オイルレッドO染色によるAAV8-PCSK9注射マウスの大動脈のアテローム性動脈硬化症の評価

サマリー

このプロトコルは、オイルレッドO染色を用いて、マウス大動脈の顔面アテローム性動脈硬化性病変を解剖、灌流、染色、イメージング、および定量するための段階的な方法を説明する。

要約

マウスモデルは長い間、アテローム性動脈硬化症の研究における基本的なツールであり、プラーク形成、脂質代謝、心血管炎症の根底にある分子および細胞メカニズムについての重要な洞察を提供します。 Apoe^-/- または Ldlr^-/- マウスを超えて、西洋型食餌を同時に摂取した正常な C57BL/6J マウスへの AAV8-PCSK9^D377Y 注射は、アテローム性動脈硬化症のトランスレーショナル研究に一般的に使用されるモデルとして浮上しています。オイルレッドO染色は、血管組織内の中性脂質蓄積を視覚化するための基礎技術です。脂質を含んだ病変を検出するためのそのシンプルさ、費用対効果、および高感度により、前臨床研究でアテローム性動脈硬化性プラークの負荷を評価するためのゴールドスタンダードとなっています。この研究では、ピンや複雑な取り付け手順を必要とせずに、顔面大動脈の解剖、灌流、縦方向の開口部、オイルレッドO染色、イメージング、および半自動定量化のための詳細で再現性のあるプロトコルを提供します。私たちの結果は、AAV8-PCSK9^D377Y 注射と西洋型食事療法の組み合わせがマウスに重大なアテローム性動脈硬化病変の形成を効果的に誘発すること、および顔面オイル レッド O 染色が脂質沈着とプラーク負荷を評価するための信頼性が高く効率的な技術であることを示しています。さらに、このプロトコルは、C57BL/6JマウスにおけるAAV8-PCSK9誘導モデルに最適化されていますが、 Apoe^-/- マウス、 Ldlr^-/- マウス、 Ldlr^-/- ゴールデンシリアハムスターなど、他のモデルや種での使用に容易に適応させることができます。

概要

動脈内膜内の脂質の沈着と炎症を特徴とするアテローム性動脈硬化症は、冠動脈疾患および心筋梗塞や脳卒中を含む広範囲の心血管疾患 (CVD) の病理学的基盤を表します 1,2,3,4。CVD は依然として世界中の罹患率と死亡率の主な原因であり、世界的な健康と経済的負担に重大な影響をもたらしています ^3,5。CVD の主な病理学的根拠として、アテローム性動脈硬化症は、その根底にあるメカニズムを明らかにし、効果的な治療戦略を開発することを目的とした広範な研究の注目を集めています。マウスモデルは、アテローム発生の根底にあるメカニズムを解明し、潜在的な治療介入を評価する上で中心的な役割を果たし^ます6。動物モデルの開発は、アテローム発生の理解を進めるのに役立ち、研究者が関与する細胞および分子メカニズムを分析し、新たな治療戦略を評価することが可能になりました^6,7

プロトコル

すべての動物処置は、NIHに概説されているガイドラインに従って実施され、中国科学技術大学の動物倫理委員会によって承認されました(倫理承認番号。USTCACUC27120124102)。

注: AAV8-PCSK9 を含むすべての手順は、バイオセーフティ レベル 2 (BSL-2) 条件下で認定されたクラス II 生物学的安全キャビネットで実施する必要があります。職員は、白衣、使い捨て手袋、安全ゴーグルなどの適切な個人用保護具 (PPE) を着用する必要があります。

1.マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の誘導

1. 8週間齢のC57BL / 6JマウスにAAV8-PCSK9^D377Y (尾静脈を介して5×10¹¹ vg/マウス)を静脈内注射します。
2. 注射直後にマウスをWD(脂肪から40%kcal、コレステロール1.25%を含む)に置きます。
3. マウスWDを12〜16週間給餌して、アテローム性動脈硬化性病変の形成を誘導します。
   注:12週間の摂食期間が一般的に使用され、特にAAV8-PCSK9誘発モデルにおいて、明らかなアテローム性動脈硬化性プラーク形成を誘発することが示されています。期間が長い (例: 16 週間)....

結果

大動脈壁における脂質沈着の程度を評価するために、AAV8-PCSK9^D377Y を注射し、年齢が一致した対照マウスとともに12週間西洋食を与えた雄C57BL / 6Jマウスから単離された大動脈に対して、表面オイルレッドO染色を実施しました。PBS による全身灌流と慎重な解剖の後、大動脈全体を慎重に縦方向に解剖し、オイル レッド O で染色して、脂質を含有するアテローム性動脈硬化病変を視覚化しました。全体的な実験手順を 図2に示します。 図3に示すように、オイルレッドO陽性領域(赤)は対照マウス(プラーク被覆率0%)ではほとんど観察されなかったが、AAV8-PCSK9 ^D377Y 注射マウス(平均プラーク被覆率17%)では、特に大動脈弓および分岐点周辺で著しく増加した(病変部位はApoeまたはLdlr欠損マウスで観察されたものと類似していた)。定量分析では、対照と比較して、AAV8-PCSK9 グループでプラーク負荷の有意な増加がさらに実証されました。これらの結果は、AAV8-.......

ディスカッション

この研究で説明されているエンフェイスオイルレッドO染色法は、大動脈全体のアテローム性動脈硬化性病変負荷を評価するための堅牢で再現性があり、時間効率の高いアプローチを提供します。この研究では、大動脈全体ではなく、プラーク分析の対象領域として大動脈弓と胸部大動脈を具体的に選択しました。この決定は、通常、Apoe^−/−およびLdlr^−/−マウスなどの古典的な遺伝子ノックアウトモデルと比較して、アテローム性動脈硬化性プラーク形成の広範囲が少ないAAV8-PCSK9^D377Yモデル²⁰の性質によって導かれました。同じ期間のWD栄養(例えば、12〜16週間)を受けた場合、AAV8-PCSK9^D377Yモデルは、プラークの蓄積が主に大動脈弓に局在し、より小さな病変領域を示す傾向があります。さらに、研究目的で動物を使用するという「.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
C57BL/6J マウス	GemPharmatech	NO. N000013
4% パラホルムアルデヒド	Beyotime	P0099	組織
AAV8-PCSK9D377Y ウイルス粒子を固定するには	Wzbio	pAV208001	アテローム性動脈硬化症を誘発する
ファイン鉗子	インサイエンスツール	No. 11254-20	大動脈郭清用
ImageJ	NIH	1.47
イソプロパノール	サンゴン バイオテクノロジー	A600918	余分なオイルをきれいにするには オイルレッド
オイル レッド O 0.5% イソプロパノールの	ポリ サイエンティフィック R&D Corp	S1849-32OZ	オイルレッドO染色用
酸緩衝生理食塩水	Servicebio	G4202	大動脈の灌流と洗浄用
スプリングハサミ	ファインサイエンスツール	No. 15003-08	大動脈解剖用
体顕微鏡	Mshot	MZ62	動脈解剖とイメージング用
西洋の食事	研究ダイエット	D12108C	テローム性動脈硬化症を誘発する

ファ溶液 リン 実 大ア