ミニバイオリアクターアレイ(MBRA)の組み立てと使用のためのプロトコルの更新

Summary

ミニバイオリアクターアレイ(MBRA)は、複雑な微生物群集の培養を可能にするハイスループットでカスタマイズ可能な連続フロー培養システムであり、マイクロバイオームのダイナミクス、治療的相互作用、および環境要因に対する微生物の反応を研究するための並行実験をサポートします。

Abstract

ヒトマイクロバイオームは、宿主の健康に重要な役割を果たす多様でダイナミックな微生物群集で構成されています。これらのコミュニティと環境要因に対するそれらの反応を理解することは、マイクロバイオームベースの治療法を進歩させるために重要です。ヒト由来微生物叢を培養するための従来の in vitro モデルは、拡張性に欠けていることが多く、広範な技術的専門知識を必要とするため、アクセスしやすさとスループットが制限されます。これらの制限に対処するために、微生物群集のハイスループット培養のためのモジュール式の単段連続フロープラットフォームであるミニバイオリアクターアレイ(MBRA)システムを開発しました。このシステムは、最大 48 の異なる微生物群集の並行培養を可能にし、複雑な生態系の安定した成長を維持しながら実験の柔軟性をサポートします。このプロトコルは、MBRA の製造、組み立て、滅菌、および操作に関する詳細なガイダンスを提供します。このシステムのモジュラー設計により、嫌気性チャンバーへの統合が容易で、幅広い実験用途のカスタマイズをサポートします。抗生物質、食事性化合物、病原体の侵入に対する微生物の反応を研究し、病原体耐性コミュニティをスクリーニングするために使用されてきました。MBRA は、そのアクセシビリティ、拡張性、再現性により、微生物の相互作用を調査し、マイクロバイオーム研究を前進させるための強力なモデル システムを表します。

Introduction

ヒトマイクロバイオームは、微生物の複雑な生態系であり、多くの生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たし、人間の健康に大きな影響を与えています。ヒトのマイクロバイオームは、私たちの体全体の多くの解剖学的部位にまたがっており、それぞれに、私たちがまだ完全には理解していない方法で活発に相互作用する動的な微生物群集が含まれています¹.健康と病気への微生物群集の関与に関する知識を広げることは、これらの環境内で起こっている微生物の相互作用の理解にかかっています¹。これらの複雑なシステムを治療目的で効果的に研究し、操作するには、還元主義的アプローチが必要です。単純化されたモデルシステムを使用して個々の微生物の相互作用を調査すると、マイクロバイオーム^の完全な複雑さをよりよく理解しやすくなります2。

ヒト由来の微生物群集を成長させるために、さまざまなモデルシステムが利用可能です。これらのシステムは、ヒトに関連する微生物群集についての理解を深め、単段階のバッチ培養からより複雑な多段階の連続フローシステムまで多岐にわたります。ヒト腸内微生物生態系のシミュ^{レーター3、}双血管単段ケモスタットシステム⁴ 、腸内細菌叢の環境制御システム⁵ などのモデルシステムは、特定の解剖学的部位の生理学的条件を再現し、微生物環境の近似をin vitro で近似します。しかし、微生物学者による採用は、コストがかかり、実行と保守に高度な技術的専門知識が必要であり、スループットが限られているため、限られています。

これらの課題に対処するために、制御^{された環境で}多様な供給源からの微生物群集の安定した増殖を促進するように設計された連続フローの単段階培養システムであるミニバイオリアクターアレイ(MBRA)システムを開発しました^6,7,8。MBRA システムは、組み立てと操作のシンプルさと、複数の微生物群集の同時培養を可能にするハイスループット機能を組み合わせることで、他の腸内モデルとは一線を画し、実験効率を高めます。さらに、このシステムはシンプルでコンパクトな性質を持っているため、嫌気性および微酸素チャンバー内での操作が可能になり、消化管や膣管などの嫌気性および低酸素部位からの細菌の増殖が促進されます。このシステムの汎用性の高い性質は、クロストリディオイデス ディフィシル耐性胃腸群集⁹ のスクリーニング、および微生物群集に対する抗生物質 ^10,11 および食事基質¹² の影響のテストに活用されています。

MBRA は 3D プリンティングまたは積層造形によって製造され、材料の選択において透明度と耐水性を優先します (ポリマー情報については 材料表 を参照)。各アレイには6つのチャンバーがあり、すべて培地のインポート、廃棄物のエクスポート、サンプル収集用のポートが装備されています。新鮮な培地は、廃棄物が同時に抽出される間、2つの蠕動ポンプによって流量を正確に制御しながら、システムに継続的に供給されます。システム内の内容物は、均質な培養を促進するために、撹拌バーと60スポット撹拌プレートを使用して常に撹拌されます。ここで説明するプロトコルは、チャンバーあたり15 mLの作業量に最適化されていますが、各バイオリアクターは実験要件に応じて1〜20 mLの範囲に対応できます。蠕動ポンプとポンプチューブは、0.016〜2.9 mL/minの範囲の流量に対応でき、それぞれ約15.63〜0.09時間の回転率に対応します。このシステムは、幅広い培地配合や食事または栄養添加物と互換性がありますが、高粘度の媒体では流量の再校正が必要になる場合があり、未溶解の粒子や不溶性成分の存在により、特に低流量ではポンプチューブや狭いコネクタが詰まる可能性があります。システムのモジュール性により、培地の選択、サンプル収集、流量、作業量を調整することで、実験を迅速かつ簡単に調整できます。4台の24チャンネル蠕動ポンプと2台の60スポット撹拌プレートと組み合わせることで、このシステムは1つの嫌気性チャンバーで実験ごとに48の別々のチャンバーを稼働させることができ、ハイスループットの嫌気性スクリーニングをサポートします。

このプロトコルは、私たちの研究室^によって開発された以前に公開されたMBRAアセンブリおよび操作方法の視覚的なガイドおよび更新バージョンとして機能します4。再現性を高め、ワークフローを合理化し、汚染を最小限に抑えるために、いくつかの重要な改善が組み込まれています。まず、PTFEストローが外れてバイオリアクターチャンバーに落ちるのを防ぐために化学的にエッチングされています。次に、培地ストローが供給ラインに追加され、培地の流れがチャンバーの底部に誘導され、培地がチャンバー壁に滴り落ちるのを防ぎます。これはバイオフィルム形成の既知の原因でした。第三に、C-flexチューブの長さが標準化および短縮され、3Dプリントされたチューブホルダーが設計され、よりコンパクトで整理されたセットアップが作成されました。最後に、バイオリアクターは使用のたびに完全に分解されなくなり、実験の繰り返しに伴う時間と材料費が大幅に削減されます。これらの改良やその他の段階的な改良は、私たちの研究室の複数のプロジェクトにわたるシステムの広範な使用に基づく反復的な最適化を反映しています。

Protocol

注:このプロトコルは、単一のMBRAストリップの調製と組み立てのためのものです(図1)。各MBRAは、3Dプリントされたバイオリアクター、成長培地の流入を促進するチューブ、バイオリアクターチャンバーからの廃棄物の流出を促進するチューブで構成されています。画像を含む単一のMBRAを構成する部品の完全なリストを 表1に示します。必要な追加機器には、2つの蠕動ポンプと撹拌プレートが含まれます(デバイスの詳細については 、材料表 を参照してください)。

1. 組み立て前の準備

1. ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)エッチング
   注:PTFEの化学的特性は、このMBRAシステムでの使用に最適ですが、その潤滑性により、エポキシのみを使用して他のバイオリアクター部品に接着することは不可能です。PTFEチューブをねじ付きオスルアーに固定するには、まずエポキシの接着を可能にするために化学的にエッチングする必要があります。フルオロカーボンエッチング液が使用されます( 材料表を参照)。 図2A は、このエッチングプロセスを容易にするためにPTFEチューブをテーピングするための視覚的なガイドとして機能します。
   1. 長さ25mmのPTFEチューブを12本切断します。そのうち6本はエッチング後に半分にカットされ、フィードラインのストローとして機能します(「メディアストロー」)。
      注:接着される部分のみをエッチングする必要があります。内面や不要な部分のエッチングを防ぐために、チューブの両端をテープで留めてシールする必要があります。
   2. 汎用ラボラベリングテープ(幅19 mm)を使用して、PTFEチューブの~5 mmを覆い、上部にテープを完全に巻き付けます(図2A)。底部の周りにテープの別のセクションを貼り、PTFEチューブの~10 mmを覆います(図2A)。
   3. エッチング溶液がPTFEの内部に到達しないように、テープの端をしっかりとつまみます(図2A)。これにより、エッチングのために~10mmのPTFEチューブが露出したままになります。
   4. 4つの溶液を調製します:55°Cに加熱したフルオロカーボンエッチング液(フルオロカーボンエッチング液の詳細については、 材料表 を参照)、100%エタノール(EtOH)、70°Cに加熱した蒸留H₂O、および70°Cに加熱した蒸留H₂O + 2〜5%酢酸。
      注意:フルオロカーボンエッチング液は腐食性が高いです。PPEを使用してドラフトフードですべての手順を実行します。化学物質は、施設のガイドラインに従って廃棄してください。
   5. すべての溶液をステップ1.1.4で示した温度まで加熱します。フルオロカーボンエッチング液はウォーターバスで加熱する必要があり、他の溶液はホットプレートで加熱できます。テープで留められたチューブを完全に沈めるのに十分な深さの4つの別々のガラス容器に溶液を注ぎます。
   6. すべてのPTFEチューブをフルオロカーボンエッチング液に浸します。均一な表面露出を確保するために渦巻きします。エッチングされた表面が茶色になるまで1分間浸します。
      注:金属製のスキマーストレーナースプーンを使用して、溶液間でPTFEチューブを移送できます。
   7. チューブをEtOH浴に5〜20秒間移します。
   8. チューブを70°C H₂0バスに15〜30秒間移送します。
   9. チューブを70°_CH20 + 2-5%酢酸浴に1分間移します。
   10. チューブを取り外し、ヒュームフード内の吸収パッドの上に置きます。エッチングされたチューブを一晩(少なくとも16時間)乾燥させます。乾燥後、エッチングしたチューブからテープをはがします。
   11. エッチングされたPTFEは接着の準備ができており、室温で保管すれば数ヶ月間接着可能なままです。エッチング面の茶色が薄くなると、接着できなくなります。
       注意: エッチングされたPTFEをUV光にさらすと、エッチングが劣化するため、さらないでください。
   12. エッチングされたPTFEチューブの6本を半分にカットして、フィードラインのストローとして使用します(図2A)。
2. エポキシ廃棄物およびメディアストロー
   1. エッチングされたPTFE廃ストロー6本とエッチングされたPTFEメディアストロー6本をそれぞれ、それぞれのネジ付きオスルアーに挿入します。エッチングされた表面がオスルアーの底と揃っていることを確認します(図2)。
   2. エポキシ樹脂と硬化剤を計量ボートまたはペトリ皿で1:1の比率で混合します。1 mLのピペットチップを使用して、PTFEチューブと接するネジ付きオスルアーのベースにエポキシを塗布します。
   3. 各ピースを垂直に配置し、エポキシを24時間固めます。
      注:空のピペット1 mLチップボックスは、それらを直立させるのに適しています。

2. MBRAアセンブリ

1. MBRAと部品の準備
   1. ミニバイオリアクターアレイストリップが3Dプリントされ( 補足ファイル1を参照)、6つの独立したバイオリアクターチャンバーが含まれていることを確認してください。各チャンバーには 3 つの 1/4 インチ ポートがあり、継手を挿入するにはネジを切る必要があります。T ハンドル タップ レンチを備えた 1/4 インチ 28NF フラクション タップでねじ切りを行います。
      注意: 鉛直ねじ山を確保するために、ポートにねじを通すときは、タップガイドを使用することをお勧めします。
   2. ねじを通したら、各バイオリアクターチャンバーを水で洗い流し、プラスチックの残留物を取り除きます。10 x 3 mmの磁気撹拌バーと1 mLの蒸留水を各チャンバーに加えます。水はオートクレーブ滅菌中の滅菌プロセスを助けます。
   3. バイオリアクターの各ポートの上にゴムワッシャーを配置します。各チャンバーについて、 図 2B に示すように、廃ストローねじ付きオスルアー 1 個、メディアストローねじオスルアー 1 個、および空のねじ付きオスルアー 1 個を各ポートにねじ込みます。
   4. 6/32インチのメスルアーバーブに32個のゴムセプタムを挿入します。セプタムの上袖を下に折り、首を覆います。これらを 図2Bに示す各チャンバーのポートに取り付けます。
   5. 次の長さのCフレックスチューブストリップを切断します:2 3/8インチ、3 11/16インチ、5 1/4インチ、6 1/2インチ、7 13/16インチ、9インチ、および9インチ(各長さは、廃棄物ラインとフィードラインの両方に2つ必要になります)。切断したら、1/8インチのメスルアーバーブを一端に取り付け、オスのルアーロックコネクタを各長さのチューブの反対側の端に取り付けます。
      注:ここで使用される長さは、乱雑さを軽減し、攪拌プレートから~1インチ離れた場所に配置されたポンプ用に最適化されています。希望するセットアップによっては、より長い長さが必要になる場合があります。
   6. 赤色の 2 ストップ E-lab チューブ(内径 1.14 mm)とオレンジ色の 2 ストップ E-lab チューブ(内径 0.89 mm)の両端に 1/16 インチのメスルアーバーブを挿入します。MBRAストリップごとにこのプロセスを6回繰り返します。
      注意: 1/16インチのメスルアーバーブを簡単に挿入するには、E-labチューブの端を沸騰に近いお湯に短時間浸してプラスチックを柔らかくします。
   7. E-labチューブを、手順2.1.5で準備したC-flexチューブに接続します。6 つの長さの C-flex チューブのそれぞれを、メス ルアー を介して 1 つの赤と 1 つのオレンジの E-lab ラインに接続する必要があります。
   8. Cフレックスチューブの1インチ21個、2インチ1個、3インチ3個、12インチ1個を切断します。1/8インチのメスルアーバーブとオスのルアーロックコネクタを、1つの3インチピースと12インチのチューブの端に取り付けます。残りのチューブには、オスのルアーロックコネクタを両端に取り付けます。これらの部品は、廃棄物ラインとフィードラインのツリーアセンブリで構成されます。
2. 廃棄物ラインツリーの組み立て
   1. 図3Bに示す3D図に従って、廃棄物ラインツリーを組み立てます。
   2. 赤い2ストップE-labチューブ(内径1.14mm)の露出した端を、組み立てられた廃線ツリーの端子オスルアーロックに取り付けます。2ストップE-labチューブに取り付けられたC-flexチューブの長さに基づいて昇順で取り付けます。1/8インチのメスルアーバーブとオスのルアーロックコネクタを備えた3インチのCフレックスチューブを、廃棄物ラインツリーの上部に取り付けます。
3. フィードラインツリーアセンブリ
   1. 図3Aに示す3D図に従って、フィードラインツリーを組み立てます。
      メモ: フィードラインツリーには、廃棄物ラインツリーで使用されるオスからオスのルアーコネクタは組み込まれていません。私たちの経験では、これらのコネクタは漏れやすく、緩みやすいため、バイオリアクターチャンバーと培地ボトルの両方で汚染のリスクが高まります。これを軽減するために、フィードラインツリーはこれらのコンポーネントなしで構築されます。
   2. オレンジ色の2ストップE-labチューブ(0.89 mm ID)の露出した端を、組み立てられたフィードラインツリーの端子オスルアーロックに取り付けます。2ストップE-labチューブに取り付けられたC-flexチューブの長さに基づいて、これらを昇順で取り付けます。12 インチ C フレックス チューブをフィード ライン ツリーの上部に取り付けます。
4. 完全な組み立て:準備された成分をMBRA培養システムに組み合わせます。
   1. 供給ラインツリーの端にある可変長Cフレックスチューブを、バイオリアクターストリップの左側に最短の線、右側に最も長い線を昇順で取り付けます。
   2. 廃棄物ラインツリーの端にある可変長のCフレックスチューブを、最も長い線を左側に、最も短い線を右側に降順にバイオリアクターストリップに取り付けます。最短の廃棄物ラインは、廃棄物ポンプに最も近いため、バイオリアクターストリップの右側にあります。対照的に、供給ポンプは左側にあるため、最も長い供給ラインは右側にあります(図1)。
5. 組み立てられたアレイの滅菌:組み立てられたシステムを滅菌用に準備します。
   1. すべてのC-flexフィードラインをMBRAの左側に束ね、ツイストタイで固定します。ストリップの右側の廃線についても同じことを行います。
   2. オレンジ色の2ストップE-labチューブでCフレックスラインの間にループを形成します。オートクレーブテープを使用してループを固定します。バイオリアクターストリップの廃棄物側にある赤い2ストップE-labチューブについても同じことを行います。これにより、オートクレーブ滅菌中のスペースを節約できます。
   3. オートクレーブから取り出した後の汚染を防ぐために、廃棄物ラインとフィードラインツリーの端にあるメスルアーをホイルで覆います。各バイオリアクターチャンバーのセプタムでおねじルアーを緩め、オートクレーブ滅菌中に蒸気を逃がします。
      注:このステップは、オートクレーブ滅菌中に蒸気がバイオリアクターから確実に逃げるようにするために重要です。適切に通気しないと、バイオリアクターチャンバーに亀裂が生じる可能性があります。
   4. MBRAをオートクレーブビンに入れ、給餌ラインと廃棄物ラインの木をMBRAを含むビンに隣接する別々のビンに伸ばします。オートクレーブ滅菌中に、1/16インチメスルアーバーブの近くのE-labチューブまたはC-flexチューブのいずれかの部分がねじれると、チューブが詰まり、媒体や廃棄物の流れが妨げられる可能性があります。
   5. オートクレーブを121°C、15psi≥25分間。液体サイクルに典型的な低速排気プログラムを使用します。オートクレーブサイクルの後、バイオリアクターを室温で冷却します。MBRAが十分に冷却されたら、ネジ付きオスルアーをセプタムで締め直します。
      注:オートクレーブ滅菌されたバイオリアクターストリップは展性になり、圧縮するとひび割れやすくなります。フィッティングを締める前に、十分な時間で冷ましてください。
      注:オレンジ色の2ストップE-labチューブは、オートクレーブプロセス中にひび割れやすく、1/16インチのメスルアーバーブから分離する可能性があります。ひび割れが発生した場合は、両端に70%エタノールをスプレーした後、ひび割れた端を滅菌カミソリで切り、チューブをルアーバーブに再度取り付けます。あるいは、1/16インチのメスルアーが取り付けられた追加のE-labチューブをオートクレーブバッグで個別に滅菌し、チューブ全体を交換することもできます。

3. メディアと廃ボトルの組み立て

1. メディアボトルの組み立て
   注:この例では、システム全体に1本の2Lボトルが供給されます。メディアボトルキャップアセンブリの画像については、 図4A を参照してください。
   1. Dibafit アダプター (ボトル キャップ アダプター) を Q シリーズ ボトル キャップの上部にある 2 つのネジ付きポートにねじ込みます。3 インチの C-flex チューブをアダプターの 1 つに追加し、12 インチの C-flex チューブをもう一方のアダプターに追加します。各チューブセクションの端に、オスのルアーロックコネクタを追加します。
      メモ: MBRA のフィード ライン ツリーに到達するために必要なチューブの長さはさまざまであり、それに応じて調整できます。
   2. 12インチのPTFEチューブを切断して、メディアを引き出すためのストローとして機能します。ボトルの側壁が詰まらないように、カミソリの刃を使用して端を45°の角度で切ります。Cフレックスチューブの12インチセクションに接続されたボトルキャップの底にある小さな穴にPTFEを挿入します。
   3. 2インチのCフレックスチューブを切断し、一方の端にメスのルアーバーブを、もう一方の端にオスのルアーロックコネクタを取り付けます。このチューブをチューブの 12 インチ セクションに取り付け、最終的にフィード ライン ツリーに接続します。2インチのピースをピンチコックで固定します。ピンチコックのループをボトルキャップの3インチチューブの周りに置きます。これは、オートクレーブ滅菌中およびオートクレーブ滅菌後の媒体の漏れを防ぐための一時的なストッパーとして機能します。
   4. 目的のメディアを準備します。完全に組み立てられたボトルキャップをメディアボトルに取り付けます。上記のように、12インチのCフレックスチューブをボトルに巻き付け、2インチチューブのピンチコックで端を固定します。キャップをしっかりとねじ込むのではなく、オートクレーブ中の圧力上昇を防ぐために少し緩めてください。
   5. ホイルを使用して、ボトルキャップから始まった3インチチューブの端を覆います。培地のプロトコルに適した時間オートクレーブ。滅菌後、3インチチューブからホイルを取り外し、0.22 μmのシリンジフィルターをオスのルアーロックコネクタにねじ込みます。これにより、ポンピング中にメディアボトルに空気が流れ込むことができますが、汚染を防ぐことができます。
      注意: 不適切なシールは適切な流れを妨げる可能性があるため、使用する前に、Qシリーズのボトルキャップがボトルにしっかりと密閉されていることを確認してください。
2. 廃ボトルの組み立て:廃ボトルを毎日交換しないように、ラボは、実験中に複数の2Lボトルに廃棄物を充填できる段階的な廃棄物収集システム(図4B)を作成しました。この段階的な廃棄物システムのセットアップは次のとおりです。
   1. ボトルキャップアダプターをQシリーズボトルキャップの上部にある2つのネジ付きポートにねじ込みます。必要な廃棄物保管ボトルの数に応じて、2〜4個のボトルキャップについて繰り返します。
   2. ボトルキャップごとに2インチのPTFEをカットします。この部品をボトルキャップの内側に挿入し、システム内の次のボトルに廃棄物を除去するために指定された穴に挿入します。
   3. ポンプから始まる廃棄物ラインツリーから廃棄物ボトルシステムの位置まで伸びるのに十分な長さのCフレックスチューブを切断します。オスルアーロックコネクタを廃液ラインツリーに隣接する端に取り付け、もう一方の端をボトルキャップにPTFEチューブを取り付けずにボトルキャップアダプターに接続します。
   4. 2 番目の長さの C-flex チューブを切断して、1 番目と 2 番目の廃ボトルのボトル キャップを接続します。最初のボトルにはPTFEストローを取り付けたボトルキャップアダプターにチューブを取り付け、2番目のボトルにはPTFEストローなしでボトルキャップアダプターにチューブを取り付けます。
      注:階層化された廃ボトルカスケードの各ボトルは、重力が1つのボトルから次のボトルへの流れを助けるように、最初のボトルの上に配置する必要があります(図4B)。すべてのボトルを二次容器 (開いたプラスチック製の収納箱など) に入れ、逆さまの鋭利物容器などのライザーを使用して降順に配置することをお勧めします。
   5. このチェーンを好きなだけ続けます。最終的なボトルで、オスルアーロックコネクタ付きの3インチCフレックスチューブセグメントをフリーボトルキャップアダプターに取り付けます。次に、20 mLシリンジを接続して真空を適用し、廃棄物のカスケードを促進します。

4. MBRAの接続、操作、分解

1. ポンプへの取り付け
   1. E-labチューブを廃液ラインと供給ラインの両方で固定しているオートクレーブテープを取り外します。Cフレックスチューブの束をほどきます。
   2. 攪拌プレートの上部にある2つのポンプの間にMBRAを配置します。3Dプリントされたホルダーを使用してプレートにクランプダウンできます( 補足ファイル2を参照)。撹拌プレート上の指定された撹拌位置と位置が揃っていることを確認してください。
   3. フィードラインE-labチューブを蠕動ポンプカートリッジに取り付けます。E-labチューブのストップをカートリッジのスロットに配置します。撹拌プレートの右側にあるポンプの廃棄物ラインE-labチューブについても同じことを行います。
   4. 蠕動ポンプカートリッジをポンプにロックします。カートリッジがポンプに完全に固定され、チューブがカートリッジのチャネル内にあることを確認します。
      注意: 24時間以内にフローを開始する場合は、カートリッジをポンプの所定の位置にロックしてください。媒体の流れを24時間以上行わずにクランプしたままにしておくと、チューブが圧縮されて詰まる可能性があります。このような場合は、クランプを取り外し、圧縮点でチューブを優しくマッサージするだけです。
   5. 3Dプリントされたチューブホルダーを使用してCフレックスチューブを整理します(補足ファイル3)。
   6. 廃液ラインツリーの端を廃液ボトルにつながるチューブに取り付けます。
      注: 複数の MBRA を実行する場合、廃液ボトルにつながるチューブに取り付ける前に、廃液ラインの木を分岐する必要があります。これは、追加の MBRA ごとに単純な分岐ツリーを作成することで実行できます。
   7. フィードライン入口チューブのメスルアーを、メディアボトルキャップから12インチチューブのオスコネクタに取り付けます。
      注:この時点で両端は無菌である必要があります。潜在的な汚染源に触れないようにしてください。汚染が疑われる場合は、接続する前に両端を10%漂白剤に10分間浸してください。
   8. 両方のポンプをオンにして、媒体の流れを開始します。ポンプが正しい方向に流れていることを確認してください(廃棄物がポンプの右側にある場合は、両方とも時計回り(「CW」)に設定されます)。
   9. 各バイオリアクターチャンバーに落ちる培地液滴のサイズとケイデンスを観察します。これに大きな違いがある場合は、流量の変動を示している可能性があります。ばらつきが観察された場合は、問題のあるバイオリアクターチャンバーに接続されているオレンジ色の2ストップE-labフィードチューブを交換することをお勧めします。これにより、実験実行における流量の変動を制限できます。
      注: これはシステム内の漏れを診断して修正する時期であるため、最初の充填プロセスを注意深く監視してください。
   10. バイオリアクターチャンバーが容量に達したら、両方のポンプを停止し、バイオリアクターを24〜48時間放置します。このステップは、実験を開始する前にチャンバー内の潜在的な汚染がないか確認するために不可欠です。
2. MBRA接種
   注:ここでは、中隔を滅菌し、接種物を注入するための基本的なプロトコルについて説明します。
   1. 希望の仕様に従って接種物を準備します。
   2. プラスチック製のスポイトを使用して、各バイオリアクターチャンバーのセプタムの上部に、作りたての10%漂白剤溶液を塗布します。中隔の上部を完全にコーティングするのに十分な漂白剤を堆積させます。10分間放置します。滅菌ラボワイプを使用してセプタムを乾燥させます。
   3. 長さ3インチの22 G針とサンプルが入った注射器を使用して、中隔の中心に穴を開けます。針がチャンバー内の培地に触れていることを確認し、接種物をバイオリアクターチャンバーに注入します。メディアを取り除き、チャンバーに再注入してシリンジを洗い流します。中隔から針を取り出し、鋭利な容器に捨てます。
   4. フローを開始する前に、実験計画に基づいて、接種物を適切な期間成長させます。たとえば、糞便細菌群集は、十分な^{バイオマスを増やす}ために4〜16時間の初期バッチ成長を必要とします8。
   5. 必要な回転時間に応じて、両方のポンプを希望の流量までオンにします。流量の詳細については、蠕動ポンプのマニュアルを参照してください。
      注:必要な流量に関係なく、バイオリアクターチャンバーがオーバーフローしないように、廃棄物ポンプは常に培地ポンプよりも高速で運転する必要があります。消化管細菌群集培養では、培地ポンプを1.0rpm、廃液ポンプを2.0rpmに設定することで、1.92mL/hの回転率を使用しています。
   6. 繰り返しになりますが、各バイオリアクターチャンバーに落ちる培地液滴のサイズとケイデンスを観察すると、これに大きな違いがある場合は、流量の変動を示している可能性があります。ばらつきが観察された場合は、問題のあるバイオリアクターチャンバーに接続されているオレンジ色の2ストップE-labフィードチューブを交換することをお勧めします。これにより、実験実行における流量の変動を制限できます。
3. MBRAサンプリング
   1. 各バイオリアクターチャンバーの中隔の上部に、表面を完全にコーティングするのに十分な10%漂白剤溶液を塗布します。10分間放置します。10分後、滅菌ラボワイプを使用してセプタムを乾燥させます。
   2. 長さ3インチの22ゲージ針と注射器を使用して、中隔の中心に穴を開け、針をバイオリアクターチャンバーに完全に挿入します。シリンジを持ちながら、プランジャーを引き戻してサンプルをチャンバーから取り出します。
      注:バイオリアクターチャンバーの総容積の20%以上を一度に除去しないでください。これ以上のものを除去すると、新鮮な培地がチャンバーをPTFE廃ストローレベルまで補充するまで廃棄物の流出が中断されるため、微生物群集が混乱する可能性があります。
   3. 針を取り外し、サンプルを適切な容器に分注します。針は鋭利物容器に捨ててください。
4. MBRAの分解と改修
   注:実験後、MBRAを滅菌し、将来の実験に備える必要があります。
   1. メディア入力を脱イオン(DI)水中の10%漂白剤1Lに切り替えます。両方のポンプの流量を最大に増やして、バイオリアクターチャンバーの内容物を漂白剤溶液に置き換えます。
   2. チャンバーが透明になったら(すべてのメディアが漂白剤に交換された)、MBRAを反転させて充填ラインの上で5分間消毒します。5分後、ストリップを正し、滅菌のためにさらに5分間待ちます。
      注:上記のように、漂白剤を10分以上放置すると、プラスチックが変色し、メディアや廃チューブが弱くなるため、放置しないでください。
   3. 10%漂白剤溶液を1LのDI水に交換します。すべての水が通過するまで、システムをDI水で洗い流します。バイオリアクターE-labチューブをポンプから外し、MBRAを取り外します。
   4. 改修するには、使用済みのセプタムと各チャンバーから1mL以外の水をすべて取り除きます。
   5. セプタムとオレンジ色の2ストップE-labチューブを交換し、前の手順に従ってオートクレーブの準備をします(ステップ2.5.1〜2.5.5)最大3回。3回目の再利用後、MBRAを完全に分解し、Cフレックスチューブを交換し、個々の部品を70%EtOHで滅菌するか、破損した場合は交換する必要があります。廃棄物と供給 PTFE を保持しているエポキシは、数回のオートクレーブ サイクル後に脆くなり、再塗布する必要があります。
      注:オレンジ色の2ストップE-labチューブは、摩耗とオートクレーブサイクルの繰り返しによって引き起こされる流量の変動を制限するために、各実行の間に交換されます。

Results

消化管に見られるような嫌気性細菌の増殖を促進するために、MBRA は嫌気性チャンバー内でセットアップして操作できます。人体の関連部位から直接複雑な細菌群集を増殖させる能力を実証するために、ヒトの糞便サンプルを調製し、このシステムで増殖させました。すべての作業は37°Cに設定された嫌気性チャンバーで行われ、培養物はバイオリアクター培地BRM3⁷で増殖しました。

糞便スラリーは、ヒトの便を嫌気性で解凍し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)と最終濃度25%w/vまで混合することによって調製されました。無菌性を確認した後、9つのバイオリアクターチャンバーにそれぞれ3mLの同じ糞便スラリーを接種しました。微生物群集は、培地の投入や廃棄物の除去を行わずに一晩増殖し、その結果、16時間にわたって別々のバッチ培養が行われました。次に、供給ポンプをオンにし、1.92 mL/h の流量に設定しました。4日間の連続フローの後、バイオリアクターからサンプルを収集し、16S rRNA遺伝子配列決定を使用して微生物群集組成を分析し、続いてDeblurによるノイズ除去とQIIME 2¹³のSILVA 138 SSUデータベースによる分類学的分類を行いました。9回の反復すべてで合計65属が検出されましたが、バイオリアクターは18属のみで優勢であり、それぞれが9回の反復のいずれかで少なくとも2%の存在量を占めていました(図5)。バイオリアクターは高い再現性を示し、65属のうち22属が9つの反復すべてで検出され、さらに17属が少なくとも半分の複製で検出されました。少なくとも1つの反応器に存在しない属の大部分(43属中37属)は希少種であり、それぞれバイオリアクターの相対存在量が2%未満でした。要約すると、連続フローMBRA培養は、各バイオリアクターチャンバー内で16時間別々のバッチ培養した後でも、同じ便サンプルに由来する複雑で再現性のある微生物群集をサポートしました。

図1:ミニバイオリアクターアレイ(MBRA)。 供給および廃棄物ラインのチューブツリー、バイオリアクターチャンバー、バイオリアクターストリップのラベルを含む、完全に組み立てられたMBRA。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:PTFEエッチングガイドとMBRAポートレイアウト。 (A)メディアと廃PTFEストローのエッチングのフローチャート。(B)各バイオリアクターチャンバーには、培地ストロー+ネジ付きオスルアー、廃ストロー+ネジ付きオスルアー、およびセプタム+ネジ付きオスルアー用のポートが含まれています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:MBRAの飼料と廃棄物のラインツリー。 (A)フィードラインツリーと(B)廃棄物ラインツリーの組み立てで従うべき代表的な画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:メディアボトルキャップと廃棄物層システム。 (A)メディアをMBRAに引き込むために使用される組み立てられたQシリーズボトルキャップの例。(B) 段階的な廃棄物収集システムのイメージ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:細菌属の相対存在量。 (A)積み上げ棒グラフは、表示されたサンプルのいずれかで少なくとも2%の存在量を構成するすべての属の相対存在量を示します。(B)観測されたOTUのアルファ多様性指標と、9つのバイオリアクターチャンバーすべて間のシャノン多様性。9つのバイオリアクターチャンバーすべてに、ヒトの便から調製されたのと同じ糞便スラリーを接種しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表 1: MBRA コンポーネント。MBRAを完全に組み立てるために必要なすべての個々の部品の画像と説明、および各コンポーネントに必要な数量。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表 2:トラブルシューティング ガイド。 MBRA の実行で発生する一般的な問題、およびその潜在的な原因と推奨される解決策。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1: ミニバイオリアクターアレイストリップを3DプリントするためのStlファイル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2: バイオリアクターを撹拌プレートに固定するために使用されるバイオリアクターホルダーを3DプリントするためのStlファイル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3.: MBRAから伸びるC-flex廃棄物と供給チューブを整理するために使用されるチューブホルダーを3DプリントするためのStlファイル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

このプロトコルは、細菌群集のハイスループット培養のためのミニバイオリアクターアレイ(MBRA)の完全な組み立てと基本的な操作を説明し、以前に公開された方法にいくつかの重要な改良を組み込んでいます。MBRA システムは、研究者が多数の実験的複製を並行してサポートしながら、複雑な微生物生態系を培養できるようにする多用途でコスト効率の高いツールであり続けています。この更新バージョンでは、再現性の向上、ワークフローの合理化、汚染リスクの軽減などの改善が導入されています。これらには、剥離を防ぐための化学的にエッチングされたPTFEストロー(図2)、バイオフィルム形成を最小限に抑えるための培地ライン上のフィードストロー(図2)、よりコンパクトで整理されたセットアップのための付属の3Dプリントチューブホルダー(補足ファイル3)を備えた標準化されたチューブ長、および実験間の完全な分解の必要性を排除する最適化された再利用プロトコルが含まれます。これらの改良は、私たちの研究室でのさまざまな実験アプリケーションにわたるMBRAシステムの広範な使用を通じて開発された反復的な改善を表しています。この議論では、重要な組み立てステップと実際的な機能強化の両方に対処することで、マイクロバイオーム研究のための継続的に進化するモデルシステムとしてのMBRAの有用性を強調します。

MBRA システムの成功は、汚染のない動作を保証するためのコンポーネントの正確な組み立てと滅菌に大きく依存しています。主な手順には、モジュール式組み立てを容易にし、メディアの投入と廃棄物の収集を可能にする Q シリーズ キャップ、チューブ、コネクタの適切な取り付けが含まれます。メディアボトル、廃棄物リザーバー、バイオリアクターチャンバー間の密閉性を確保することは、漏れを防止し、無菌状態を維持するために不可欠です。もう 1 つの重要なステップは、不一致が培地の供給に不均一をもたらし、微生物の増殖ダイナミクスに影響を与える可能性があるため、実験前に蠕動ポンプ流量を検証することです。カセットを使用するほとんどのマルチチャンネル蠕動ポンプには、各チャンネルの流量を微調整するために使用する必要がある閉塞調整機構が含まれています。適切な校正を行っても、E-labチューブは依然として変動の主な原因です。これを軽減するには、最初の充填中と実験の開始中の両方で、各バイオリアクターチャンバーに入る培地液滴の頻度とサイズを視覚的に監視することが重要です。これらの目視チェックにより、実験の再現性を損なう可能性のある流量の不一致を早期に検出できます。 表 2 に 、MBRA の組み立てと使用中に発生する一般的な問題のトラブルシューティング戦略を示します。これらのトラブルシューティング手順により、実験全体の再現性が確保され、長期培養中の中断が防止されます。

MBRA システムには、その長所にもかかわらず、実験を設計する際に考慮しなければならない特定の制限があります。より高度なシステムとは異なり、MBRA にはリアルタイムの光学密度 (OD) 測定、pH 制御、温度調整などのアクティブ監視機能がありません。このアクティブな測定の欠如により、微生物の増殖と代謝活動の動的変化をリアルタイムで監視するシステムの能力が制限されます。さらに、このシステムはチャンバー内での嫌気性培養をサポートしていますが、統合されたガス制御は含まれていないため、正確な微好気性または CO₂ が豊富な環境を必要とするアプリケーションが制限される可能性があります。このような制御を必要とする研究には、ガス調整が組み込まれた代替システムの方が適している可能性があります。

MBRAシステムは、高スループット、拡張性、費用対効果など、既存のバイオリアクターモデルに比べて重要な利点を提供すると同時に、人間の消化管^6,8,10のような動的環境を模倣するために連続的な流れの下で複雑な細菌群集を培養する能力を保持しています。コンパクトなモジュール設計により、複数のバイオリアクターを同時に操作できるため、病原体の侵入に対する耐性について糞便由来のコミュニティをスクリーニングするなどのハイスループット研究に最適です⁹。このモジュール設計により、実験の柔軟性が広範に向上し、各ストリップは、このプロトコルで実証されているように、1 つの培地ボトル、またはバイオリアクターチャンバーごとに 1 つずつ、最大 6 つの異なる培地ソースから供給できます。作業量は、各チャンバーの廃棄物ポートに挿入された細いPTFE廃棄物ストローの長さによって制御され、液体の高さが決まります。このプロトコルでは、25 mmストローは15 mLの作業量を維持しますが、ストローをトリミングまたは伸ばすことで1〜20 mLの容量を達成できます。さらに、短いフィードストローが培地入口に挿入され、流入をチャンバーベースに誘導し、培地がチャンバー壁に滴り落ちるのを防ぎ、充填ラインの上のバイオフィルム形成を減らします。ポンプ速度やポンプチューブの直径を調整して、システムの回転率を変更することもできます。今日まで、MBRAシステムは、抗生物質¹⁰、抗がん剤¹⁴、およびさまざまな食事化合物^{12、15、16、17}など、さまざまな要因に応答した微生物群集の機能的および組成的変化を研究するために広く使用されてきました。シンプルなモジュール設計により、さまざまな実験ニーズへの適応に最適です。たとえば、MBRAはケモスタットのような条件下でバイオフィルムを研究するように変更されており¹⁸、プランクトン培養を超えた微生物生態学研究におけるその汎用性を実証しています。

MBRA システムの将来の反復では、その機能、精度、スループットの可能性を拡張する追加のエンジニアリング アップグレードの恩恵を受ける可能性があります。そのような機能強化の 1 つは、各バイオリアクター チャンバーに追加のポートを組み込むことです。これらのポートは、pH、温度、ガス、光学密度などの環境パラメータのアクティブモニタリングをサポートするために使用できます。これにより、リアルタイムのフィードバックと監視を可能にすることで、モデルの最も重要な制限の 1 つに対処できます。チャンバーまたはポートの形状を改善すると、より徹底的でアクセスしやすい洗浄が容易になり、残留物の蓄積や変色が減り、長期的な再利用性が向上します。追加の蠕動ポンプとプログラム可能なタイマーを統合することで、パルスまたは日周の培地入力が可能になり、人間の腸内の摂食サイクルなどの宿主関連環境をより適切にシミュレートできます。最後に、耐薬品性のあるオートクレーブ可能なポリマーなどの代替材料を使用した 3D プリントにより、耐久性が向上し、より幅広い試薬との適合性が得られる可能性があります。これらの改善を組み合わせることで、MBRA プラットフォームの実験範囲と忠実度が大幅に拡大する可能性があります。

結論として、MBRA は、制御された条件下で微生物群集を培養および研究するための強力でハイスループットのプラットフォームを提供します。アクティブモニタリングとpH制御には限界がありますが、その柔軟性、拡張性、コスト効率により、幅広い微生物学的研究、特に高い再現性と実験スループットを必要とする研究にとって非常に貴重なツールとなっています。重要なのは、システムのモジュール設計と製造アプローチにより、本質的に適応性があることです。研究者は、幅広い実験目的に合わせてMBRAを調整してきましたし、今後も調整し続けることができます。この適応性により、MBRA は新たな科学的問題やテクノロジーとともに進化し続けることができ、マイクロバイオーム研究のための多用途プラットフォームとしての関連性を維持できます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
V-Tapガイド、標準サイズ0-80〜5/8インチ	ビッグゲーターツール	STD500NP
0.22 & ミュー;Mシリンジフィルター	漁夫	SLGVR33RS
2mag MIXdrive 60撹拌ドライブ(ドライブのみ)	2MAG	MF 41060
エアタイト皮下注射針、22G x3インチ	VWRの	89219-274
BD 1mL スリップチップ滅菌シリンジ滅菌	漁夫	14-823-434
バイオリアクター	プロトラボ	NA	DMS Somos Watershed Plasticから3Dプリントされました。テンプレートについては、補足ファイル1を参照してください
バイオリアクターホルダー	プロトラボ	NA	PA 12 Blackから3Dプリント。テンプレートについては、補足ファイル 2 を参照してください。
Diba Omnifit Qシリーズソルベントボトルキャップ、GL38/38-430(ガラス)、2つのUNF(F)ポート、バルブなし、ブルー	コール・パーマー	EW-21942-86
Diba Omnifit チューブ、PTFE、外径 1/8 インチ (3.2 mm) x 内径 1.5 mm	コール・パーマー	EW-21942-76
Dibafitアダプター、1/4"-28 UNF(M)フラットボトムから3.2 mm ID、PEEK	コール・パーマー	EW-21941-49
IRWIN 12001ZR タップ レンチ #0-1/4" T ハンドル	アマゾン	B00004YOB0
アーウィン・ハンソン高炭素鋼SAEフラクションタップ1/4インチ1個	ゾロ	G7695682
ロックタイト ヘビーデューティ エポキシ クイック セット 8 液量オンス ボトル	アマゾン	B0044F59N0
オス-オスルアーロックコネクタ	ダーウィン・マイクロ流体工学	DM-MM-LUER-PP	代替品: Strategic Applications Inc オス - オス ルアー コネクタ - 10/パック - フィッシャー - NC9876577
Masterflexアダプターフィッティング、ルアー-ルアー、ナイロン、アバンター	VWRの	MFLX45502-56
Masterflex フィッティング、ナイロン、ストレート、メス ルアー - ホース バーブ アダプター、1/16 インチ内径	VWRの	MFLX45502-00
Masterflex フィッティング、ナイロン、ストレート、メス ルアー - ホース バーブ アダプター、3/32 インチ ID	VWRの	MFLX45502-02
Masterflex フィッティング、ナイロン、ストレート、メス ルアー - ホース バーブ アダプター、1/8 インチ	VWRの	MFLX45502-04
Masterflex フィッティング、ナイロン、ストレート、オスルアーロック - ホースバーブアダプター、1/8	VWRの	MFLX45505-04
Masterflex フィッティング、ナイロン、ストレート、オスルアー x 1/4-28 UNF	VWRの	MFLX45505-82
Masterflex フィッティング、ポリプロピレン、エルボ、メスルアー - メスルアーアダプター	VWRの	MFLX45508-26
Masterflex Ismatec ポンプチューブ、2 ストップ、Tygon S3 E-Lab、内径 0.89 mm	VWRの	MFLX96460-26
Masterflex Ismatec ポンプチューブ、2 ストップ、Tygon S3 E-Lab、内径 1.14 mm	VWRの	MFLX96460-30
マスターフレックス®トランスファーチューブ、Cフレックス、不透明白、1/8インチ内径×1/4インチ外径。25フィート	VWRの	MFLX06424-67
モールs チューブ用ピンチコック	VWRの	470201-374
ネオプレンゴムフェンダーワッシャー½”外径 x & frac14;”ID x 1/16インチ厚さ	アマゾン	B01A29F1R0
精密シールゴムセプタム	シグマ・アルドリッチ	Z553905
スピンバーマイクロスターバー	VWRの	58948-375
テトラエッチング	R.S.ヒューセスト・カンパニー	TE-500
チューブホルダー	プロトラボ	NA	PA 12 Blackから3Dプリント。テンプレートについては、補足ファイル 3 を参照してください。
Watson-Marlow 205S マルチチャンネルカートリッジポンプ	ワトソン・マーロウ	020.3724.00A	割引、代替品:Ismatec IPCデジタル蠕動ポンプMFLX7800142 - FISHER - 113-200-014またはMasterflex Ismatec IPC蠕動ポンプ、0.1〜11.25 rpm、24チャンネル、115/230 VAC、Avantor、VWR、MFLX78006-48-CH