合があります
  4. 各ウェルに5 μgのサンプルをロードし、ゲルを200 Vで20分間実行します。
  5. ポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンを使用してウェスタン転写を実行し、その後、0.1%トゥイーン20(1x TBST)を含む1xトリス緩衝生理食塩水で5%ウシ血清アルブミン(BSA)でブロットをブロックします。
  6. ブロットを一次モノクローナル抗体(グランザイムBおよびカルネキシン、1x TBSTの5%BSA溶液中で500分の1希釈液)でインキュベートし、停滞させ(振とうことなく)、4°Cで一晩インキュベートします。
  7. 翌日、ブロットを10〜15 mLの1x TBSTでそれぞれ5分間洗浄してから、二次抗体でインキュベートします(種依存、1,000分の1希釈液で1x TBST中の5%BSA溶液中で1,000分の1希釈液をRTで1時間)。強化化学発光(ECL)を使用してバンドを検出し、荷電結合素子(CCD)デジタルカメラ を介して 画像をキャプチャします。

4. 機能アッセイ(MTS経由 )

注:細胞毒性は、in vitro MTS [(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム]アッセイによって評価され、細胞はテトラゾリウム化合物を可溶性の着色ホルマザン生成物に還元し、吸光度は490 nmで測定可能でした。MCF-7乳がん、およびK-562血液がん細胞は、CAR-EVの濃度(0〜500,000粒子/細胞)を増加させた3つの独立した実験で最大3日間処理されました。

  1. マルチチャンネルピペットを使用して、ウェルあたり5,000個のレシピエント細胞(50 μL/ウェル)を96ウェルプレートに播種します。ブランク培地用に1カラムを予約します(MTS試薬バックグラウンド減算用)。エッジウェルを避け、200 μLの滅菌水で満たしてください。
    注:接着細胞は、処理前にプレート表面への細胞の付着を確実にするために、前日にプレーティングする必要があります。
  2. EVを増やして追加します(例: 2.5 x 105 および4.5 x 105、またはセルあたり0.5、0.75、および100万EV)。コントロールを含めます:「EVなし」、1x PBS「EVバッファー」、および陽性の細胞キルコントロール(例:標的特異的小分子阻害剤または0.1%TX-100)。
  3. 37°C(5%CO2、21%O2)の加湿チャンバーで細胞を2〜3日間インキュベートします。
  4. 指定された治療時点で、顕微鏡 で 細胞を調べます。MTS試薬を追加します(ウェルあたり100 μL培養ごとに20 μL)。1〜4時間インキュベートし、490 nmのプレートリーダーを使用して吸光度を1時間ごとに測定します。
  5. データ分析のためにブランク媒体吸光度の読み取り値を差し引きます。2 グループ比較にはスチューデントの t 検定、または 3 つ以上のグループには多重比較を使用した一元配置分散分析を使用して統計量を計算します。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CAR T/NK細胞培養とそれに続くEVの単離、特性評価、および機能アッセイにおけるEVの利用の典型的なワークフローを 図1に示します。CAR T/NK細胞の培養からのCMは、EV濃縮および下流の特性評価(ナノ粒子追跡分析を含む)およびマルチウェルプレートMTSアッセイ を介して 機能活性を評価する前に収集されます(図1)。

GFPタグ付きCAR細胞は、顕微鏡 で 視覚化し、培養中のCARコンストラクトの発現を確認できます。顕微鏡検査は、十分な形質導入効率を確保するために、CMの収集前および収集中に日常的なステップとして実行する必要があります。効率を評価する際には、潜在的な自家蛍光を捕捉するために、明視野チャネルとGFPチャネルをオーバーレイすることが重要です。注目すべきは、T細胞は自然に凝集する傾向があり(NK細胞でも同様に観察、データは示していません)、細胞が凝集した表現型を示すと蛍光がはっきりと観察できます(図2)。

EV 濃縮後、EV は NTA とウェスタン イムノブロッティング によって 特徴付けることができます。NTAを使用して、粒子収量の分析により、CMと比較して、単離されたEVの濃度の増加を確認できます(図3A)。ウェスタンブロットデータは、CAR細胞およびEVにおける細胞溶解マーカーグランザイムBの発現、および後者におけるカルネキシンの欠如をさらに確認し、調製物に細胞物質が存在しないことを確認しています。HEK293T細胞はCAR陰性対照として含まれます(図3B)。

EV 機能の分析は、細胞生存率/増殖能力を決定するために MTS アッセイ を介して 実行されました。MCF-7 乳がんおよび K562 血液がん細胞の生存率と増殖に対する EGFR および HER2 標的 CAR-EV の効果は、490 nm の吸光度 (バックグラウンド信号の除去後) での比色 MTS 試薬の測定によって決定されます。この例では、CAR-EVを標的とするEGFRは、MCF-7とK562の細胞生存率をそれぞれ70%と40%低下させました。CAR-EVを標的とするHER-2は、MCF-7を~10%減少させました(スチューデントのt検定 によって 決定されました)。実験レイアウトを考慮すると、ノンパラメトリック検定(マンホイット ニーUなど)を採用すると、その後の研究でより堅牢な洞察が得られる可能性があります(図4)。

figure-results-1
図1:CAR-EVの生成、エンリッチメント、EV特性評価、および機能読み出し。 機能解析前のEVの生成、製造、および濃縮CAR-EVサンプルの特性評価の典型的なワークフローを示す概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:HER2を標的とするCAR-T細胞におけるGFP発現の確認による代表的な顕微鏡分析。 画像は、20倍の対物レンズを使用して、蛍光顕微鏡 で 撮影されました。白いスケールバーは50μmの長さを表します。T細胞は、単一細胞に剥離する前に塊状に増殖する自然な傾向があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:CAR細胞とEVの特性評価。 (A)CAR-T CMおよび濃縮EVのナノトラッキング粒子分析。EVの粒子濃度はCMの1.6〜2.1倍であり、タンパク質濃度は>80%減少しました。統計的に有意な差は、一元配置分散分析と Tukey の多重比較検定でテストされました。 p≤ 0.001、**** p≤ 0.0001。(B)形質導入されたT細胞と濃縮されたCAR-EVのウェスタンブロット分析により、CAR細胞とEVの両方に細胞溶解性グランザイムBの存在が確認されましたが、HEK293T非CAR細胞では欠如が認められました。カルネキシンはCAR-EVでは検出されず、小胞体粒子による汚染が少ないことが示されました。レーンあたりのタンパク質負荷 = 5 μg。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図4:標的細胞の生存率(MCF-7乳がん細胞およびK562慢性骨髄性白血病細胞株)に対するCAR-EVの効果。 標的細胞は、4.5 x 105 および2.5 x 105 EVs/細胞(それぞれEGFRまたはHER2 CARS)または対照(EVバッファー)の単回投与で最大3日間処理されました。(A)EGFRを標的とするCAR-EV細胞。(B)HER2を標的とするCAR-EV。両方の細胞株で吸光度測定値の低下(治療効果を示す)が観察されました。データは、SD (n = 3) ±平均吸光度を表し、両側対応のないスチューデントの t 検定を使用して分析され、 p 値は統計的有意性を示します。** p≤ 0.01。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

乳がんおよび肺がんを標的とした研究で実証されているように、CAR 療法の実証済みの有効性と細胞外小胞 (EV) ベースの治療の有望な利点を組み合わせることで、がん治療の有効性が向上する可能性があります12,13。CAR-EV 治療アプローチは、EV の生体適合性と標的化能力を活用しながら、送達の課題や関連する毒性など、CAR 療法の現在の限界に対処します。これらのモダリティを統合することで、がんに対する新しい治療戦略の開発が促進され、臨床現場での EV の応用機会が拡大する可能性があります。さらに、機能的EVのエンジニアリングと濃縮は、特に腫瘍コア、骨髄、および血液脳や血液精巣バリアなどのバリアによって保護された領域などの困難な場所に治療カーゴを送達するためのより安全な(細胞溶解性カーゴのカプセル化を介して)より正確な方法(すなわち、ターゲティングドメインの追加)を提供します14,15,16.超遠心分離を使用したEV濃縮の確立された方法にもかかわらず、いくつかの制限が残っています。注目すべき制約には、拡張性、不純物の共分離、および生産後の収率の制限が含まれます17。治療用EVを大規模に生成するためのプロセスの改善が明らかに必要とされています。

この概念実証研究は、IEXが、CAR発現細胞からの明確化されたCMを入力として使用して、機能的なCAR-EVを生産、単離、濃縮するためのスケーラブルで効果的な方法であることを示しています。IEXはハイスループット処理を可能にし、研究とcGMP規模の生産の両方をサポートし、EVの生成から最終的な医薬品試験までのワークフロー全体にわたる品質管理を可能にします18,19。EVの特性評価は機能を確認するために不可欠ですが、サンプル量、入力濃度、および表面電荷や結合特性などのEV固有の特性の違いにより、収率は大きく異なる可能性があります。MCF-7細胞を使用した社内データによると、平均前精製収量は~2.85 × 108粒子/mLで、精製後の濃度は通常3 × 1011〜1012粒子/mLの範囲×です。これらのレベルは、バッファー交換中に再懸濁量を変更して下流のニーズに合わせて調整できます。このばらつきを考慮すると、再現性と堅牢な収量を確保するために、ユーザーは実験セットアップに関連するCMを使用してプロトコルを最適化することを強くお勧めします。

プロトコル内のいくつかのステップは、CAR-EVの製造を成功させるために重要であり、特にサンプルのローディングと溶出の段階に重点が置かれています。これらのステップは、カラムによるEV回収の効率に直接影響し、その結果、全体の収率にも影響します。過剰な溶質の除去が不完全であると EV の安定性が損なわれ、時間の経過とともに劣化する可能性があるため、バッファー交換ステップは非常に重要です。次に、NTA やプロテオミクス プロファイリングなどの方法を使用して EV を特徴付けることができます。CAR-EV が細胞取り込み研究や治療介入などの機能アッセイを目的としている場合、無菌性が最も重要です。最後の「最終」(0.22 μm)滅菌ステップは、実験結果を混乱させたり、バイオセーフティのリスクを引き起こしたりする可能性のある微生物汚染を防ぐために不可欠です。これらの要因を考慮すると、ユーザーは、最終的な EV 調製の再現性と機能的完全性を維持するために、これらのステップ中に特に注意を払うことを強くお勧めします。

CAR-EV の製造中に発生する一般的な問題に対処するには、いくつかのプロトコルの変更が必要になる場合があります。収率の低下は、カラムの結合能力を超えるか、または不足する、CMの負荷が最適ではないことが最も一般的に引き起こされます。最適な入力量を決定するには、CM 滴定研究を実施し、負荷を段階的に増やして最大 EV 回復点を特定することをお勧めします。フィルターの目詰まりは、通常、最終滅菌濾過ステップで観察され、多くの場合、過剰なサンプル濃度と粘度が原因で発生し、EV の凝集を促進する可能性があります。このような場合は、最終的なEV調製物を希釈することをお勧めします。希釈が不可能な場合は、バッファー交換の前に無菌ろ過を行うことができます。ただし、このアプローチでは、無菌性を維持するために、その後のすべてのステップを厳密な無菌条件下で行う必要があります。

がん治療薬としてのEVの開発には、再現性のある製造プロセスと、標的がん細胞株に対する有効性の確固たる検証が必要です。EV濃縮におけるIEXの一般的な制限は、非EV粒子の共分離であり、これはEV特異的マーカーの下流分析によって特定でき、さらなるCM最適化 によって 削減できる課題です。EVのコントロール放出特性評価には、粒子数とサイズを決定するためのNTA、および濃縮後のEV濃度を含める必要があります。CARコンストラクト発現の遺伝的および転写物の分析。CAR の細胞および EV タンパク質発現、標準 EV バイオマーカーおよび細胞溶解マーカー (グラン ザイム B およびパーフォリンなど) の決定。オンターゲット効果とオフターゲット効果。透過型電子顕微鏡 (TEM) などの追加技術を組み込むことで、サイズベースの特性評価を補完する形態学的検証が提供され、より包括的な分析がサポートされます。品質管理を維持するために、EV 製品はマイコプラズマおよびエンドトキシン汚染試験を受けて、無菌性と臨床生産への適合性を検証する必要があります。機能的な CAR-EV の長期保管に適した製剤を採用することで、質、量、治療効果の維持など、安定性を高める機会が得られる可能性があります。製品の完全性を確保するには、機能性能の一貫した評価が不可欠です。特に、この研究で利用された MTS アッセイは、代謝活性の測定 を通じて 細胞毒性の間接的な評価を提供します。将来の研究では、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)放出、アネキシンV/PI染色、カスパーゼ活性化プロファイリングなどの標準化された細胞毒性アッセイを統合して、細胞毒性効果をより正確に描写することで恩恵を受けるでしょう。さらに、CAR 細胞コンパレーター (調達の制限により現在の研究には組み込まれていません) を単独で、または CAR-EV と組み合わせて組み入れ、対照非がん細胞株の並行治療を含めることで、調査結果の解釈的価値が深まる可能性があります。

この研究は、特定のがんに対する実行可能な治療戦略としての EGFR/HER2 CAR EV の使用の可能性を強調しています。CAR EV の有効性を高めるには、細胞毒性を増強するために親 T 細胞を複数回投与または事前活性化することで達成できます。さらに、siRNAカーゴなどの新しいアプローチの進歩、およびEGFR / HER2結合能の改善は、これらの治療プラットフォームの設計を改良する機会をもたらします20,21。細胞治療における二重キメラ抗原受容体 (デュアル CAR) の有望な応用は、さらなる進歩の機会を提供します。治療における EV 対応物の利用によるデュアル CAR の使用を拡大することは、治療範囲を拡大し、治療法を強化する上で極めて重要なステップとなる可能性があります22,23。CAR EV駆動がん細胞の細胞毒性(カスパーゼ3/7活性化、インピーダンス読み取りなど)のリアルタイムモニタリングは、最適な投与計画を決定するための貴重な洞察を提供し、将来のin vivoアプリケーションへの合理化された翻訳を促進します。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Asari K、Chelvaretnam C、Mom KT、Bhuiyan S、Pham Q、Fitri A、Palma C、Shojaee M、Khanabdali R、Hinch L、およびRice Gは、INOVIQ Ltd.の従業員です。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、研究室への貢献に対して、Siena Barton、Hiba Rashid、Sara Nikseresht、Shayalini Wignarajah、Abel Sujeevに感謝したいと思います。著者らは、この研究が INOVIQ Ltd によって支援および資金提供された、内部および外部のすべての協力者に感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
<ストロング>素材
1x リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.4ギブコ10010049EVのエンリッチメント
1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)シグマL3771-100GSDSパウダー1gを超純水10mLに溶かす
1x トリス緩衝生理食塩水、Tween-20 (TBST)サーモサイエンティフィックケミカルズJ77500です。K2超純水で希釈して1x溶液を作る(または、0.1%ポリソルベート-20/トゥイーン-20溶液を1xトリス緩衝生理食塩水で調製する)
96ウェル透明平底ポリスチレンTC処理マイクロプレート、滅菌コーニング3595In vitro機能アッセイ
Bolt Bis-Tris Plus ミニプロテインゲル、4-12%、1.0 mm、WedgeWell フォーマットインビトロゲンセル/EVの特性評価
ウシ血清アルブミンシグマ・アルドリッチA9647-100Gセル/EVの特性評価
カルネキシン抗体細胞シグナル伝達2433秒セル/EVの特性評価
CAR-NK/T細胞プロマブバイオテクノロジーズ異なりますCAR細胞外リガンド結合ドメインは、レシピエント細胞上の好ましい標的に依存します
CellTiter 96 AQueous One Solution 細胞増殖アッセイ (MTS)プロメガG3580型In vitro機能アッセイ
cOmplete、ミニ、EDTAフリーのプロテアーゼ阻害剤カクテルロシュ11836170001細胞溶解
ECLウェスタンブロッティング検出試薬アマルサムRPN2232セル/EVの特性評価
溶出バッファーイノビックEVの濃縮/絶縁
平衡バッファーイノビックEVの濃縮/絶縁
EXO-ACE IEXカラムイノビック下流機能アッセイのためのEV濃縮/単離
特許ID AU2024901931
EXO-NETパンエクソソームキャプチャービーズイノビック下流特性評価のためのEV絶縁
特許ID WO/2014/011673
グランザイムB抗体細胞シグナル伝達4275セル/EVの特性評価
ヒトIL-2 IS、プレミアムグレードミルテニー・バイオテック130-097-744T/NK細胞の異種フリー培養
iBlot 2転写スタック、PVDFインビトロゲンセル/EVの特性評価
イムノカルト-XF(cGMP)幹細胞技術100-0956T/NK細胞の異種フリー培養
K-562型ATCCのCCL-243In vitro機能アッセイ
MCF-7ATCCのHTB-22In vitro機能アッセイ
Millex-GPシリンジフィルターユニット、0.22&マイクロ。mメルク・ミリポアSLGPR33RSターミナルフィルトレーション
再生バッファーイノビックEVの濃縮/絶縁
RIPAバッファ(10倍)細胞シグナル伝達技術9806細胞溶解
トリパンブルー溶液、0.4%ギブコ15250061細胞生存率と密度の評価
洗浄バッファーイノビックEVの濃縮/絶縁
Equipment
自動セルカウンターインビトロゲン伯爵夫人 II フロリダ州細胞生存率と密度の評価
卓上自動抽出装置インビトロゲンKingFisher Apexシステムハイスループット自動精製システム
プロトコルの詳細についてはリンクを参照してください:https://www.inoviq.com/site/technology/resources
蛍光顕微鏡ツァイスアクシオオブザーバー7細胞培養
ナノ粒子追跡分析(NTA)パーティクル・メトリックスGmbHゼータビュー PMX-130粒子分析
プレートリーダーBMGラボテックスペクトロスターナノIn vitro機能アッセイ
冷蔵卓上遠心分離機ベックマン・コールターアバンティ J-15R細胞培養&EV濃縮処理
SDS-PAGEミニゲルタンクインビトロゲンA25977セル/EVの特性評価
ウェスタンブロット転写システムインビトロゲンアイブロット2セル/EVの特性評価

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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