動物モデルにおける間質液の縦断採取における脳開流微量灌流の利用

サマリー

生体内では、膠芽腫(GBM)など多くの中枢神経系疾患の基盤となる細胞間コミュニケーションは、測定や特徴付けが非常に困難であることで知られています。ここでは、GBMの縦断動物モデルで間質性液体成分を採取するために用いられる脳開放流微量灌流(cOFM)の手順について説明します。

要約

中枢神経系(CNS)の疾患は、複雑で動的な細胞間コミュニケーションのネットワークを通じて現れます。最も一般的で攻撃的な原発性脳腫瘍である膠芽腫(GBM)は、その急速な進行と数年ではなく数か月単位の厳しい予後が特徴です。GBMの生物学は、腫瘍細胞と間質細胞間の複雑なシグナル伝達分子交換によって動かされており、攻撃的な病変進行を支えています。ここでは、GBMマウスモデルにおける詳細な脳開放流マイクロ灌流(cOFM)プロトコルを説明し、間質液(ISF)内の腫瘍微小環境動態をリアルタイムで縦断的にモニタリングできるようにします。私たちのアプローチでは、耐久性のあるガイドカニューレヘッドマウントの埋め込み、ガイドを通じた脳内グリオーマ移植への使用、そして代謝体解析およびプロテオームLC-MS解析のための高精度cOFMサンプルの収集を説明しています。重要なのは、cOFMが従来の微小透析の分子サイズ制限を克服することです。GBMを超えて、cOFMの手法は、神経変性、てんかん、神経精神疾患を含む中枢神経系障害のスペクトルに対して、それぞれの動物モデル内で病因学的かつ治療に応じたバイオマーカーを提供する能力を通じて、変革的な洞察をもたらすことを約束しています。

概要

中枢神経系(CNS)疾患の調査は、間質液(ISF)^1,2,3,4によって媒介される複雑で多峰の細胞間シグナル伝達のために非常に困難です。この複雑さは特に、神経膠芽腫(GBM)などの脳腫瘍で顕著で、細胞間シグナルが腫瘍細胞と間^質細胞間で伝達^{されます。}多くの場合、代謝物やタンパク質メッセンジャーを含む多様な生体分子の異常な交換が、CNS病理の根本的な病因に寄与しています。この調査上の課題は、特にGBMにおいて、ISFの分子組成が時間的に動的であり、疾患進行中および介入的治療に応じて進化するという事実によってさらに悪化しています(^10,11)。

従来の前臨床GBM調査手法には、in vitro試験や単一評価項目動物モデルが含まれます。これらのアプローチの性質上、腫瘍微小環境の特徴と縦断的な時間変化の両方を捉えることができないため、より広範な臨床的応用性は制限されています。1980年代初頭の進展により、脳内微小透析(cMD)12,13,14,15の発展により、これらの文脈的制約が克服されました。45年前の誕生以来、cMDは生体脳内の間質液(ISF)の縦断サンプリングの標準的な方法として確立^{されています。}これは、高濃度のISF溶質が半透膜を通じて自由拡散・対流し、継続的に流れる低溶質濃度の浸流液、通常は人工脳脊髄液(aCSF)に移行することで実現されます¹⁷。これらの半透膜は、分子量の孔径カットオフが20 kDaから3 MDa¹⁸の範囲である様々な生体適合ポリマーで構成されています。この低侵襲手法により、代謝物や神経伝達物質のような小分子から抗体のような大きなタンパク質に至るまで、多様な分析対象を縦方向の現地採取が可能です。しかし、cMD膜の構造的多孔性とその組成ポリマーの吸着性特性は、脂質や抗体など特定の生化学的または次元特性を持つ分析対象物の相対的な回収に大きな影響を与える^{可能性があります。}

cMD膜のこの制限を克服するための進展は、2010年代初頭に脳開流マイクロ灌流(cOFM)²¹の開発から始まりました。cMDと同様の一般原理で機能し、半透膜による生化学的制約を除去し、約100μm^サイズの低吸着性の巨視的開口部を持つプラスチック格子プローブに置き換えます。多くの報告が、ペプチドホルモン、ナノボディ/抗体、小型脂溶性治療薬、PEG化リポソーム19,22,23,24,25を含む検出可能なISF成分の収集を通じてcMDよりもcOFMの有用性が向上したことを示しています。cOFMガイドプローブの埋め込みに対する生理学的組織反応を調べた先行報告では、血液脳関門の完全性は移植後15日までに再確立され、²⁶日以降はグリア瘢痕の形成が見られませんでした。微小透析膜が巨視的な開口部に置き換えられたことにより、研究者たちはcOFMガイドプローブが免疫不全ラットの脳に異種膠質腫細胞を注入する革新的な能力を示し、cOFMサンプリング領域²⁷の周囲に直接無外傷性腫瘍の移植と増殖が起こることを示しています。

中枢神経系病理の研究におけるcOFMの使用においては、その方法論的な限界を認識しなければなりません。ISF分析物の受動的拡散と対流による流入注入に依存しているため、これらの制限は分析物濃度と試料^体積18に関わるものです。採取されたISF成分は、内因性濃度と比較して収集されたcOFM混流液内で希釈されるため、実験条件^間の相対分析物比率を比較する多くの研究が行われています。典型的な流量は0.1 μL/minから1.0 μL/minの範囲で、相当は6 μL/hから60 μL/hに相当します。チュービングのデッドスペースクリアランス時間を考慮する際には、総サンプリング時間も考慮すべきです。これは特に麻酔動物のcOFM採取を行う際に重要であり、動物福祉の懸念に慎重に対処する必要があります。これらやその他の考慮事項の詳細な説明は、cOFM開発チーム²⁹による以前の方法報告書に記載されています。

本稿では、神経疾患の研究における縦断cOFMサンプリングの最新プロトコルを提供し、特にGBMに焦点を当てています。プロトコルには、cOFMガイドカニューレの埋め込み、腫瘍細胞注入、cOFMガイドを通じた移植の手順、さらに覚醒状態で自由に動く動物における2つのcOFMサンプリング構成が含まれます。cOFMで測定された代謝組およびプロテオームISF成分に対する治療効果、サンプリング構成が分析物濃度に与える影響、cOFMガイド付き腫瘍細胞移植の有効性を示す代表的なデータを提示します。

プロトコル

このプロトコル内のすべての動物処置は、ノースウェスタン大学の施設動物ケア・使用委員会(IACUC、プロトコルID:IS00021383)によって承認され、国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに従っています。このプロトコルは、生後8〜10週の最低年齢のC57BL/6Jマウス(オス・メス)での使用を目的として開発されました。このプロトコルで使用されたマウスグリオーマ細胞株CT2Aは、ボストン大学のセイフライド研究室から提供され、無菌組織培養条件下で培養・調製されました。

1. 手術計画と準備

1. 動物情報:cOFM実験では、完全な成長と発達を促すために最低8〜10週間齢のマウスを使用してください。固定位置の頭蓋インプラントは、まだ発達中の頭蓋骨や脳の正常な成長を妨げたり、外れたりすることがあります。
2. 外科的座標選択:動物脳アトラスを用いて、ブレグマに対する関心領域の直交座標を特定します。例えば、膠質腫細胞の移植は通常、線条体内に行われ、原生のGBM微小環境を最適に再現し、その後の腫瘍発生の有効性を最大化します。このプロトコルで使用されるcOFMガイドの埋め込み座標は、中外側(ML)=2.5mm、前後(AP)=0mm、背腹側(DV)=3.5mmです。
   注意:立体定位座標はマウスの系統や年齢によって異なる場合があります。望ましいcOFMガイドの配置を確保するために、種および系統ごとのアトラス座標を使用してください。
3. 適切なcOFM構成の選択:2mmから22mmまでの特定の全長で、開放面長は1mmから2mmの適切なcOFM構成の部品を注文します。
   注意:動物はグルーミング行動中に不適切に埋め込まれたcOFMガイドヘッドマウントを外してしまうことがあります。この作業中にヘッドマウントへの機械的なレバーを最小限に抑えるため、ガイドは意図されたDV座標距離より2〜3mm以上長くないことを推奨します。
4. 実験目標のための手術およびサンプリング手技のタイムポイント計画:関心のある疾患やモデルの特徴に応じて、cOFM関連手技のタイミングと順序を慎重に計画し、対象となる生物学を最適に調査します。
   1. 健康な脳と腫瘍微小環境間のISF組成の違いを調査する際は、同じ動物内で腫瘍移植の前後にcOFMサンプリングを行う。
   2. 臨床介入がCNS病理に与える影響を調査する場合は、対照または実験治療を受ける並行動物コホートで投与前後にcOFMサンプリング手順を実施してください。

2. cOFMガイドの配置手術

1. cOFMガイドの手術用器具を組み立て、挿入手術( 材料表)を行い、必要に応じてオートクレーブで滅菌してください。
2. 外科手術の準備:
   1. バイオセーフティキャビネットの消毒:適切に消毒されたバイオセーフティキャビネット内で外科手術を行います。バイオセーフティキャビネットの空気流を作動させ、内部表面を機関承認の消毒・拭き取り方法で清掃してください。キャビネットの底面には無菌のカーテンを敷きましょう。
   2. 立体定位器具を準備する:立体定位フレームを消毒剤で洗浄し、バイオセーフティキャビネットに入れます。同様に、立体定向に取り付けられたドリルとガイドホルダーを清掃・消毒し、バイオセーフティキャビネットに入れてください。
   3. 手術用温熱パッド:立体定位手術段階に温熱パッドを使い、麻酔中に補助的な熱を提供します。ヒートパッドの表面を清掃・消毒し、動物が置く立体定位フレームに置いてください。温熱パッドを弱火にして、その上に1〜2枚の無菌カーテンを敷きます。
   4. 追加の外科用器具と機器を設置:バイオセーフティキャビネットに無菌的に追加の滅菌機器を設置します。
   5. リカバリーケージの設置:清潔なリカバリーケージを、できるだけ低温に設定したヒーターパッドの上に置きます。動物は完全に回復するまで個別のリカバリーケージに入れる必要があり、そのため回収ケージの総数は手術の成績や回復時間に依存します。
3. 術前動物製剤( 図1Aにまとめ):
   1. 麻酔:適切な麻酔深度を得るために、病院承認の麻酔薬化合物と用量を投与し、足ひみ反射テストおよび呼吸深さ・速度を測定して十分な麻酔を確保します。例えば、ケタミン-キシラジンカクテル(100 mg/kg - 10 mg/kg、生理食塩水)を腹膜内注射すれば、C57BL/6Jマウスに適した麻酔深度を得るのに十分です。
   2. 鎮痛:術前および術後の痛み管理を支援するために、機関承認の鎮痛剤を投与します。例えば、周術期の痛み管理にはメロキシカム(20 mg/kg、生理食塩水)を皮下注射することが適しています。
   3. 脱毛(シェービング、脱毛クリーム):電気シェーバーや除毛クリームを使って、頭蓋骨の手術部位から毛を除去します。除毛クリームを使用する場合は、刺激を避けるために長時間塗り続けないように注意してください。
   4. 眼科軟膏:無菌の綿先端のアプリケーターを使って両目に優しく塗布し、手術中の角膜乾燥を防ぎます。
   5. 動物の立体定位フレームへの配置:咬合ブロックに切歯を挿入し、耳バーを耳道にしっかりとしかし優しく挿入し、鼻クランプを動物の鼻骨に固定することで、動物を正しく立体定位枠に配置します( 図1B)。適切に位置を取れば、動物の頭蓋骨は動かさずにしっかりと固定されるべきです。
   6. 無菌の手術部位準備:手術部位の皮膚をアルコール(エチルまたはイソプロピル)とポビドンヨウ素を交互に3回の綿棒で拭き取り、切開のために無菌的に消毒します。
4. 切開および頭蓋骨表面の準備:
   注意:以下のすべての手順はできるだけ無菌的に行うべきです。このため、主治動物外科医は切開手術に進む前に標準的な実験室用手袋の上に無菌手術用手袋を着用する必要があります。
   1. 切開の位置と長さ:無菌メスを使い、頭蓋骨の表面に沿って目の間から始まり、尾端方向に8〜10mmにわたって矢状体中央線の切開を行います( 図1C)。
   2. 皮膚リトラクション:滅菌鉗子、綿先端のアプリケーター、またはメスの刃を使って、正中切開部から皮膚を横方向に引き戻します。ブレグマとラムダの両方が見えるようにし、見えなければ切開部を伸ばしてください。
   3. 骨膜切開:無菌メスで骨膜に切開を行い、鉗子で組織を横方向に引き戻します。
   4. 過酸化水素綿棒:無菌の綿先端アプリケーターで希釈した1%〜3%の過酸化水素で頭蓋骨表面を洗浄します( 図1D)。これにより、矢状線、冠状線、ラムダ線の頭蓋縫合線を通じてブレグマとラムダの同定にも役立ちます。
   5. 自己エッチング歯科接着剤:0.3 mLから1.0 mLのインスリンシリンを使い、頭蓋骨表面に20〜40 μLの自己エッチング歯科接着剤を均等に塗布します( 図1D)。エッチングを助けるために歯科用硬化ライトを当ててください。硬化後は、滅菌の綿先端アプリケーターと生理食塩水を使って余分な接着剤を拭き取ってください。
      注意:Bond Forceのような自己エッチング歯科接着剤は、可燃性危険性(GHS02: H225)、健康被害(GHS07およびGHS08: H315, H319, H317, H361fd, H336)、環境危険(GHS09: H412)などの潜在的に危険な物質です。適切な有害廃棄物処理については、地域および機関のガイドラインに従ってください。
5. バリ穴の特定と穴の開け:
   1. 滅菌済みの0.7mmドリルビットをマイクロドリルに挿入し、適切なホルダーを使って立体定位フレームにドリルを取り付けます。
   2. ブレグマを矢状体と冠状縫合の交差点に位置づけ、立体定位マイクロマニピュレーターを使ってドリルビットをそこに位置させます。
   3. ドリルビットをcOFMガイド座標(ML = 2.5、AP = 0.0)に再配置し、ドリルを15,000rpmまで作動させ、DVマイクロマニピュレーターダイヤルを調整して慎重にバリ穴を開けます(図1E)。ドリル中に頭蓋骨の厚さを頻繁に観察し、脳の損傷を防ぎましょう。ドリル中は生理食糧水を使って骨の破片を洗い流し、ドリルビットと頭蓋骨の間の熱を減らします。
   4. 各アンカースクリュー座標について掘削手順を繰り返します(図1E)。推奨されるアンカースクリューの位置はML = 2.5、AP = -2.5、ML = -2.5、AP = -2.5です。
   5. バー穴を開けた後、マイクロドリルとドリルホルダーを立体定位フレームから外します。
   6. 30Gの針で、cOFMガイドのバーホールの下の硬膜を優しく刺します。
6. アンカースクリューは、滅菌鉗子と適切なサイズの滅菌ドライバーを使って取り付けます(図1F参照)。ねじのねじのピッチによっては、ネジを1〜2本の深さで挿入すればアンカレッジが十分です。アンカースクリューを深く打ちすぎないように注意し、皮質を傷つけないように注意してください。
7. cOFMガイドとcOFMダミーアッサンブラージュをガイドホルダーとステレオタクティックフレームのマウントホルダーに取り付けます。cOFMガイドの先端をバリホールの上(ML = 2.5 mm、AP = 0.0mm)上に、ブレグマの高さと同じDVで位置付け、cOFMガイドをバリ穴を通して適切な所定深さまでゆっくりと1 mm/minの速度で降ろします( 図1F)。例えば、腫瘍細胞移植を意図するcOFMガイドの配置深度はDV = -3.5 mmです。
8. 頭蓋骨の表面にセメント剤を塗布し、cOFMガイドとアンカースクリューの上下および周囲を薄く均一な層で覆います。歯科用硬化ライトを使ってセメント剤の各層を硬化させ、その後の層を塗布します( 図1G)。セメント剤を塗布し続け、各部品間のスカル面が覆われ、アンカースクリューが完全に覆われ、cOFMガイドの下から溝周辺までカバーされます。セメント剤をロックウェッジの上や近くに塗らないように注意してください。
   注意:テトリック・エボフローのようなセメント剤は、潜在的に有害物質であり、健康被害の可能性があります(GHS07: H317, H319, H335, H360)。適切な有害廃棄物処理については、地域および機関のガイドラインに従ってください。
9. ガイドホルダーをcOFMガイドから外し、マイクロマニピュレーターのDV調整ノブでゆっくりとガイドホルダーを持ち上げます。マイクロマニピュレーターを立体視フレームから外してください。
10. まず耳バーを緩めて取り外し、鼻クランプを緩めて引っ込め、次に動物の切歯を噛み合わせブロックから持ち上げて、動物を立体視準フレームから切り離します。
11. 縫合皮膚はデンタルセメント剤の上で閉じ、cOFMガイドボディが露出したままになります。ポリグリコール酸(PGA)やポリグラクチン(Vicryl)などの吸収性4-0縫合糸が推奨されます(図1H)。
12. 元の切開部に隣接する皮膚に三重抗生物質軟膏を塗布します。
13. 動物の回復と支援:
    1. 動物を隔離されたリカバリーケージ(1つのケージに1匹)移し、低温に設定した加熱パッドから補助的な熱を供給します。
    2. 任意:回復を早めるために麻酔逆薬を動物に提供すること。例えば、アティパメゾールの皮下注射(生理食塩水で1 mg/kg)は、麻酔回復時間を約1時間から約20分に短縮します。
    3. 動物が十分に意識と胸骨横たわりを回復するまで、継続的な観察と支援を提供します。手術と麻酔から完全に回復するまでは動物を放置しないでください。
    4. 動物が完全に回復したら、他の動物と一緒に共同飼育ケージに戻すことができます。
    5. 手術後1日、メロキシカムなどの機関承認鎮痛剤を投与して追加の鎮痛支援を提供します(ステップ2.3.2参照)。
14. cOFMガイドの移植手術後は、血液脳関門の完全な治癒を経てから、追加の処置を行う前に14日間の回復期間を確保してください。

3. cOFMガイドによる頭蓋内腫瘍細胞の着床

1. 細胞培養と調製:
   1. 細胞型特異的なプロトコルに従って細胞を培養・増殖します。例えば、CT2Aのような合成マウスグリオーマ細胞は、10cmの皿やT-75フラスコにDMEMを含み、10%の胎児用牛血清(FBS)と1%のペニシリン/ストレプトマイシンサプリメントで培養できます。
   2. 培養細胞を細胞型特異的なプロトコルに従って着床準備します。
      1. 例えば、シンジェニックCT2A膠質腫細胞では、培養培地を除去し、短時間PBSで洗浄し、0.05%トリプシン(0.53 mM EDTA)を37°Cで5分間培養します。
      2. 1%のFBS含有DMEMと同じ体積でトリプシンを中和し、細胞を15 mLの円錐形チューブに移し、300 x g で4°Cで5分間遠心分離してペレット細胞に送り込みます。
      3. 上清液を除去し、細胞ペレットを1mLのPBS(または生理生理食塩水)に再懸濁させます。手動または自動血液細胞計で1mLあたりの細胞数を測定します。細胞懸濁液を300 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清液を除去して適切な量のPBS(または生理食塩水)に再懸濁し、1μLあたり50,000細胞を達成します。細胞懸濁液を埋め込み準備まで氷上に置きます(ステップ3.5.2)。
2. 頭蓋内腫瘍細胞移植手術用の外科用器具を組み立て(材料表)、必要に応じてオートクレーブで滅菌してください。
3. 手術スペースの準備
   1. バイオセーフティキャビネットの消毒:ステップ2.2.1を参照してください。
   2. 立体定位器具を準備する:立体定位のフレームを消毒剤で清掃し、バイオセーフティキャビネットに入れます。同様に、立体定位に取り付けられた注射器ホルダーを清掃・消毒し、立体定位フレームに取り付けます。
   3. ステップ2.2.3.から2.2.5を実行します。残りの準備段階のために。
4. 術前動物準備:
   1. ステップ2.3.1、2.3.2、2.3.4、2.3.5を実行します。動物の準備のために。
5. 腫瘍細胞の移植:
   1. 注射器および注入インサートアセンブリ( 図2にまとめ)
      1. フランジ付きチューブコネクターを70%エタノールに少なくとも5分間浸してください。
      2. 滅菌された10μLまたは25μLのガス密閉ガラスシリンジの先端をフランジ付きチューブコネクターの一端に挿入します。
      3. cOFMインフュージョンインサートのインレットをチューブコネクターの反対側に挿入します。
      4. 注射器注入用インサートアセンブリを立体定位式シリンジホルダーに固定します。
   2. 注射器注入インサートアセンブリに適切な量の細胞懸濁液を充填してください。例えば、3μLの細胞懸濁液を50,000セル/μLで負荷し、1匹あたり合計150,000セルを注入します。
   3. ダミーインサートを注入インサートに置き換える方法:
      1. 鉗子を使ってcOFMガイドとダミーアセンブリからロックウェッジを外し、そっとcOFMダミーをガイドから引き出します。
      2. マイクロマニピュレーターのMLとAP調整ノブを使って、cOFMガイドの上方でシリンジ-インフュージョンインサートアセンブリを操作します。DV調整ノブを使って、注入インサートを慎重にcOFMガイドに下げ、ロッキングウェッジをピンセットでしっかりと再挿入して固定します。
   4. 注射器から細胞懸濁液3μLを1μL/分の速度で注入します。cOFMガイドとインフュージョンインサート周辺を注意深く観察し、細胞懸濁液がアセンブリから排出されていないか確認してください。全量の注射が終わった後、頭蓋内圧が平衡になるまでさらに1分待ちます。
   5. インフュージョンインサートをダミーインサートに交換してください。
      1. 鉗子を使ってcOFMガイドと注入インサートのロッキングウェッジを外し、マイクロマニピュレーターのDV調整ノブを優しく調整して、cOFM注入インサートをガイドから引き出します。
      2. cOFMダミーをガイドに差し替え、ロッキングウェッジをピンセットで再挿入して固定します。
6. まず耳バーを緩めて取り外し、鼻クランプを緩めて引っ込め、次に動物の切歯を噛み合わせブロックから持ち上げて、動物を立体視準フレームから切り離します。
7. 動物の回復と支援:
   1. 動物を隔離されたリカバリーケージ(1つのケージに1匹)移し、低温に設定した加熱パッドから補助的な熱を供給します。
   2. 任意:回復期間を早めるために動物に麻酔逆転剤(アティパメゾールなど)を投与する(ステップ2.13.2参照)。
   3. 動物が十分に意識と胸骨横たわりを回復するまで、継続的な観察と支援を提供します。手術と麻酔から完全に回復するまでは動物を放置しないでください。
   4. 動物が完全に回復した後は、他の動物と一緒に共同飼育ケージに戻すことができます。
   5. 手術翌日には、メロキシカムなどの機関承認鎮痛剤を投与して追加の鎮痛支援を提供します(ステップ2.3.2参照)。
      注:ルシフェラーゼ陽性細胞株を使用する場合、細胞移植後1〜2週間後に生物発光イメージング(BLI)を実施し、腫瘍移植の成功を検証できます。動物の毛皮や頭部の存在などの物理的特徴は発光の検出を妨げることがありますが、腫瘍の有無を大まかに推定するためには依然として利用できます。または、cOFMガイドの設置に使われるアンカースクリューが非強磁性でMRI互換性がある場合にMRI検査を行うことも可能です。

4. 脳間質液のcOFMサンプリング

注:受動的な分析物拡散に依存しているため、cOFMサンプルは内因性ISF環境と比べて希釈された分析物濃度を含みます。このため、試料の測定値をより適切に反映するために、いくつかの方法がこれまでに提案^{されています。}この節では、2つの異なるサンプリング方式について説明します。ステップ4.1。製造者が推奨する構成モード(以下はフラクショナルドと呼びます)は、時間感度を高めるものの分析物濃度を犠牲にします。ステップ4.2。ここでは、時間分解能の低下を代償として分析物濃度を高めることができる、私たちが開発した代替的な構成モード(以下リキュキュレイテッドと呼びます)を詳述します。

1. 分画cOFMサンプリング( 図3Aにまとめ):
   1. フランジ付きチューブコネクターを70%エタノールに少なくとも5分間浸し、チューブやサンプリングインサートへの取り付けを容易にしてください。
   2. 十分なaCSF浸水液を充填してパーフューセイトバッグを充填してください。例えば、680 μLは10 μL/minでの20分間のラインフラッシュと1 μL/minでの8時間サンプリングの両方に最低限十分な量です。ただし、保温バッグの崩壊や故障を防ぐために最低2mLの容量が推奨されます。
   3. ガス密閉ガラスシリンジを使って、プッシュチューブとプルチューブの両方に適切な量のaCSFをプリフィルしてください。例えば、ユニバーサルプッシュプルローバインドチューブは内径0.25mm、個々のチューブ長は100cmです。これは約1μL/2 cmに相当し、プッシュチューブで約55 μL、プルチューブで約100 μLとなります。
   4. 図3Aに示すように、マイクロパーフュージョンポンプのポンプヘッドに、チューブの蠕動部を正しく取り付けてください。
      注意:必要に応じてBASiの取扱説明書をご参照ください。
   5. ルアーロックコネクター(図3A、コンポーネントi)を使って、パーフューセイトバッグをチューブのプッシュ部分に接続します。
   6. サンプリングインサートをフランジ付きチューブコネクターでチューブラインに接続します。サンプリングインサートの入口(より長いシャフト長)は、プッシュチューブの出力端、パーフューゼートバッグチューブラインの反対側に取り付けるべきです(図3A、左上)。サンプリングインサート出口(短いシャフト)は、プルチューブの入力端に取り付け、パーフューセイトバッグチューブラインに平行に設置する必要があります(図3A、右上)。接続されたサンプリングインサートを、750μLのaCSFを含む無菌マイクロ遠心分離機チューブに入れ、システムのフラッシュ準備を行います。
   7. フラクショナルコレクターニードルをフランジ付きチューブコネクターでプルチューブ出力ライン(サンプリングインサート出口の反対側)に接続します。
   8. チューブシステム内に閉じ込められた気泡を除去するために、10 μL/minで20分間洗浄を行います。
   9. 分数収集器のセットアップ:
      1. 標本の比較およびサンプル体積の検証のために、それぞれの重量に注釈を付けて評価します。分流集子カルーセルの対応するスロットにチューブを挿入します。
      2. 分数コレクターをオンにして、設定を希望の値に設定します。例としては、#のサンプル数、サンプル時間(m)、遅延(時間)、リフリッグ冷却、_cannulaモードなどがあります。
         注:プルチューブ内の直位性ISFに接触しなかったデッドスペース流体の排出は、i) チューブの長さと体積(OFM-PP2-100-LBは約2 cm/μL)、ii) 流量、iii) 遅延(時間)で近似されます。これらのパラメータは、適切な分数収集を確保するために収集システムを設定する際に慎重に考慮すべきです。
2. 再循環cOFMサンプリング( 図3Bにまとめ):
   1. フランジ付きチューブコネクターを70%エタノールに浸し、チューブやサンプリングインサートへの取り付けを容易にします。
   2. ガス密閉ガラスシリンジを使って適切な量のaCSFをプリフィルし、チューブラインをプリフィルします。
   3. マイクロパーフュージョンポンプのポンプヘッドに、誘導チューブの蠕動部分を正しく取り付けてください。
   4. サンプリングインサートをフランジ付きチューブコネクターでチューブラインに接続します。サンプリングインサートの入口(長いシャフト長)はプルチューブの出力端に接続されるべきです。サンプリングインサートの出口(短いシャフト)はプルチューブの入力端に接続すべきです。接続されたサンプリングインサートを、750μLのaCSFを含む無菌マイクロ遠心分離機チューブに入れ、システムのフラッシュ準備を行います。
   5. チューブシステム内に閉じ込められた気泡を除去するために、10 μL/minで20分間洗浄を行います。
4. 動物をcOFMシステムに接続:
   注:動物のcOFMシステムへの接続および除去は、一時的なイソフルラン麻酔下で最も容易に行われます。正しく行えば、この作業は1匹あたり5分以内で終わります。ただし、眼科軟膏の使用は強く推奨されます。
   1. 動物麻酔:動物をイソフルラン麻酔誘導室に入れます。酸素流量2L/分、イソフルラン濃度3%で麻酔を開始します。動物が適切な麻酔レベル(静止状態で呼吸数約1/秒)に達するまで観察します。誘導チャンバーから麻酔マスクに移し、酸素流量2L/min、イソフルラン3%に設定されます。
   2. 動物のジャケットを着用する:動物を適切なサイズのジャケットに着せ、前肢を完全に腕の穴から引き出し、ジャケットを動物の背中にしっかりと固定します( 図3C参照)。
   3. ダミーインサートをサンプリングインサートに交換する:鉗子を使ってガイドとダミーアセンブリからロックウェッジを外し、ダミーを慎重にガイドから持ち上げます。サンプリングを優しく取り付け、ガイドに挿入し、再びロッキングウェッジを差し込みます。
   4. 動物を麻酔から外し、回転ケージシステムに入れます。ケージのテザーを動物のジャケットに結びつけ、回転ケージシステムを作動させます。
5. cOFMサンプリングの実施:
   1. マイクロパーフュージョンポンプを5 μL/minに設定し、cOFMサンプリングインサートの設置によって生じた可能性のあるマイクロバブルを除去するために2分間フラッシュを行います。
   2. マイクロパーフュージョンポンプの設定をポンプモードに適した流量(例:1 μL/min)に変更します。
   3. ポンプモードを起動。分画cOFMサンプリングを行う場合は、分画コレクターを作動させます。
   4. cOFMサンプリングの初期段階では、ガスバブルがないかプッシュ・プルチューブを注意深く観察してください。気泡は機械の正常な機能やサンプル採取を妨げ、動物の危険を及ぼす可能性があります。ガス気泡が観察された場合は、システム部品を停止し、動物をcOFMシステムから切り離し、チューブを通してaCSF洗浄でガス気泡を除去します。
   5. cOFMサンプリングの過程では、cOFMチューブや動物の行動をさらに頻繁に観察してください。動物の行動が急激な健康変化を示している場合は、直ちにシステムコンポーネントを停止し、動物の健康問題に対処してください。必要に応じて施設の獣医スタッフに相談してください。
6. cOFMシステムから動物を切り離す方法:
   1. 回転ケージシステムを解除し、動物のジャケットからケージのテザーを外してください。
   2. サンプリングインサートとcOFMチューブを接続したまま、動物をイソフルラン麻酔誘導室に移します。酸素流量2L/分、イソフルラン濃度3%で麻酔を開始します。動物が適切な麻酔レベル(静止状態で呼吸数約1/秒)に達するまで観察します。誘導室から麻酔マスクに移し、酸素流量2L/min、イソフルラン3%に設定されます。
   3. サンプリングインサートをダミーインサートに交換する:鉗子を使ってガイドとサンプリングインサートのロッキングウェッジを外し、慎重にサンプリングインサートをガイドから引き出します。ダミーインサートを優しくガイドに戻し、その後ロッキングウェッジを再度差し込みます。
   4. ジャケットを外す:動物のジャケットの裏側から留め具を外し、ジャケットを優しく外します。
   5. 動物の回復と観察:動物をイソフルラン麻酔から外し、清潔な回復ケージに入れ、完全に意識と胸骨横たわりが回復するまで継続的な観察を行います。動物が完全に回復したら、自宅のケージに再飼い入れしましょう。
7. サンプルの採取と保管:
   1. フラクショネーション抽出:
      1. 分画収集管から分画集水管を取り外し、氷の上に置いて短期間の輸送を行います。
      2. 各採集管を計量し、採集前の重量と比較してサンプルの体積を確認してください。
      3. cOFMサンプルの下流解析に進むか、長期保存のために-80°Cの冷凍庫に入れてください。
   2. 再循環サンプリング:
      1. プルチューブをcOFMサンプリングインサート出口(短いシャフト)に接続したまま、セットアップから切り離してチューブとサンプリングインサートを新しいクリーンなマイクロ遠心分離機チューブに入れます。
      2. 滅菌18Gの針を1mLから5mLの滅菌注射器に接し、空気を注ぎます。
      3. ピンをピンチューブの入力端にあるフランジ付きチューブコネクターに慎重に差し込みます。
      4. cOFMサンプリングインサートがマイクロ遠心分離機チューブ内に留まることを確認し、シリンジプランジャーを押し込んで空気とともに再循環したcOFMサンプル体積をプルチューブから排出します。cOFMサンプル全体をプルチューブからマイクロ遠心分離機チューブに排出し、必要に応じてシリンジを取り外して空気を補充してください。
      5. 再循環したcOFMサンプルを短期輸送のために氷上に置きます。
      6. 下流の分析に進むか、長期保存のために-80°Cの冷凍庫に入れてください。
8. 同じ動物でcOFMサンプリングを繰り返す場合のcOFM供給の保管:
   注意:サンプリングインサートやインレット/アウトレットチューブなどのcOFM使い捨て製品の再利用は、メーカーから推奨されていません。
   1. cOFMプッシュプルチューブを、約500μLの無菌aCSFまたは生理食塩水で、10μL/minを超えない速度で洗浄します。その後、70%エタノールを1〜2mLの同様のフラッシュで行います。最後に、18Gの針とフランジ付きチューブコネクターを備えた5mLまたは10mLのシリンジを使って、空気でチューブを洗い流します。
   2. cOFMサンプリングインサートの入口および出口チューブに、フランジ付きチューブコネクターを備えたガス密閉ガラスシリンジで50μLの無菌aCSFまたは生理食塩水をフラッシュします。その後、70%エタノール50μLを投与します。cOFMサンプリングインサートをチューブコネクターから取り外し、70%エタノール入りのバイアルに保存し、再利用の準備が整うまで待ちます。

結果

実験成功を判断するためのさまざまな評価的措置は、基礎となる病理や調査動物モデルの性質に応じて、中間段階または最終段階の実験段階で行われることがあります。GBM生物学の調査においては、生物発光イメージング(BLI)をcOFMガイド介有腫瘍細胞移植の有効性の中間評価指標として用いることができます(図4A)。しかし、これは単純な二項的な腫瘍の評価に用いられます。これは、埋め込み型ヘッドマウントの物理的特性により、動物間の腫瘍大きさを比較する際に検出される光度が減衰する可能性があるためです。

前述の通り、脳開放型マイクロパーフュージョン(cOFM)は、小さな代謝物から大きなタンパク質まで、さまざまなサイズのISF可溶性分子を幅広くサンプリングすることを可能にします。実験的比較は、同じ動物内(例:処理前と後)または異なる動物間(処理済みと未処理)で行うことができます。液体クロマトグラフィーと質量分析(LC-MS)を組み合わせることで、cOFMサンプリングされたISF...

ディスカッション

本プロトコルで説明されるcOFM手技は、病態組織のISF内因性成分を縦断的にサンプリングする能力により、CNS疾患の研究に革命をもたらす可能性を秘めています。しかし、この手法の研究的成功は、いくつかの重要なステップを適切に実施することに依存しています。その中で、cOFMガイドカニューレの正確かつ確実な位置は最も重要な点の一つです。不適切な手術手順や付着方法は、頭部マウント全体の脱落を引き起こし、その後のさらなる研究から撤退する可能性があります。ヘッドマウント全体の脱臼は、通常、アンカースクリューの取り付け不足やセメント剤の不適切な使用が原因です。ドリルビットの直径はアンカースクリューの内径と外径の間に位置し、アンカースクリューがバリ穴内に適切にフィットし、十分なネジ深さを確保して固定できるようにすべきです。セメント剤や自己エッチング用歯科用接着剤の不適切な使用、または期限切れの試薬の使用も、頭蓋骨へのヘッドマウントの固定力不足を引き起こすことがあります。過剰な自己エッチング歯科接着剤をより徹底的に除去し、セメント剤を塗布する前に頭蓋骨を乾燥させることも、頭蓋骨への接着強...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.7mm ドリルビット	ファインサイエンスツール	19008-07	バーホール掘削
1〜5 mLの注射器	BD	#309646	再循環パーフューセートサンプル回収
18G針	BD	#305195	再循環パーフューセートサンプル回収
30Gの針	BDウルトラファイン	328438	硬膜穿刺
4-0ビクリル縫合	ダイナレックス	9130	手術室を閉鎖することは
アルコールワイプ	フィッシャーブランド	22-363-750	手術部位の皮膚消毒
アンカースクリュー	BASi	MD-1310	cOFMヘッドマウント配置
人工脳脊髄液(aCSF)	BASi(ジョアンナム)	MD-2400	ISFのサンプリング
cOFMダミーインサート	BASi(ジョアンナム)	cOFM-D-#	cOFMヘッドマウント配置
cOFMガイド	BASi(ジョアンナム)	cOFM-GD-#-#	cOFMヘッドマウント配置
cOFMガイドホルダー	BASi(ジョアンナム)	OFM-STM-1	cOFMヘッドマウント配置
cOFM注入インサート	BASi(ジョアンナム)	cOFM-I-#	セル注入
cOFMロッキングウェッジ	BASi(ジョアンナム)	cOFM-ロック	cOFMヘッドマウント配置
cOFMサンプリング挿入	BASi(ジョアンナム)	cOFM-S-X	ISFのサンプリング
コットンチップのアプリケーター	フィッシャーブレイン	22363160	液体の吸収、過酸化水素の塗布
CT2Aマウスグリオーマ細胞株	セイフライド研究所 - ボストン大学	NA	移植された腫瘍細胞
歯科用セメント剤	イボクラル	595953US	cOFMヘッドマウント配置
歯科硬化ライト	ヘンリー・シャイン	5700253	cOFMヘッドマウント配置
除毛クリーム	ヴェート	3116875	手術部位の脱毛
電動シェーバー	ワール・クリッパー社	8841	手術部位の脱毛
細い鉗子	ファインサイエンスツール	5SF	切開、アンカースクリューの配置
フランジ付きチューブコネクター	BASi(ジョアンナム)	MD-1510	セル注入
分数採取バイアル	BASi(ジョアンナム)	MF-5281	分画サンプル保存
ガス密閉ガラスシリンジ(25 & mu;L)	ハミルトン	80465	セル注入
過酸化水素(1-3%)	ウォルグリーンズ	NDC: 0363-0268-32	頭蓋骨表面のクリーニング
インスリン注射器(0.3〜1.0mL)で31Gの針を使った	BDウルトラファイン	328438	麻酔および鎮痛剤の投与
マイクロ遠心分離機チューブ	バシックス	02-682-002	再循環パーフューセートサンプル回収
マイクロドリルと立体定位ホルダー	ハーバード・アパラタトゥス	75-1874	バーホール掘削
マウスジャケット	ロミール	MJ 02	動物と回転ケージシステムとの関係
OFMローバインドチューブ	BASi(ジョアンナム)	OFM-PP2-100-LB	ISFのサンプリング
OFM-Pump - マイクロパーフュージョンポンプ	BASi(ジョアンナム)	MPP102-PC	ISFのサンプリング
眼科軟膏	デクラ	211-38	周周眼潤滑
パッシベーテッド金属サンプリングニードル	BASi(ジョアンナム)	MW-2310	分画サンプル保存
パーフューゼートバッグ	BASi(ジョアンナム)	OFM-バッグ	ISFのサンプリング
生理学的生理食塩水	ICU医療	0990-7983-03	頭蓋骨表面の洗浄、バリホール掘削の補助
ポビドンヨウ素綿棒検査	PDIヘルスケア	SKU B40600	手術部位の皮膚消毒
プローブホルダー	ストールティング	51633
冷蔵分画集熱器	BASi(ジョアンナム)	MD-1201	分画サンプル保存
回転ケージシステム	BASi(ジョアンナム)	AMD-R ラターン	覚醒中のcOFMサンプリングのための自動ハウジング
メス用刃とハンドル	フィッシャー・サイエンティフィック	22079693	切開
ドライバー			cOFMヘッドマウント配置
セルフエッチングデンタル接着剤	徳山		セメント剤のスカル表面プライミング
採取バイアル用のシリコーンプッシュキャップ	BASi(ジョアンナム)	MF-5283	分画サンプル保存
ステロタクティックフレーム	ストールティング	51725