方法論記事

MASLDマウスからの肝細胞の単離と培養のための簡単なプロトコル

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DOI：

10.3791/68782

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2025年7月18日

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1Department of Endocrinology, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, 2Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China

この記事について

サマリー

この研究は、代謝機能障害関連脂肪性肝疾患(MASLD)マウスから初代肝細胞を単離するための標準化されたプロトコルを確立し、人工的な脂質負荷なしで脂肪症と代謝機能障害の疾患関連研究を可能にします。この方法は、機構的および治療的研究に適した高収量および高生存率の肝細胞をもたらします。

要約

代謝機能障害関連脂肪性肝疾患 (MASLD) は、肝細胞内の病理学的脂質蓄積 (脂肪症) を特徴とし、世界的に重大かつ増大する健康負担を表しています。初代マウス肝細胞培養物は、MASLDの病因解明や治療介入に不可欠な ex vivo モデルとして機能します。しかし、脂肪性肝臓から高品質の肝細胞を確実に単離することは、依然として技術的に困難です。ここでは、コラゲナーゼ灌流技術を使用してMASLDマウスから初代肝細胞を効率的に単離するための簡単なプロトコルを紹介します。このプロトコルは、パルミチン酸およびオレイン酸の補給による人工的な誘導を必要とせずに、固有の脂肪症を示す肝細胞を生成し、それにより、より生理学的に関連性のある表現型を保存します。このプロトコルは、非常に生存率が高く、高純度の肝細胞を得られ、MASLDマウスから大量の肝細胞を単離するために普遍的に適用できます。さらに、薬理学的評価や遺伝的介入研究にも適しています。要約すると、私たちは、MASLDの新規治療標的と薬剤の発見を促進するために、下流の細胞生物学的研究のために、高収量、高純度、および高生存率の肝細胞を単離するための再現性のあるプロトコルを提供します。

概要

代謝機能障害関連脂肪性肝疾患(MASLD)は、肝細胞における病理学的脂質蓄積を特徴とし、世界で最も蔓延している慢性肝疾患です1。MASLDは、世界の成人人口の38%が罹患していると推定されており、人間の健康に対する重大な脅威となっています2。MASLDのメカニズムは完全には解明されておらず、治療の選択肢は非常に限られています。MASLDの新たな治療標的の発見と標的薬の開発は、臨床上の重要なニーズとなっています。肝細胞は、肝臓を構成する主要な細胞型として、肝臓のグルコース-脂質-薬物代謝の主要な部位です。初代肝細胞は、肝細胞株よりも肝細胞の機能を完全に保持しており、肝疾患のメカニズムや医薬品開発の研究に有用なツールである3。脂肪肝マウスからの初代肝細胞の単離と培養は、脂質代謝、インスリン抵抗性、炎症反応などの肝病態生理学を研究するための基本的な手法です。脂肪肝疾患のマウスモデルからの肝細胞単離のために確立された以前のプロトコルでは、正常な肝細胞集団と脂質蓄積性肝細胞集団の両方の分離を特異的に可能にするために勾配遠心分離が採用されていました。したがって、これらの単離された脂質を含む肝細胞は、脂肪肝疾患の病態生物学を研究するための重要な in vitro モデルシステムを構成します3。このアプローチの主な目標は、疾患特異的な表現型の特徴を保持し、 したがってin vitroでMASLDを模倣できる、生存率が高く、収量の高い肝細胞を簡単かつ経済的に取得することです。

マウスにおける肝細胞単離の一般的な手順は、ハンク平衡塩溶液(HBSS)などの等張性灌流溶液で肝臓から血液を洗い流すことから始まり、次にコラゲナーゼ含有消化液を使用して肝臓を消化する2段階のプロセスで構成されています。近年の肝臓灌流および酵素消化技術の進歩により、雌マウスの初代肝細胞の収量と生存率が向上しています4。バッファー組成の最適化や消化時間の短縮など、従来の2ステップコラゲナーゼ灌流法の改善は、実験プロトコルを脂肪肝サンプルに適合させる上で重要でした。初代肝細胞は、MASLDとその心血管代謝合併症の根底にある病態生理学的メカニズムを解明するための不可欠なモデルとして機能し、特に内皮メディエーターや血管新生因子を介して心-肝臓のクロストークや肝臓-血管軸の相互作用を媒介する役割を通じて、5,6。これらの細胞は、MASLD、慢性腎臓病、虚血性心疾患7の臨床的関連からも明らかなように、疾患の進行を促進する多臓器コミュニケーションネットワークに関する重要な洞察を提供するとともに、メタボリックシンドロームの肝臓症状と心血管症状の両方に対処する標的療法を開発するための生理学的に適切なプラットフォームを提供します。MASLDの現在のin vitro研究は、主にパルミチン酸/オレイン酸(PA/OA)刺激された正常肝細胞またはヒト肝細胞株(HepG2およびHuh7など)に依存しており、これらは疾患条件下での脂肪性肝細胞の病態生理学的特徴を不適切に再現するため、心臓-肝臓-血管相互作用の研究における翻訳的関連性が制限されています。このアプローチでは、MASLDの進行に特徴的な慢性代謝機能障害、炎症性微小環境、および疾患特異的な臓器間クロストークを捉えることができません。

このプロトコールは、パルミチン酸およびオレイン酸処理を人工的に追加することなく、MASLDマウスから肝細胞を単離するために使用できます。結論として、MASLDの新たな治療標的の発見と医薬品開発を支援するための下流の細胞生物学研究に適した、優れた生存率を持つ高収量肝細胞を得るためのシンプルで再現性の高い方法を提示します。

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プロトコル

すべての実験ステップは、中国科学技術大学の動物実験委員会(IACUC)によって承認されました。本研究では、雄のC57BL/6Jマウスに高脂肪食 (HFD, #12492, Research Diet) を12週間以上与えました。

1. コラーゲンコーティングされた培養プレートまたはディッシュの調製

  1. 15 mL 100% EtOHを35 mLの二重蒸留H2O(ddH2O)に加えます。I型コラーゲン50μg/mLの溶液を30%EtOH溶液に調製します。滅菌済みの0.22μmフィルターチップでろ過します。
  2. 細胞培養プレートまたはディッシュに、1cmあたり30μLのコラーゲン溶液を塗布します2。室温(RT)で1時間インキュベートします。
  3. ピペットで余分な液体を取り除き、培養プレートまたはディッシュを乾燥させます。コーティングされた皿に紫外線を0.5時間照射して滅菌します。4°Cで1か月未満保管してください。
    注:UVランプの波長は254nmで、UV強度は400 mw / m2以上です。コラーゲンコーティングされた皿からのUVランプソースの距離は1mです。

2.灌流液の調製

  1. 肝細胞を単離する数日前に、 表1に規定されている肝細胞単離試薬および培地を調製します。滅菌済み0.22μmフィルターチップを備えたフィルター灌流溶液AおよびB。4°Cで1か月未満保管してください。ウォーターバスを用意し、温度を37°Cに設定します。
  2. 灌流溶液AとBを37°Cのウォーターバスで予熱します。 手術前に、40 mgのコラゲナーゼIV型を80 mLの灌流溶液Bに加えます。.
  3. RTの蠕動ポンプを使用して、75% EtOHを4 mL/minの速度で5分間ポンプで汲み上げ、ポンプチューブを75% EtOHから予熱した灌流溶液Aに切り替えます。
    注意: 図1Aに示す構成に従って、加熱された循環充填ユニットを組み立てます。

3. 外科的処置

  1. 承認された方法を使用してマウスに麻酔をかけます。ペントバルビタールナトリウム(50 mg / kg)を腹腔内に注入します。.先に進む前に、回転反射の喪失を確認してください。
  2. マウスの上肢と下肢を解剖ボードに固定します。手術部位を75%アルコールで滅菌します。
  3. 解剖器具を使用して内腹膜と外腹膜を切断します。内臓臓器を綿棒でマウスの左側に回転させ、下大静脈(IVC)と肝門脈(PV)を露出させます。
  4. 下大静脈を綿棒で押して膨らませます。22Gの留置針を下大静脈と平行に挿入します。
  5. 留置針の鉄部分を引き抜きます。カテーテルを下大静脈に残します。0.22 μmのフィルターチップで針を灌流ラインに接続します。
    注:留置針は、鉄針部分とプラスチック製カテーテル部分で構成されています。下大静脈に正確に挿入し、留置針が血液でいっぱいになるまで待ちます。留置針からすべての気泡を取り除きます。血栓症を避けるために、すべての手順を迅速に完了してください。
  6. 灌流速度を5 mL/minの灌流液A.にセットし、灌流を開始し、肝臓が腫れるまで観察します。すぐに門脈を切断します。
  7. 綿棒を使用して肝臓を優しくマッサージし、血液が完全に洗い流されるようにします。肝臓が土のような黄色に変わるまで灌流を続けます。
  8. 0.05% コラゲナーゼ IV 型を含む灌流液 B に切り替えます。肝臓が完全に消化されるまで灌流を続けます。
    注:肝臓が消化されるまでに、マウスあたり少なくとも10分かかります。コラゲナーゼを含む灌流液Bの量80 mLは、マウス1匹が肝臓を消化するのに十分です。肝臓組織は、最大の軟化を達成するまで完全な酵素消化を受け、被膜で囲まれた実質は、機械的破壊を受けやすい極度の脆弱状態に達します。
  9. マウスの腹部から肝臓を取り出します。DMEMが入った10cmの皿に肝臓を入れます。
  10. バイオセーフティキャビネットで進めます。ピンセットを使用して肝臓を粉末に細断します(消化の良い肝臓は肝細胞を簡単に放出します)。
  11. 懸濁液を70 μmメッシュフィルターでろ過し、滅菌済みの50 mL遠心分離チューブに入れます。DMEM培地で容量を45 mL(マウスあたり)に調整します。
  12. 50 × g で4分間遠心分離します。上清を完全に注ぎます。
  13. ペレットをDMEM培地で最終容量25 mL(マウスあたり)に再懸濁します。再度、50 × g で2分間遠心分離します。
  14. 上清を完全に注ぎます。10% FBSを添加した25 mLの培地にペレットを再懸濁します。
  15. サスペンションをよく混ぜます。細胞をトリパンブルーで染色してカウントします。すぐに培養のための接種に進みます。
    注:ウェルあたり2個×10個の5 細胞を含む2mLの培地をコラーゲンコーティングされた6ウェル皿に入れます。細胞接種の2時間後にDMEM培地を交換してください。

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結果

現在のプロトコルは、HFDを12週間以上供給した雄のC57BL/6Jマウスに実施されました。単離された初代肝細胞の形態と機能を調べました。我々は、約40gのマウス肝臓からの単離あたり平均2×107 細胞の収量を得た。細胞生存率は、生細胞のカルセインAM染色により85%〜86%であると決定されました。各食餌性肥満(DIO)マウス単離からの収量は、15枚の標準6ウェルプレートを播種するのに十分でした。 図1B-Gは、DIOマウスにおける初代肝細胞の単離と培養の代表的な結果をグラフで示しています。 薬力学および肝臓病態生理学研究でマウス肝細胞が広く使用されていることを考慮して、薬理学的および生物学的応答プロファイリングを通じて、単離された細胞の脂質低下効果を具体的に評価しました。

DIOマウスの初代肝細胞のオイルレッドO染色およ...

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ディスカッション

生存可能なマウス肝細胞の単離には、血液成分を除去するための等張溶液を用いた徹底的な血管灌流から始まり、活性コラゲナーゼ溶液9,10による制御された酵素消化に続く重要な2段階の手順が含まれます。単離が成功するかどうかは、プロセス全体を通じて最適な生理学的条件、特に灌流溶液の安定した温度(37°C)およびpH(7.2-7.4)を維持することにかかっています。これらのパラメータは細胞の生存率を直接決定します11,12。最初の灌流中の完全な血液クリアランスは、その後の効果的な組織消化に不可欠です。酵素相には、活性が確認された新たに調製されたコラゲナーゼが必要であり、消化時間は慎重に制御され、細胞の完全性を維持しながら完全な組織解離を達成します。滅菌綿棒を使用した穏やかな機械的支援により、消化の均一性が向上します。この手順では無菌性の維持が重要であ...

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開示事項

著者らは、潜在的な利益相反を報告していない。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会[No.82373967]の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
50 mL滅菌遠心分離管Nest602052
抗HNF4&α抗体ImmunowayYM8517
IgG抗体Proteintech30000-0-AP
BODIPYThermo Fisher ScientificD3922
CaCl2Merck (SigmaAldrich)C5670
遠心分離機サーモ Sorvall ST16R
コラーゲン タイプ I Corning354236
Collagenase、タイプ 4Sangon BiotechA004186-0001
拘留針BRAUN4254074B
Dulbecco の改良イーグル培地 (DMEM)GibcoC11995500BT
EGTAYeasen60339ES10
エタノールメルク (SigmaAldrich)493511
ウシ胎児血清グマF2442
グルコースメルク (シグマアルドリッチ)G7021
HEPESギブコ15630080
イソギンゲチン MedChemExpressHY-N2117
K2HPO4 メルク (Supelco)PHR2900
KClメルク (SigmaAldrich)P3911
Na2HPO4 ·12H2Oメルク (シグマアルドリッチ)04273
NaClメルク (シグマアルドリッチ)S9888
NaHCO3メルク (シグマアルドリッチ)S6014
ニードルフィルター 0.22µMMillex-GPSLGV033RB
ナイル レッドインビトロゲンN1142
ペニシリン/ストレプトマイシン (100X)Gibco15140122
組換えアデノウイルスObio Technology Corp., ltd. Flagタグ付きマウスIER2(Ad-Ier2、NM_010499.4)と対照アデノウイルス(Ad-NC)をコードする組換えアデノウイルスは、Obio Technology Corp., Ltd.によって構築されました。
ペントバルビタールナトリウムメルク(SigmaAldrich)P3761
菌細胞ストレーナー、100&μ;mフィッシャーサイエンティフィ22363549
トリパン ブルービヨタイムST2780-5g
可変流量蠕動ポンプロングBT100-1F
抗シ滅ック

参考文献

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