異種移植における急性細胞拒絶反応および抗体介質拒絶反応の研究を用いる3人による標準化マウスモデル

サマリー

本研究は、急性細胞拒絶反応および急性抗体介在拒絶反応を特異的に再現するために、2つの標準化されたマウス異種移植モデルを確立します。これらのモデルは、異種移植片の免疫拒絶反応のメカニズムの調査、免疫抑制戦略の評価、前臨床異種移植研究の進展に信頼できるプラットフォームとして機能します。

要約

異種移植の最近の進歩にもかかわらず、急性拒絶反応は依然として臨床応用の大きな障壁となっています。急性細胞拒絶反応(ACR)および急性抗体介在拒絶反応(AMR)は、異種移植片受給者における早期移植片失敗の主な免疫応答です。非ヒト霊長類や遺伝子組み換え豚などの大型動物モデルは貴重な洞察を提供してきましたが、その利用は高コスト、倫理的制約、そして実験の大きなばらつきによって制限されています。小動物モデルは、免疫拒絶反応の機構的研究において実用的かつ再現性の高い代替手段を提供します。本研究では、ACRおよびAMRを特異的に模倣するために、2つの標準化されたマウス異種移植モデルが開発されました。再現性を確保し、オペレーターの変動を最小限に抑えるために、組み立てラインワークフローの構造化された3人手術プロトコルが導入され、高効率かつ高品質な一貫したモデル生成が可能となりました。その結果生まれたモデルは、臨床的異種移植拒絶反応の主要な免疫病理学的特徴を再現するだけでなく、免疫機構の調査や標的免疫抑制戦略の評価のための強力なプラットフォームを提供します。これらのモデルは異種移植療法の臨床前開発を加速させるのに役立ちます。

概要

異星移植は、移植のためのドナー臓器不足を解決する最も有望な戦略の一つとして浮上しています。近年、遺伝子編集技術、免疫調節戦略、生体医工学の急速な進歩により、^{この分野で大きな}進展が見られました。過去3年間で、世界中の複数の研究チームがヒトにおける異種移植に関する臨床試験を実施しており、メリーランド大学での遺伝子組み換え豚心臓移植の2例、マサチューセッツ総合病院での豚腎臓移植試験、ニューヨーク大学での胸腎移植試験が含まれます 2,3,4,5 .これらの前例のない進歩にもかかわらず、免疫拒絶反応は異種移植の臨床応用を制限する主要な課題であり続けています。高度に最適化された遺伝子組み換えドナー臓器と免疫抑制剤の併用治療があっても、拒絶反応は依然として大きな障害となります。現在の研究では、急性拒絶反応は異種移植における重要な障害であり、主に急性細胞拒絶反応(ACR)と急性抗体介質拒絶反応(AMR)に分類されます。ACRは主にT細胞によって媒介され、T細胞が移植片内に広範囲に浸潤することで組織損傷や機能障害を引き起こします。その基礎となるメカニズムは、異種遺伝子抗原の提示、T細胞の活性化、そして炎症性サイトカインの放出に関わる^6,7。これに対し、AMRは既に形成されたドナー特異的抗体や新たに生成されたドナー特異的抗体によって駆動されます。これらの抗体は移植片内の内皮細胞に結合し、補体活性化と強力な免疫応答を引き起こし、最終的には微小血管損傷、血栓症、^移植片不全を引き起こし^ます。したがって、これらの拒絶機構の深い理解と、より精密な免疫調節戦略の開発は、異種移植を前臨床研究から長期的な臨床応用へと進展させるために不可欠です。

異種移植における急性拒絶反応の課題に対処するためには、基礎研究と前臨床研究に立ち返り、その基礎となる免疫学的メカニズムを明らかにすることが不可欠です。大型動物モデル、特に非ヒト霊長類(NHP)や遺伝子組み換え豚は、解剖学的および生理学的に人間に近いことから、異種移植研究で広く利用されています。これらのモデルは、免疫拒絶反応のメカニズムや免疫調節戦略に関する重要な洞察を提供します。しかし、その適用は高コスト、倫理的配慮、そして術後長期ケアの複雑さによって大きく制約されています。さらに、個々のNHP間の免疫応答の大きなばらつきは^{実験結果の}再現性に影響を与え^ます。大型動物モデルは臨床翻訳に欠かせないものの、実験的実現可能性と一貫性の限界は、より費用対効果が高く、拡張性が高く、機構的に関連性の高い小動物モデルの緊急性を強調しています。

これらの課題を踏まえ、小動物モデルは低コスト、短い実験周期、そして大規模応用の容易さから異種移植研究においてますます重要性を増しています。これらのモデルは免疫拒絶機構の調査に不可欠なプラットフォームを提供するだけでなく、 in vitro 研究と大型動物実験をつなぐ重要な橋渡し役も果たし、免疫調節戦略のより正確な探求を促進します。本研究では、ACRおよびAMRを特異的に模倣する2つの標準化マウス異種移植モデルが確立されました。再現性と一貫性を確保するため、標準化された3人手術プロトコルと効率的な組み立てライン方式のモデル生成が導入されました。この標準化されたワークフローにより、操作者ごとの変動が最小限に抑えられ、非常に均一な心臓移植モデルが実現します。これらの改良は、機構調査や新規免疫抑制戦略の評価に信頼できるプラットフォームを提供します。このプロトコルは、異種移植の免疫機構に関する小動物研究や免疫抑制戦略の評価を行う研究者に特に適しています。低コスト、高い再現性、標準化されたワークフローといった利点があり、その後の大型動物および前臨床研究のための信頼性の高い実験的基盤を提供します。

プロトコル

このプロトコルは、1人のオペレーターまたは3人のチームによって実施でき、各メンバーはドナー心臓採取、レシピエント準備、ドナー心臓吻合をそれぞれ担当します。全手順は10分以内に完了し、迅速かつ高スループット、かつ標準化されたモデル生成を可能にします。

本研究の動物実験は、中国医学科学院扶外病院の動物ケア利用委員会(IACUC)により承認されました(承認番号0108-1-70-ZX(X)-41)。すべての手続きは動物福祉規則と倫理ガイドラインを厳格に遵守し、関連基準の遵守を確保しました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 術前準備

1. カフの準備
   1. 移植手術用のカフを製造するにはポリイミド管を使ってください。動脈カフには、内径0.3〜0.5mmのポリイミド管を選び、立体顕微鏡(10×–20×倍率)で2mmのセグメントに切断します。
   2. 各セグメントのクランプ部分を円周方向に半分に切断し、ハンドルのような延長部分を作ります。静脈カフには、内径0.4〜0.7mmのポリイミド管を選び、3mmのセグメントに切断します。同様に、クランプ部分を半分に切り取り、ハンドルのような延長部分を作ります。
      注意:カフを75%エタノールに30分間浸し、その後通常の生理食塩水でしっかりすすいでください。
2. マウス製剤:10〜12日齢の新生児Sprague-Dawley(SD)ラットをドナーに、C57BL/6または7〜8週齢のBalb/cマウスを受理者として使用します。適切なケアを確保しストレスを最小限に抑えるために、新生児ドナーラットは母ラットと一緒に輸送してください。すべての動物を特定の病原体フリー(SPF)環境で飼育しましょう。

2. ドナー心臓採取

1. 固定と麻酔
   1. 新生児ラットに対して、30 μL/gのトリブロモエタノール(Jitianbio, JT0781)を腹腔内注射 で 麻酔します(これは機関で承認されたプロトコルに従い)。
   2. 完全に麻酔が終わったら、ラットを仰向けにして立体顕微鏡で固定します。胸腹部はポビドンヨウ素浸しの綿球で消毒してください。
      注意:トリブロモエタノールは換気の良い場所で手袋と目の保護具を着用して取り扱ってください。皮膚への接触や吸入は避けてください。
2. ヘパリン化
   1. 胸腹部はポビドンヨウ素浸しの綿球で消毒してください。綿棒で腸をそっと横に動かし、下大静脈を露出させます。
   2. インスリン注射器を使って下腔静脈にヘパリン化生理食塩水(0.2–0.5 mL)を注射し、その後、綿球で注射部位を優しく圧迫して出血を防ぎます。
      注意:ヘパリン化生理食塩水の準備または注射時は手袋と目を保護すること。注射器は鋭利な廃棄物として処分する。医療用ナトリウムヘパリン(125 mg)を100 mLの生理食塩水に溶かしてヘパリン化生理食塩水を調製します。
3. 心停止
   1. 横隔膜を切開し、胸壁を両側に切り、心臓を完全に露出させるために引き戻します。胸腺を取り除く。上大静脈を切断して圧力を緩和し、ウィスコンシン大学(UW)の溶液1mLを大動脈に灌流して心停止を誘発します。
   2. 心臓が赤色から薄色に変わるまで灌流を続けます。同時に、氷で冷たい生理食塩水に浸したガーゼパッドを心臓の上に当て、温度を下げて脱水を防ぎます。
      注意:滅菌ガーゼは1cm×1cmに切り分け、氷で冷たい生理食塩水に浸してから使用してください。
4. ドナー心臓の採取
   1. 上大静脈と下大静脈を8–0シルク縫合糸で結紮し、それらを切断します。大動脈弓で大動脈を切り、肺動脈を分岐部で切断します。
   2. 最後に、すべての肺静脈を8-0で結紮しますシルク縫合とドナー心臓切除。採取した心臓は一時的に氷のように冷たい生理食塩水で保存してください。

3. 受領者の準備

1. 麻酔
   1. 同じ方法で投与マウスを麻酔し、安定させるために仰向けにします。
2. 消毒
   1. 除毛クリームで首の部分の毛を除去し、その後ポビドンヨウ素による皮膚消毒を行います。
3. 皮膚切開
   1. 眼科ハサミを使って、首の正中線の右約1cmに縦に2cmの切開を入れます。鈍的解離を行い、皮下脂肪と筋肉層を徐々に除去し、下顎下腺を切除します。
      注意:下顎下を切除する際は、出血を防ぐために8–0シルク縫合糸で結紮するか、電気焼灼ペンで焼灼する必要があります。
4. 外頸静脈の準備
   1. 外頸静脈を露出した後、低凝固モード(5〜10W)に設定した電気焼灼ペンで枝を個別に焼灼します。2位 8-0結紮のために静脈の遠位端付近に絹縫合を施します。
   2. 顕微外科用ハサミを使って、2つの結紮の間の外頸静脈を横断します。外頸静脈を静脈カフを通して挿入し、カフを静脈の根元に押し込み、血管クランプで固定します。
   3. 微小外科用ハサミで結紮部を除去し、ヘパリン化された生理食塩水で静脈内の残留血液を洗い流します。顕微外科的鉗子を使ってカフの外頸静脈を反転させ、8-0で固定します絹縫合。
      注意:電気焼灼ペンは慎重に操作し、火傷を避けるよう注意してください。外頸静脈には複数の支流があり、出血を最小限に抑えるために慎重に隔離・封鎖する必要があります。
5. 頸動脈の準備
   1. 胸鎖乳突筋の後方に鈍的解離を行い、頸動脈鞘を見つけます。頸動脈鞘を開き、総頸動脈を内頸静脈および迷走神経から慎重に分離します。
   2. 静脈と同じ方法で動脈を結紮し、横断します。動脈カフを通して切断動脈の下端を挿入し、反復挿入して固定します。
      注意:頸動脈、内頸静脈、迷走神経は頸動脈鞘内に収められています。鞘を開ける際は迷走神経を損傷しないように注意してください。頸動脈は外頸静脈よりも直径が小さいものの、より弾力性が高く、静脈よりも後退が難しいです。

4. ドナー心臓吻合

1. 大動脈から頸動脈への吻合
   1. ドナーハートをトリミングした後、すぐに受領マウスの首に挿入します。8-0を使え絹糸縫合で緩い結び目を作ってドナー大動脈の周りにループを作ります。
   2. ドナー大動脈を受付者の頸動脈の動脈カフに滑り込ませ、8-0で固定しますシルクのリガチャー。
      注意:大動脈を固定する際は、結紮部位と受血者の血液が直接接触しないように、頸動脈結紮線の上に縫合糸を結ぶべきです。
2. 肺動脈から外頸静脈への吻合
   1. 8-0を使えドナー肺動脈の周りにループを作るために緩い結び目を作った絹糸の縫合です。肺動脈を受血者の外頸静脈の静脈カフに滑り込ませ、8-0で固定しますシルクのリガチャー。
3. 心臓再開
   1. 受助者の頸動脈と外頸静脈の血管クランプを外し、血流を回復させます。ドナー心臓が強い収縮を再開し、10秒以内に急速に赤色に変わるのを観察してください。
4. 切開部の閉鎖
   1. ドナー心臓が安定したリズムを取り戻したら、位置を調整し、4-0縫合糸で受領者の首の皮膚切開部を閉じます。手術部位をポビドンヨウ素で消毒してください。

5. 術後ケア

1. 術後鎮痛
   1. 皮膚の閉鎖が終わったら、痛みの緩和のためにリドカインジェルを外用してください。マウスに明らかな痛みの兆候が見られた場合は、腹腔内注射 で メロキシカム(2 mg/kg)を投与します。
      注:メロキシカムは10%のDMSOと90%のトウモロコシ油に溶解しており、注射量は必要な用量に基づいて計算されます。
2. 回復
   1. マウスを37〜38°Cの温かい柔らかいパッドの上に置き、体温を保ちながら意識を取り戻すまで観察します。完全に目が覚めたら、ネズミを個別にケージに入れ、十分な餌と水のアクセスを確保してください。
3. モニタリング
   1. 移植された心臓を毎日目視検査と触診で監視し、拍動や移植片全体の生存可能性を評価してください。
      注意:すべての処置は適切なPPEを用いて行い、機関のバイオセーフティおよび動物ケア規則を遵守してください。実験中に生成されたすべての化学残留物、香料、動物組織は、機関の規則に従って収集・処分されるべきです。トリブロモエタノールまたはヘパリンを含む溶液は有害化学廃棄物として扱い、動物組織や血液由来物質は生物廃棄物として取り扱い、オートクレーブで滅菌するか、認定施設で廃棄されるべきです。

結果

図1 は、マウス異種移植モデルを作成するための標準化された3人共同作業フローを示しています。このシステムでは、3人のオペレーターが並行して作業し、それぞれ指定された作業(レシピンの準備、ドナー心臓の調達、ドナー心臓吻合)を繰り返し行います。この分担により、10分ごとに1つの完全な移植モデルを完成させることが可能です。1人のオペレーターは1つのモデルを約30分で完成できますが、3人で行うワークフローにより、同じ時間内に3つのモデルを完成させることが可能です。効率は同等に見えますが、協働ワークフローは個々の手術技術に伴うばらつきを最小限に抑えることで一貫性が優れています。対照的に、3人の外科医が独立して全手術を行う場合、操作者ごとの差異はモデルの質や再現性に大きな影響を与えます。この効率的でタスク特化したアプローチは、手続きの安定性を高め、マウス異種移植モデルの大規模かつ標準化された生産を支援します。

表1は 、3人と1人での...

ディスカッション

マウス異種移植は非常に侵襲的な手技であり、操作者に高度な技術力と一貫性が求められます。モデル確立時、オペレーターは実験結果に大きな影響を与えます^14,15。単一作業では、手順の複雑さと長さのため、モデルあたり約30分の操作時間となり、効率が低くなります。さらに、解剖学的解離、血管の取り扱い、吻合技術の個人差は移植成功率や移植片生存率にばらつきを生み、データの再現性や信頼性に影響を与えます。たとえ3人のオペレーターが独立して全手順を行っても、個人の技術や経験の不一致が避けられない実験ミスを引き起こす可能性があります。この問題に対処するため、3人による共同ワークフローが導入され、各オペレーターはドナー心臓採取、レシピエント準備、ドナー心臓吻合など特定のステップに専念しました。この分業により、総手術時間は約10分に短縮され、効率が大幅に向上します。さらに、各オペレーターが同じステップを繰り返し行うことで、手続きの正確性と一貫性が向上し、オペレーター依存の変動を...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗CD3抗体	Abcam	ab16669
抗CD68抗体	Bioss	bs-1432R
DAPI	Thermofisher	P36971
脱毛クリーム	Veet	-
電気焼灼ペン	Yuyan Instrument	-
蛍光二次抗体	Thermofisher	A-11008
HE染色キット	Beyotime	C0105S
製氷機	Shjingmi	IMS-20
インスリン注射器	KDL	U-40
リドカインゲル	Tide Pharm
メロキシカム	Sigma-Aldrich	444800
マイクロサージカル鉗子	ZHENHAO	FS217
マイクロサージカル針ホルダー	BIOFIVEN	HH01231
マイクロサージカルはさみ	ZHENHAO	FS237
生理食塩水	Kelun Pharmaceutical	-
ポリイミドチューブ	Guangzhou Wanlixin Metal Products Co., Ltd.	-	内径: 0.3-0.5 mm
ポリイミドチューブ	Guangzhou Wanlixin Metal Products Co., Ltd.	-	内径: 0.4-0.7 mm
ポビドンヨード溶液	INOHV	-
ヘパリンナトリウム	Qianhong bio-pharma	-
ステレオマイクロスコープ	Murzider	MSD204
外科用縫合糸	Jinhuan Medical	8-0および4-0の絹縫合糸
手術用温熱パッド	Hani Pet	-
トリブロモエタノール	Jitianbio	JT0781
ウィスコンシン大学溶液	Belzer	-
血管クランプ	RWD Life	R31005-10