研究記事

非小細胞肺がん変異の精密検出のためのマイクロドロップレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応

DOI：

10.3791/68770

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2025年7月29日

 ,  ,  ,  , 
1The 2nd Department of Thoracic Surgery, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University

この記事について

サマリー

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ここでは、液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応(ddPCR)を使用してEGFR T790M変異を高感度かつ特異的に検出するプロトコルを提示し、G719S、L858R、L861Q、S768Iなどの他の腫瘍変異を迅速に同定するために拡張することもできます。

要約

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世界規模では、肺がんは引き続きがん関連死亡の主な原因であり、その有病率は腎臓がんに次いで 2 番目に高まっています。非小細胞肺がん (NSCLC) は、報告されたすべての肺がん症例の約 80-85% を占めています。EGFR 遺伝子の T790M 変異は、上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤 (EGFR-TKI) に対する後天性耐性の主要な決定要因として広く認識されています。この状態の存在は、進行性疾患を経験している人の約50〜60%で観察されています。したがって、EGFR 遺伝子の T790M 変異を検出するための迅速かつ応答性の高いアプローチの実装は、非小細胞肺がんの迅速な同定に不可欠です。現在の研究では、ddPCR を使用して T790M 変異を検出し、qPCR の感度 (1 × 102 コピー/ μL) の 10 倍の検出限界で検出しました。15のシミュレートされたサンプルについて、ddPCRはEGFR遺伝子のT790M変異の存在を検出することができ、qPCRを使用して分析するとレベルが低下することが観察されました。EGFR遺伝子内のT790M変異を高速検出法で検出し、その適合性を判断するために研究されています。

概要

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肺がんは、世界的にがん関連死亡の主な原因であり、全体で 2 番目に多い悪性腫瘍です。非小細胞肺がん(NSCLC)は、報告されたすべての肺がん症例の約80%から85%の大部分を占めています1,2,3,4。EGFR変異を有する進行性NSCLCと診断された患者の場合、確立された治療アプローチには、第1世代、第2世代、または第3世代の上皮成長因子受容体(EGFR)チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)の適用が含まれます5,6,7。しかし、第 1 世代または第 2 世代の EGFR-TKI で治療されたほとんどの患者は、最終的に薬剤に対する後天性耐性を発症します。この耐性は、疾患の進行を経験している患者の約50〜60%に見られるEGFR遺伝子のT790M変異の存在に起因することがよくあります8,9,10,11,12。

従来、組織サンプルからの腫瘍DNAの遺伝的異常は、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)や次世代シーケンシング(NGS)などの技術を使用して同定されていました13,14。しかし、組織生検は、腫瘍にアクセスできない、患者の健康状態が悪い、または腫瘍細胞の含有量が不十分であるため、困難な場合があります 15,16,17。代替案として、特に血漿からのリキッドバイオプシーは、循環腫瘍 DNA (ctDNA) を検出することにより、ドライバー変異を特定する侵襲性の低い方法を提供します。腫瘍細胞はDNAを血流、胸水、唾液、または糞便に放出し、遺伝子解析のための貴重な情報源を提供します18,19。ctDNA の遺伝的プロファイルは多くの場合、腫瘍の遺伝子構成を反映しており、正確な診断と個別化されたがん治療にとって重要な要素である腫瘍の不均一性を包括的に把握できます20,21。

シーケンシング、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、デジタルPCR、変性高速液体クロマトグラフィー(DHPLC)、増幅難治性変異システム(ARMS)、変異体濃縮PCR(ME-PCR)など、末梢血中のEGFR変異を特定するためのさまざまな技術の中で、マイクロドロップレットデジタルPCR(ddPCR)は、ctDNA変異検出のための非常に効果的なツールとして浮上しています22,23.その優れた感度、精度、および存在量の少ない変異を高精度で検出する能力は、他とは一線を画しています。従来のPCRとは異なり、ddPCRはサンプルを数千の液滴に分割するため、標準曲線なしで標的DNA配列の絶対定量が可能になります。これにより、EGFRのT790M変異のようなまれな変異の検出に非常に適しています。ddPCR の利点にもかかわらず、その広範な臨床応用は、サンプル前処理、システムの最適化、qPCR などの確立された技術との性能比較分析における課題によって制限されてきました。ctDNA 変異検出のための ddPCR プロトコルの最適化には、特に臨床導入に不可欠な感度、特異性、再現性に関して重大なギャップが存在します。

この研究では、ddPCR は、従来の qPCR 法と比較して、ctDNA の EGFR T790M 変異を検出するための優れた感度と信頼性を提供するという仮説を立てています。私たちは、効率を高めるために核酸抽出プロセスを最適化することに重点を置き、続いて変異検出のためのddPCR最適化を行いました。さらに、シミュレートされたサンプルを使用して、感度、特異性、再現性の観点からddPCRとqPCRの性能を比較しました。ddPCR の可能性を体系的に評価することで、リキッドバイオプシーにおける EGFR 変異検出のための qPCR に代わる実行可能で優れた代替手段として ddPCR を確立することを目指しています。

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プロトコル

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この研究には、人間の参加者、人間の組織、または生きた動物実験は含まれていませんでした。したがって、正式な倫理的承認は必要ありませんでした。すべての手続きは、制度的および国のガイドラインに従って実施されました。T790M変異プラスミドは商業的に合成されました。臨床サンプルのシミュレーションに使用される豚の血液は、生きた動物の関与なしに、動物福祉規制に従って認定されたサプライヤーから入手されました。磁気ビーズ、プライマー、プローブ、PCR酵素など、他のすべての試薬は市販され、メーカーの指示に従って使用されました。

核酸抽出
磁気ビーズ抽出キットと全自動核酸抽出装置を用いて核酸抽出を行いました。標準的な手順では、200 μL のサンプルと 20 μL のプロテイナーゼ K を、プレパックされたディープウェルプレートのカラム 1 または 7 に加えました。次に、キットに付属の磁気ビーズ15 μLをカラム2または8に添加しました。抽出プログラムは、磁気スリーブを指定された位置に配置して、機器上で開始されました。抽出後、カラム6または12の液体を新しい1.5 mLヌクレアーゼフリーチューブに移し、-20°Cで保存しました。

低濃度の標的核酸の抽出を最適化するために、最適化実験を実施しました。推奨される抽出パラメータは、溶解温度70°C、溶解時間10分、3つの洗浄液それぞれ1分、乾燥2分、および56°Cでの3分溶出でした。 最も影響力のあるパラメータは、溶解温度(62°C、66°C、70°C、74°C、および78°C)、溶解時間(1、3、5、7、および9分)、および磁気ビーズサイズ(100 nm、200 nm、300 nm、400 nm、500 nm、および1000 nm)を体系的に最適化しました。これらの最適化は、T790M変異プラスミドを1×105 コピー/μLで使用して実行しました。100 nmの磁気ビーズは抽出キットに付属し、その他の粒子サイズはバイオテクノロジー企業から入手しました。抽出されたサンプルのqPCR増幅曲線とCt値を分析することにより、各抽出条件の効率を評価しました。これらの結果の統計分析は、統計ソフトウェアを使用して実行されました。

標準プラスミドDNA
EGFR遺伝子のT790M変異プラスミドは、バイオテクノロジー企業によってカスタム合成されました。4マイクログラムの乾燥プラスミド粉末を100 μLの1x TEバッファーに再懸濁しました。プラスミド濃度は、分光光度計を使用して測定されました。マイクロリットルあたりのコピー数は、次の式を使用して計算されました:コピー数/μL = [(6.02 × 1023)×(DNA濃度(ng / μL)×10-9)] / (塩基対のDNA長×660)。合成フラグメントの濃度は1.26×109 コピー/μLでした。次に、このストックプラスミドを126倍に希釈して、1 × 108 コピー/μLの作業濃度を得ました。

プライマーの設計と合成
EGFR T790M変異のプライマーとTaqManプローブは、標準的なプライマー設計原則に基づいてPrimer 6を使用して設計されました。上流プライマー:5'-CCTCACCTCCACCGTGC-3';下流プライマー24:5'-AGGCAGCCGAAGGGCA-3';プローブ:5'-FAM-AGCTCATCACGCAGCTCA-BHQ1-3'。すべてのプライマーとプローブは、市販のオリゴヌクレオチド合成サービスによって合成されました。

ddPCRおよびTaqMan蛍光定量検出システムの確立と最適化
ddPCRおよびqPCRシステム最適化実験で使用するために、1× 108 コピー/μLのT790Mプラスミドストックを1× TEバッファーを使用して1 × 106 コピー/μLに希釈しました。

ddPCR システムの最適化: ddPCR システムは、酵素メーカーの推奨に基づいて最適化されました。最初に推奨されるシステムには、7.5 μLの4x PCRミックス、1.2〜3 μLの上流プライマー(10 μM)、1.2〜3 μLの下流プライマー(10 μM)、0.3〜1.8 μLのプローブ(10 μM)、1〜15 μLのDNAテンプレート、およびヌクレアーゼフリー水が含まれていました。推奨される増幅サイクルは、95°Cで最初の10分間、その後94°Cで30秒、55〜65°Cで60秒の40サイクルでした。 アニーリング温度(55-61.8°C)、プライマー濃度(1-3 μL)、プローブ濃度(0.75-1.75 μL)、およびテンプレート濃度(3-15 μL)を体系的に最適化しました。最適化結果は、統計ソフトウェアを使用して統計的に分析されました。

qPCRシステムの最適化:qPCRシステムは、酵素メーカーの推奨に従って最適化されました。最初に提案されたシステムには、5 μLのTaqポリメラーゼ、0.45 μLの250 mM MgCl2、0.5〜2.5 μLのフォワードプライマー(10 μM)、0.5〜2.5 μLのリバースプライマー(10 μM)、0.5〜2.5 μLのプローブ(10 μM)、5 μLのDNAサンプル、およびヌクレアーゼフリーの水が含まれていました。推奨される増幅プログラムは、95°Cで5分でした。続いて、95°Cで15秒、56〜64°Cで30秒の45サイクルが続き、56〜64°Cで蛍光収集を行います。 アニーリング温度(56-64°C)、プライマー濃度(1-3 μL)、プローブ濃度(0.5-2.5 μL)、およびテンプレート濃度(1-5 μL)を最適化しました。これらの結果の統計分析は、統計ソフトウェアを使用して実行されました。

ddPCRおよびTaqman蛍光定量PCR感度試験
ddPCRとqPCRの感度を評価するために、1 × 108 コピー/μL T790Mプラスミドを1x TE Bufferを使用して10倍に連続希釈し、106 〜101 copies/μLの範囲の濃度勾配を作成しました。ddPCRでは、最適化されたddPCRシステムに従って、ネガティブコントロールを含む各濃度に1つずつ、7つの反応溶液を調製しました。サンプルをマイクロ液滴発生器チップにロードし、液滴生成装置で処理してマイクロ液滴を生成しました。次に、これらの液滴をPCRサーマルサイクラーを使用して増幅し、その後デジタルPCR検出装置で分析しました。同時に、最適化されたqPCRシステムに基づいて、同一のテンプレートを使用して7つの反応溶液を調製しました。これらはリアルタイム PCR 装置で実行され、2 つのアプローチのそれぞれの感度が評価されました (n = 3)。

ddPCR再現性試験
再現性を評価するために、標準的なT790MプラスミドDNAを1×108 コピー/μLで希釈して、高濃度(1 × 106 コピー/μL)、中濃度(1 × 104 コピー/μL)、および低濃度(1 × 102 コピー/μL)の標準物質を生成しました。最適化されたddPCRシステムに従って6つの反応溶液を調製しました。サンプルをマイクロ液滴発生器チップにロードし、液滴生成装置で処理してマイクロ液滴を形成しました。次に、微小液滴をサーマルサイクラーを使用して増幅し、デジタルPCR検出装置で分析しました。陰性対照が含まれていました。実験は3回に分けて実施されました。再現性は、増幅プロファイルを比較し、3つの実験反復からの変動係数(CV)値を計算することによって評価されました。

アナログサンプル試験
T790M 変異 ddPCR および qPCR システムの信頼性をテストするために、豚の血液をそれぞれ高濃度と低濃度の T790M 変異標準プラスミドをランダムに混合し、標準プラスミドを混合していない豚の血液を陰性サンプルとして使用し、15 個の模擬サンプルをランダムに調製し、模擬サンプルから核酸を抽出しました。 それぞれddPCR法とqPCR法を使用して検出されます。

統計分析
すべての実験は、少なくとも3回の技術的反復で実施されました。データは平均±標準偏差 (SD) として表示されます。統計分析は、GraphPad Prism 10 ソフトウェアを使用して実施されました。グループ間の差は、必要に応じてスチューデントの t 検定または一元配置分散分析 (ANOVA) を使用して分析されました。0.05未満のp値は統計的に有意であると見なされました。

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結果

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核酸抽出の最適化
EGFR T790M変異を検出するためのddPCRベースのワークフローを 図1に概略的にまとめます。まず、最適な溶解温度を決定しました。 図2Aに示すように、66°Cの切断温度は最小の平均Ct値を生成し、最も効率的な切断を示しています。したがって、その後の実験のために66°Cが選択されました。次に、決定された最適温度である66°Cでの溶解時間を最適化しました。 図2B は、切断時間が7分の場合、他の期間と比較して平均Ct値が最も低くなり、7分が最適な切断時間として確立されたことを示しています。最後に、最適化された溶解条件(66°Cの切断温度と7分間の切断時間)でさまざまな磁気ビーズの粒子サイズを評価しました。 図2C は、核酸抽出キットに付属の100 nm磁気ビーズが最小の平均Ct値を生成したことを示しています。これは、100 nm 磁気ビーズ...

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ディスカッション

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肺がんは、世界中のがん関連死亡の主な原因として、常に医学研究の焦点となっています。この研究では、肺がんの複数の重要な側面を調査し、肺がんの診断、治療、予後についてより深い洞察を提供することを目指しています。肺がんの正確な診断と治療の基礎は、正確な遺伝子検査です。Zhao et al.25 によって実証されたように、従来の遺伝子検査は高品質の組織サンプルに大きく依存しており、費用と時間がかかります。アノテーション不要のディープラーニング人工知能アプローチを使用してチームによって開発された DeepGEM モデルは、肺がん遺伝子検査に新たな方向性をもたらし、腫瘍遺伝子変異とその空間分布のより正確でタイムリーかつコスト効率の高い予測を可能にします25。この成果は、肺がん研究において、既存の診断および治療プロセスを最適化するための学際的な技術的アプローチを積極的に模索する必要があることを示唆しています。

肺がん遺伝子変異検出の分...

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開示事項

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著者には宣言すべき利益相反はありません。

謝辞

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雲南省科学技術局と昆明医科大学応用基礎研究共同特別プロジェクト、202101AY070001-134

著者の貢献
Youming Lei と Guoli Lv はこの研究に等しく貢献し、共同筆頭著者です。Youming Lei と Guoli Lv がこの研究を考案し、設計しました。Qingmei Yangはデータの収集と分析に貢献しました。Jin Duan と Yunfei Shi は、データの分析と解釈を監督し、原稿を改訂し、出版する最終版を承認しました。すべての著者は最終原稿を読み、承認しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1×TE BufferSangon BiotechB548144Tris-EDTA バッファーは DNA 希釈に使用されます
。Unimix-U 酵素ミックスターゲティングOne BioUNIMIXU-4XddPCR 酵素ミックス
A300 高速サーマルサイクラーLongGeneA300PCR 増幅
バイオチップ分析装置SEED BioDigitalPCR-Biochip デジタル PCR用検出システム
サンプル調製装置Xinyi Biotechnologyデジタル PCR プラットフォーム TD-2マイクロドロップレットの調製
磁気ビーズ核酸抽出キットLemnisCare TechnologyMXP-1005核酸抽出マイクロ
ドロップレット発生チップTargetingOne BiotechMG-Chip-01ddPCR 用のマイクロドロップレットの生成に使用
NanoDropAllshengNC-500サンプル抽出後の核酸濃度測定
NanoDrop ND-500 分光光度計Allsheng機器ND-500DNA定量用分光光度計
PCR装置 A300 高速サーマルサイクラーLongGeneA300PCR増幅用サーマルサイクラー
プライマーおよびTaqManプローブSangon BiotechT790M検出用カスタム合成プライマーおよびTaqManプローブ
qPCR装置 Gentier miniTianlong TechnologyGentier miniリアルタイムPCR機器
T790M 突然変異プラスミドTsingke 生物学T790M標準曲線および検出限界試験
ドロップマーカー用

参考文献

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