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方法論記事

段階的中胚葉誘導と3D自己組織化による胚性幹細胞からのヒト心臓オルガノイドの生成

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DOI:

10.3791/68738

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2025年10月7日

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1Basic Medicine Research Innovation Center for Cardiometabolic Diseases, Ministry of Education, Southwest Medical University, 2Nucleic Acid Medicine, Key Laboratory of Luzhou, Southwest Medical University, 3Department of Cardiology, The Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Southwest Medical University, 4Key Laboratory of Medical Electrophysiology, Ministry of Education, Southwest Medical University, 5Institute of Cardiovascular Research, Southwest Medical University

この記事について

サマリー

このプロトコルは、ヒト胚性幹細胞(hESC)から機能的なヒト心臓オルガノイドを生成するための段階的な方法を説明する。これには細胞の解凍、分化、成熟のステップが含まれており、心臓の発達と疾患モデリングのための堅牢なプラットフォームを提供します。

要約

ヒト胚性幹細胞(hESC)由来の心臓オルガノイドは、初期のヒト心臓の発達と機能の重要な側面を要約する多細胞三次元(3D)構造です。これらの自己組織化オルガノイドは、自発的な収縮性、心筋細胞マーカーの発現、および天然の心筋を彷彿とさせる組織様構造を示します。ここでは、段階的な系統分化を介してH9 hESC系統から心臓オルガノイドを生成するための堅牢で再現性のあるプロトコルを提示します。中胚葉誘導は、アクチビンA(50 ng / mL)、骨形成タンパク質4(BMP4、10 ng / mL)、線維芽細胞成長因子2(FGF2、30 ng / mL)、ラドゥビルシブ(CHIR99021、3 μM)、およびホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3K)阻害剤(LY294002、5 μM)でスフェロイドを36〜40時間処理することによって開始されます。心臓系統の仕様は、その後、BMP4(10 ng/mL)、FGF2(10 ng/mL)、Wnt経路阻害剤(XAV-939、5 μM)、およびレチノイン酸(0.5 μM)への4日間の毎日曝露によって指示されます。心筋細胞の分化と成熟は、BMP4 (10 ng/mL)、FGF2 (10 ng/mL)、およびインスリン (10 μg/mL) を使用して、5.5 日目以降さらに促進されます。機能検証は、タイムラプスイメージングと免疫蛍光分析によって達成され、心筋トロポニン T (cTnT) 発現によって特徴付けられる収縮性心筋細胞の生成を確認します。さらに、3D 免疫染色により α-SMA と CDH5 の存在が明らかになり、平滑筋および内皮様細胞集団の出現が示されます。これらの心臓オルガノイドは一貫してリズミカルな収縮を示します。ただし、電気機械的結合の直接的な電気生理学的検証は実行されませんでした。既知の制限には、オルガノイドを継代できないことや、拡張培養中の中心壊死の可能性が含まれます。要約すると、このモデルは、ヒトの心新生、薬物反応、先天性心疾患を研究するためのスケーラブルで生理学的に関連するプラットフォームを提供します。

概要

心血管疾患は依然として世界中の罹患率と死亡率の主な原因であり、ヒトの心臓の発達と機能を再現する信頼性の高い in vitro モデルの緊急の必要性が強調されています 1,2。心筋細胞の従来の2次元(2D)単層培養は、価値はありますが、ネイティブの人間の心臓の空間的複雑さ、多細胞相互作用、および電気機械的統合を再現することができません3,4。多能性幹細胞に由来する3D心臓オルガノイドは、これらの制限に対処する強力なプラットフォームとして登場し、初期の心臓形態形成と機能的成熟を模倣する自己組織化の多細胞構造を提供します in vitro5。

H9 系統などの hESC は、心筋細胞、内皮細胞、心臓線維芽細胞など、すべての体細胞型に分化する固有の能力を持っています6。制御された培養条件下では、hESCは、中胚葉誘導、心臓中胚葉の仕様、および心筋細胞分化の連続した段階を通じて導かれることができます5,7。この段階的なプロセスは、アクチビンA、BMP4、FGF2、PI3K阻害剤、CHIR99021、Wnt阻害剤、レチノイン酸5,8などの特定のシグナル伝達分子および阻害剤を使用して調節できます。胚性心臓発生の in vivo シグナル伝達環境を厳密に模倣することにより、これらの手がかりは in vitro で効率的で再現性のある心新生を促進します 5,7。

Matrigelなどの細胞外マトリックス(ECM)成分への包埋を必要とする多くのオルガノイドシステムとは異なり、心臓オルガノイドはマトリックスサポートなしで低接着状態で自己組織化できます5,9。懸濁液中の分化hESCの凝集は、分化の最初の1週間以内に自発的な鼓動を示す球形の3D構造を生成する10。これらのオルガノイドは、機能的に関連する心臓細胞集団を含み、サルコメア組織、カルシウム一過性、リズミカルな収縮などの特徴的な特徴を示し11,12、初期のヒト心臓組織の生理学的に関連するモデルを提供します。

hESC由来の心臓オルガノイドを生成する能力は、発生生物学、疾患モデリング、薬物スクリーニング、および心毒性試験のための刺激的な機会を提供します13,14。さらに、ゲノム編集技術および患者特異的人工多能性幹細胞 (iPSC) との統合により、遺伝性心疾患の個別化された疾患モデリングと治療法の探索が可能になります。

この記事では、ヒト胚性幹細胞から心臓オルガノイドを生成するための詳細な段階的なプロトコルを紹介し、分化の重要な段階、培養条件、および検証技術に焦点を当てます。このプラットフォームは、ヒトの心臓の発達を要約し、将来のトランスレーショナル研究の基盤を確立するための堅牢でスケーラブルなシステムを提供します。

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プロトコル

ヒト胚性幹細胞 (H9) を含むすべての手順は、施設のガイドラインに従って実施され、西南医科大学の生物医学倫理委員会によって承認され、承認 20241023-031 です。以下に詳述するすべての組織培養作業は、クラスII層流フードで行う必要があります。使用前に、培地と試薬が常に室温にあり、自然に平衡化されていることを確認してください。メディアを温めるためにウォーターバスを使用しないでください。

1. HESCの解凍と日常培養(H9)

  1. 培養プレートのビトロネクチンコーティング
    1. ビトロネクチンストックを氷上で解凍し、冷たいE8培地を使用して10μg/mLの作業濃度に希釈します。
    2. 希釈したビトロネクチン溶液をウェルあたり1 mLを6ウェルプレートに加えます。使用前に、プレートを37°C、5%CO2 インキュベーターで1〜4時間インキュベートします。
    3. 細胞を播種する前に、余分なビトロネクチンを吸引し、すすぎないでください。
      注:細胞培養インキュベーターでのインキュベーターは、コーティングの均一性を向上させ、細胞の付着を強化し、特に敏感なhESCにとって重要です。コーティング液を乾燥させないでください。このプロトコルは、hESCの解凍および拡張段階でのみビトロネクチンでコーティングされたプレートを使用して、定義された表面結合ECM代替物を提供します。心臓オルガノイドは、その後、ECMを必要とせずに、低接着懸濁条件下での自己凝集によって形成されます。
  2. 凍結保存されたHESC(H9)の解凍
    1. 少なくとも30〜60分前に、必要なすべての培地と試薬(E8培地、E8 + ROCK阻害剤、PBSなど)を室温まで自然に平衡化させます。
    2. 適切な個人用保護具を使用して、液体窒素貯蔵庫からH9ヒト胚性幹細胞の1つの凍結膜を回収します。すぐにクライオバイアルを37°Cのウォーターバスに浸します。バイアルをそっと回し、注意深く監視します。
    3. 小さな氷の結晶が残ったら(~90%解凍、~1〜2分)、すぐにバイアルをバイオセーフティキャビネットに移します。開封する前に、クライオビアンの外側を75%エタノールで消毒してください。
    4. クライオバイアルの内容物を、10 μM Y-27632(ROCK阻害剤)を添加した5 mLの室温E8培地を含む15 mLのコニカルチューブにゆっくりと滴下します。ワイドボアのピペットチップで上下にピペッティングして、穏やかに混合します。
    5. 室温で200× g で5分間遠心分離します。上清を慎重に吸引し、細胞ペレットを2 mLのE8 + Y-27632培地に再懸濁します。
    6. ビトロネクチンでコーティングされた6ウェルプレート(事前に調製済み)に、所望の播種密度(通常150,000〜200,000細胞/ウェル)で細胞をプレート化します。プレートをそっと揺らして細胞を均一に分散させ、37°C、5%CO2 インキュベーターに移します。
      注:ROCK阻害剤(Y-27632)の使用は、アノイキを予防し、生存をサポートするために、解凍後最初の24時間に重要です。
  3. 定期的なメンテナンスと継代
    1. ウェルあたり2 mLの新鮮なE8培地を使用して、培地を毎日交換します。
    2. 位相差顕微鏡で毎日監視します。細胞が~70〜80%のコンフルエンシーに達したとき、通常は3〜4日ごとに継代します。
      1. 継代するには:培地を吸引し、1 mLのDPBSで優しくすすいでください。
      2. 幹細胞解離試薬0.5mLを加え、室温で3〜5分間インキュベートします。プレートを軽くたたいてコロニーを取り除きます。
      3. 細胞懸濁液を回収し、10 μM Y-27632を含むE8培地中のビトロネクチンでコーティングされたばかりのウェルに1:3-1:4の分割比で再プレートします。24時間後、培地をROCKiなしのE8と交換します。
        注:最適な回収とその後の分化効率のために、HESCは2〜10細胞の小さなクラスターとして継代する必要があります。
        せん断応力を最小限に抑えるために、ワイドボアのチップの使用をお勧めします。混合には、5 mLのピペットチップまたは10 mLの血清学的ピペットを使用できます。

2. HESC(H9)の心臓系統への分化

  1. 中胚葉分化の誘導 (0-1.5 日目)
    注:解凍したばかりのHESC(H9)を心臓オルガノイドに直接分化させることは避けてください。最適な細胞生存率と健全な分化を確保するには、分化を開始する前に、まず細胞を継代し、少なくとも 1 回継代維持することが重要です。解凍直後に細胞を分化させると、細胞の健康状態が損なわれ、結果が悪くなる可能性があります。
    1. 導入前播種:hPS細胞が約70%のコンフルエントに達したら、適切な解離試薬を使用して細胞を小さなクラスターに穏やかに解離させます。10 μM ROCK阻害剤(Y-27632)を添加した2 mLのE8培地にクラスターを再懸濁します。
    2. 凝集:200 μLの細胞懸濁液(通常は12,000〜15,000細胞)を96ウェルの超低付着プレートの各ウェルに播種し、プレートを室温で200 × g で室温で3分間遠心分離して、各ウェルの底で細胞凝集を促進します。
    3. インキュベーション:プレートを37°C、5%CO2 インキュベーターに入れ、24時間培養して、コンパクトで均一な胚様体(EB)を形成できるようにします。
    4. 50%IMDM、50%F12栄養混合物、15 μg/mLのインスリン-トランスフェリン-セレン(ITS-G)、450 μMのモノチオグリセロール、および5 mg/mLのウシ血清アルブミン画分Vを組み合わせて、基礎培養培地(BC-M)を調製します。
    5. BC-MにアクチビンA(50 ng / mL)、BMP4(10 ng / mL)、CHIR99021(3 μM)、FGF2(30 ng / mL)、およびLY294002(5 μM)を補給してMD-Mを調製します。
    6. 中胚葉誘導:24時間の凝集後、MD-Mで36時間EBを誘導します。
      注:心臓オルガノイドの誘導効率と一貫性を確保するために、H9 hESCの使用は解凍後3継代以内に厳密に制限されました。この戦略は、高い微分効率と全体的な実験信頼性を維持するために重要です。
      形成された骨材の完全性を維持するには、媒体交換中の穏やかな取り扱いが重要です。EBの球状形態を乱さないようにしてください。
  2. 心臓中胚葉分化の誘導(1.5-5.5日目)
    注:Wntシグナル伝達阻害剤(XAV-939)は、後中胚葉シグナルを抑制し、心臓系統の仕様を促進するために重要です。レチノイン酸は、前後パターニングにおいて用量に敏感な役割を果たします。過剰な RA は前腸の仕様につながる可能性があります。
    1. BC-M(ステップ2.1で詳述した組成)にBMP4(10 ng / mL)、FGF2(10 ng / mL)、レチノイン酸(0.5 μM)、およびXAV-939(5 μM)を補充して、心臓中胚葉分化培地(CMD-M)を調製します。
    2. 中胚葉導入の36〜40時間後、MD-Mを慎重に吸引し、毎日中程度の交換で4日間CMD-Mと交換します。
      注:機械的破壊やストレス誘発性アポトーシスを避けるために、培地の変化中は凝集体を優しく扱ってください。
      この期間中、スフェロイドはよりコンパクトで組織化されます。心臓系統のコミットメントの初期兆候は、5日目までに明視野顕微鏡下で観察できます。
  3. 心臓オルガノイドの仕様(5.5-7.5日目)
    1. BC-M(ステップ2.1で詳述した組成物)にBMP4(10 ng / mL)、FGF2(10 ng / mL)、およびインスリン(10 mg / mL)を補充して、心臓オルガノイド仕様培地(COS-M)を調製します。
    2. 5.5日目に、CMD-Mを穏やかに吸引し、毎日中程度の交換で2日間COS-Mと交換します。
      注:BMP4とFGF2は、この段階で心臓前駆細胞の拡張を相乗的に促進し、非心臓の運命を抑制します。インスリンは、分化心筋細胞の代謝活動と構造発達をサポートします。
  4. 心臓オルガノイドの成熟
    注:移送中のスフェロイドの完全な解離またはピペッティングは避けてください。心筋細胞はせん断応力に非常に敏感です。
    1. BC-M(ステップ2.1で詳述した組成物)にインスリン(10 mg/mL)を補充して、心臓オルガノイド成熟培地(COM-M)を調製します。
    2. 7.5日目以降は、COM-Mに移行します。ストレスを最小限に抑えながら栄養レベルを維持し、代謝老廃物を除去するために、毎日培地交換を行います。
    3. 8日目から12日目まで、心臓オルガノイドの自発的な鼓動を探します。
    4. 12+ 日目までに、収縮リズムが規則的で持続的であることを確認します。
      注:ビートレートと形態は、タイムラプス顕微鏡および画像解析ツールを使用して定量化できます。
      電気生理学的分析 (カルシウム イメージングや MEA など) を 12 日目以降に実行して、機能的成熟度を評価できます。

3. 凍結保存の準備

  1. 機械的ストレスを避けるために、ワイドボアピペットを使用して培養プレートから心臓オルガノイドを慎重に移します。それらを15 mLの円錐形チューブに入れ、遠心分離せずにオルガノイドを重力によって3〜5分間自然に沈降させます。
  2. 次の成分(最終濃度)を含む凍結保存培地(Cryo-CM)を調製します:80%CM-M、10%FBS、10%DMSO。
  3. 心臓オルガノイドをクライオバイアルあたり500 μLのCryo-CMに穏やかに再懸濁します。
  4. クライオバイアルをイソプロパノールベースの凍結容器に入れます。-80°Cで12〜24時間保管し、~1°C/分で徐々に冷却します。
  5. 一晩凍結した後、バイアルを液体窒素貯蔵庫に移して長期保存します。
    注:心臓オルガノイドをクライオバイアルあたり約20〜30の成熟オルガノイドの密度で凍結保存し、1 mLの凍結保存培地に懸濁しました。

4. 心臓オルガノイドの回収と解凍

  1. オルガノイドを回収するには、バイアルを水浴ですばやく解凍し、心臓オルガノイドをCM-M培地に移し、穏やかに遠心分離してDMSOを除去し、オルガノイドを新鮮なCM-Mに再懸濁します。
    注:解凍後のビートは、オルガノイドの成熟度と取り扱いの品質に応じて、通常24〜48時間以内に再開されます。

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結果

H9 hESCの心臓オルガノイドへの分化の成功は、多能性幹細胞の堅牢な復活と維持から始まります。解凍時、hESCは、ROCK阻害剤を添加したE8培地のビトロネクチンでコーティングされたプレートにプレーティングすると、高い生存率と接着性を示します。24〜48時間以内に、明確なエッジと高い核と細胞質の比率を持つコンパクトなコロニーが観察され、典型的な未分化形態の回復を示します(図1A)。解凍後、hESCは急速に増殖期に入り、堅牢なコロニー拡大と多能性特性の再確立を示します(図1A)。

H9 hESCから心臓オルガノイドを生成するための全体的なワークフローを 図1Bに示し、幹細胞の維持から3Dオルガノイドの形成および成熟までの各段階を詳細に示しています。hESC の心臓オルガノイドへの分化の成功は、一連の明確な形態学的および機能的移行を通じて明らかです。超低付着プレートに凝集してから最初の24時間以内に、コンパ...

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ディスカッション

H9 hESC からの心臓オルガノイドの生成の成功は、初期の心臓発達を模倣するための主要なシグナル伝達経路の正確な時間的および空間的調節に依存しています。このプロトコルは、中胚葉誘導、心臓系統の仕様、および化学的に定義されたシステム内の3D収縮構造への自己組織化の重要な段階を要約します。この方法は、ヒトの心臓の発達、先天性心疾患、および心毒性スクリーニングをモデル化するための堅牢で再現性のあるプラットフォームを提供します。

このプロトコルの最も重要なステップの1つは、分化5の前にH9 hESCの健全性と品質を確保することです。細胞は、分化が開始される前に、約70%のコンフルエントまで培養し、解凍後に少なくとも1回継代する必要があります15,16。継代せずに解凍したばかりの hESC を使用すると、多くの場合、生存率が低下し、心臓導入が非効率になります。さらに、定期的なメンテナンス中は、コロニーの完全...

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開示事項

著者には宣言すべき利益相反はありません。

謝辞

hESC(H9)を提供してくださったJunfeng Jiさん(中国浙江大学基礎医学部)とTao Luoさん(中国浙江大学基礎医学部)に感謝します。この研究は、中国国家自然科学基金(C.Z.への助成金第U23A20398号)、四川省科学技術プログラム(C.Z.への助成金第2022YFS0578および2022YFS0614)、西南医科大学研究スタートアップ財団(C.Z.への助成金第00040155号)、西南医科大学研究スタートアップ財団(B.W.への助成金第00170071号)の助成金によって支援されました。 瀘州市人民政府と西南医科大学の科学技術戦略的協力プログラム(B.W.への助成金番号2024LZXNYDJ088)、西南医科大学の科学技術戦略的協力プロジェクト(BWへの助成金番号2024PZXNYD01)、および西南医科大学の財団(B.W.への助成金番号2024ZKZ014)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.02%EDTAビヨタイムC0198
6ウェル 皿コーニング3516
7.5%ウシ血清アルブミンACMECのAC11954
96ウェル超低アタッチメントプレートコーニング7007
Alexa Fluor 488 ロバ抗マウス IgGイェン34106ES60
Alexa Fluor 555 ヤギアンチウサギインビトロゲンA-21428
CHIR-99021 一塩酸塩イェン52965ES10
DMSO ソーラービオD8370
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (D-PBS)イェン60152ES76
FBSのギブコ10099141C
FGF2タンパク質、ヒト、組換えターゲットモールTMPY-00749-50 &ミュー;g 
ハムのF-12栄養ミックスライフテクノロジー11765054
hPSC-CDM(エッセンシャル8培地)カリセル400105
ヒトBMP-4組換えタンパク質ギブコPHC9534
IMDM、グルタMAXサプリメントライフテクノロジー31980030
インスリン-トランスフェリン-セレン (ITS -G)ギブコ41400045
LY294002セレックS1105-50mg
モノチオグリセロールシグマ・アルドリッチM6145
マウス抗アルファ&SMAアブマートMN50104
ProLong ダイヤモンド退色防止マウント剤(DAPI付き)インビトロゲンP36966
ウサギ抗CDH5アブマートTA6265
ウサギ抗cTNTインビトロゲン701620
組換えヒトBMP-4タンパク質イェン92053ES20
組換えヒトインスリン イェン40112ES25
組換えヒト/マウス/ラットアクチビンAタンパク質イェン91702ES10
リレSR幹細胞100-0483
レチノイン酸シグマ・アルドリッチR2625
ビトロネクチンギブコA14700
XAV-939セレックS1180
Y-27632 2HCl (ROCK阻害剤)セレックS1049

参考文献

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