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方法論記事

オイルレッドO染色によるAAV8-PCSK9注射マウスの大動脈のアテローム性動脈硬化症の評価

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DOI:

10.3791/68795

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2025年8月8日

 , 
1Department of Endocrinology, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, 2Anhui Provincial Key Laboratory of Metabolic Health and Panvascular Diseases

この記事について

サマリー

このプロトコルは、オイルレッドO染色を用いて、マウス大動脈の顔面アテローム性動脈硬化性病変を解剖、灌流、染色、イメージング、および定量するための段階的な方法を説明する。

要約

マウスモデルは長い間、アテローム性動脈硬化症の研究における基本的なツールであり、プラーク形成、脂質代謝、心血管炎症の根底にある分子および細胞メカニズムについての重要な洞察を提供します。 Apoe-/- または Ldlr-/- マウスを超えて、西洋型食餌を同時に摂取した正常な C57BL/6J マウスへの AAV8-PCSK9D377Y 注射は、アテローム性動脈硬化症のトランスレーショナル研究に一般的に使用されるモデルとして浮上しています。オイルレッドO染色は、血管組織内の中性脂質蓄積を視覚化するための基礎技術です。脂質を含んだ病変を検出するためのそのシンプルさ、費用対効果、および高感度により、前臨床研究でアテローム性動脈硬化性プラークの負荷を評価するためのゴールドスタンダードとなっています。この研究では、ピンや複雑な取り付け手順を必要とせずに、顔面大動脈の解剖、灌流、縦方向の開口部、オイルレッドO染色、イメージング、および半自動定量化のための詳細で再現性のあるプロトコルを提供します。私たちの結果は、AAV8-PCSK9D377Y 注射と西洋型食事療法の組み合わせがマウスに重大なアテローム性動脈硬化病変の形成を効果的に誘発すること、および顔面オイル レッド O 染色が脂質沈着とプラーク負荷を評価するための信頼性が高く効率的な技術であることを示しています。さらに、このプロトコルは、C57BL/6JマウスにおけるAAV8-PCSK9誘導モデルに最適化されていますが、 Apoe-/- マウス、 Ldlr-/- マウス、 Ldlr-/- ゴールデンシリアハムスターなど、他のモデルや種での使用に容易に適応させることができます。

概要

動脈内膜内の脂質の沈着と炎症を特徴とするアテローム性動脈硬化症は、冠動脈疾患および心筋梗塞や脳卒中を含む広範囲の心血管疾患 (CVD) の病理学的基盤を表します 1,2,3,4。CVD は依然として世界中の罹患率と死亡率の主な原因であり、世界的な健康と経済的負担に重大な影響をもたらしています 3,5。CVD の主な病理学的根拠として、アテローム性動脈硬化症は、その根底にあるメカニズムを明らかにし、効果的な治療戦略を開発することを目的とした広範な研究の注目を集めています。マウスモデルは、アテローム発生の根底にあるメカニズムを解明し、潜在的な治療介入を評価する上で中心的な役割を果たします6。動物モデルの開発は、アテローム発生の理解を進めるのに役立ち、研究者が関与する細胞および分子メカニズムを分析し、新たな治療戦略を評価することが可能になりました6,7。アポリポタンパク質E欠損(Apoe−/-)および低密度リポタンパク質受容体欠損(Ldlr−/−)マウスなどのアテローム性動脈硬化症の古典的なマウスモデルは、高脂血症と堅牢なプラーク形成を誘発するために長い間採用されてきました。ただし、これらの遺伝子組み換え系統の生成と維持には広範な育種が必要であり、時間がかかり、実験の柔軟性が制限される可能性があります8,9,10。これらの制限を克服するために、プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン 9 型 (AAV8-PCSK9D377Y) の機能獲得変異をコードするアデノ随伴ウイルス血清型 8 を利用した代替アプローチが注目を集めています。野生型C57BL / 6Jマウスに西洋型の高脂肪、高コレステロール食と組み合わせて投与すると、この方法は、複雑な遺伝子交配やアテローム性動脈硬化症の傾向のある背景へのバッククロスを必要とせずに、比較的短い時間枠で高コレステロール血症とアテローム性動脈硬化性病変を効率的に誘発します9,11.AAV8-PCSK9 モデルには、その利点にもかかわらず、検討に値する特定の制限があります。特に、高コレステロール血症およびアテローム性動脈硬化性病変の発生の程度は、ウイルスの投与量や投与手段などの変数によって影響を受ける可能性があり、動物間のばらつきが生じ、実験結果の再現性に影響を与える可能性があります11。

このようなモデルで疾患負荷を評価するために、大動脈の顔面オイルレッドO染色は、血管系の管腔表面に沿って脂質に富むアテローム性動脈硬化症病変を視覚化および定量するための確立された高感度技術を提供します12,13。このアプローチは定性的データと定量的データの両方を提供し、遺伝子操作、薬理学的介入、または食事調節の効果を評価するための前臨床研究で広く使用されています14。

この研究では、マウントマウス大動脈全体のアテローム性動脈硬化病変の単離、灌流、縦方向の開口部、オイルレッドO染色、イメージング、および半自動定量のための実用的で再現性のあるプロトコルを提示します。このプロトコルでは、AAV8-PCSK9D377Yを尾静脈注射を介してマウスあたり5×1011ベクターゲノム(vg)の用量で投与する。脂肪から40kcal、コレステロール1.25%を含む西洋食(WD)と組み合わせると、12〜16週間以内に強力なアテローム性動脈硬化病変の発生が観察されます。ここでのプロトコルはプロセスの各ステップを合理化し、組織をワックス表面にピンで留める必要をなくし、代わりにばらつきと技術的な要求を軽減する簡素化された平坦化技術を採用しています。この方法は、C57BL/6JマウスにおけるAAV8-PCSK9D377Y誘導モデルに最適化されているだけでなく、Apoe-/-およびLdlr-/-マウス、およびLdlr-/-シリアゴールデンハムスター15,16,17,18,19を含む、広く使用されているアテローム性動脈硬化症の他のモデルにも容易に適用できます、人間のような脂質代謝により有望なモデルとして浮上しています。

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プロトコル

すべての動物処置は、NIHに概説されているガイドラインに従って実施され、中国科学技術大学の動物倫理委員会によって承認されました(倫理承認番号。USTCACUC27120124102)。

注: AAV8-PCSK9 を含むすべての手順は、バイオセーフティ レベル 2 (BSL-2) 条件下で認定されたクラス II 生物学的安全キャビネットで実施する必要があります。職員は、白衣、使い捨て手袋、安全ゴーグルなどの適切な個人用保護具 (PPE) を着用する必要があります。

1.マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の誘導

  1. 8週間齢のC57BL / 6JマウスにAAV8-PCSK9D377Y (尾静脈を介して5×1011 vg/マウス)を静脈内注射します。
  2. 注射直後にマウスをWD(脂肪から40%kcal、コレステロール1.25%を含む)に置きます。
  3. マウスWDを12〜16週間給餌して、アテローム性動脈硬化性病変の形成を誘導します。
    注:12週間の摂食期間が一般的に使用され、特にAAV8-PCSK9誘発モデルにおいて、明らかなアテローム性動脈硬化性プラーク形成を誘発することが示されています。期間が長い (例: 16 週間) と、病変がより進行する可能性があるため、特定の実験目標に基づいて最適な時点を選択する必要があります。
  4. 授乳期間中、体重、一般的な健康状態、血漿脂質レベルを定期的に監視してください。脂質プロファイリングでは、ベースラインおよび選択された時点 (例: 4 週間ごと) で、短時間のイソフルラン麻酔下で顎下または尾静脈出血を介して血液サンプルを収集します。

2.安楽死と灌流

  1. ペントバルビタールナトリウム(200 mg / kg、腹腔内注射)を投与してマウスを安楽死させます。
  2. 胸腔を開いて心臓を露出させます。
  3. 右心耳を切開し、21 G針を使用して左心室から冷たいリン酸緩衝生理食塩水(PBS、約10 mL)を灌流し、血液を洗い流します。

3.大動脈解離

  1. 肺や胸腺などの余分な組織を除去して、胸部大動脈を心臓から横隔膜まで露出させます。
  2. 細かい解剖はさみと精密鉗子を使用して、大動脈弓の周囲の周囲の脂肪組織を除去します。横隔膜近くの胸部大動脈の基部を取り巻く脂肪組織をそっと持ち上げます。細かい解剖はさみを使用して脂肪組織の根元に沿って切除し(血管構造が損傷しないように)、大動脈弓まで上向きに解剖を続けて大動脈血管を完全に露出させます。
    注:大動脈からの血管周囲脂肪組織の解離は重要であり、大動脈を解剖してPBSに入れると、大動脈からの血管周囲脂肪の解剖は技術的に困難であるため、このステップは大動脈を その場で (マウスから切断する前に)実行することが提案されます。
  3. 精密はさみを使用して胸部大動脈の基部にある血管を横断します。鉗子で切断端を持ち上げ、大動脈弓に向かって血管に沿って上向きに解剖します。大動脈の3つの主要な枝を適切な距離で切断します。
  4. 大動脈基部を横断して胸部大動脈を心臓から分離し、さらなる分析のために完全なセグメントを分離します。
  5. 切除した容器を事前に冷却した4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液に移し、4°Cで一晩(12〜16時間)インキュベートします。取り扱いを標準化し、バッチ処理を容易にするために、固定中に個々の大動脈を24ウェルまたは48ウェルプレートのウェルに入れます。
    注:PFA中での過度のインキュベーションは血管硬化を引き起こし、縦方向の切片化やさらなる分析を妨げる可能性があるため、長時間の固定(24時間以上)は避けてください。
    注意:4%PFAは有毒で揮発性の固定剤であり、呼吸器および皮膚への曝露のリスクをもたらします。PFA 固定を含むすべての手順は、ニトリル手袋、白衣、安全メガネなどの PPE を着用した状態でヒューム フード内で実行する必要があります。吸入や皮膚への接触を避けてください。使用済みの PFA 溶液は、指定されたホルムアルデヒド廃棄物容器に収集され、明確なラベルが貼られ、施設または認可された化学廃棄物処理サービスによって有害化学廃棄物として処分する必要があります。

4.オイルレッドO染色

  1. 固定大動脈をPBSで3回洗浄して、残留PFAを除去します。
  2. 図1に示すように、解剖顕微鏡下で細いはさみを使用して、大動脈基部から内側の湾曲に沿って縦方向に大動脈を開きます。あるいは、固定前に大動脈を開くと、取り付け中に血管の展開と位置合わせが容易になる場合があります。必要に応じて、腕頭動脈 (BCA)、右頸動脈 (RCA)、左鎖骨下動脈などの大動脈弓の主要枝を縦方向に開き、追加の領域を露出させます11。このステップでは、これらの領域のプラークが剥がれたり損傷したりする可能性があるため、注意してください。
    注:どちらのアプローチも、オペレーターの好みと組織の状態に基づいて選択できます。
  3. イソプロパノールの0.5%ストックを脱イオン水で3:2の比率(v / v、最終濃度0.3%)で希釈することにより、オイルレッドO作業溶液を調製します。37°Cのウォーターバスで5分間インキュベートし、染料を完全に溶解します。
  4. 0.22〜0.45μmの膜でろ過して沈殿物を除去します。使用するまで溶液を37°Cの水浴に保管してください。
  5. 各ウェルからPBSを除去します。オイルレッドO作業溶液を加えて、大動脈を完全に浸します。室温(RT)で10分間インキュベートします。
  6. インキュベーション後、溶液を吸引し、すぐに1 mLの60%イソプロパノールを各ウェルに加えます。プレートをシェーカーの上に置き、軽くかき混ぜて洗います。
  7. 約30秒後、血管の非病変領域が半透明に見えたら、イソプロパノールを吸引して洗浄を中止します。サンプルをPBSで2回すすぎます。
  8. オイルレッドO染色後、必要に応じて、残留血管周囲脂肪組織をさらにトリミングします。この段階では、脂肪組織は通常、十分に染色され、視覚的に区別できるため、血管壁の完全性を損なうことなく、より正確な識別と除去が可能になります。
  9. オイルレッドO染色後、大動脈を縦方向に開き、スライドガラスに慎重に平らに取り付けて、実体顕微鏡下ですぐにイメージングします。
  10. または、イメージングする前に、サンプルを4°CのPBSに短期間保存します。平らにするのが難しい動脈の場合は、細い針を使用して血管を黒いワックスプレートに固定し、最適な位置と透明度を確保します。長期保存のために、染色された血管をスライドガラスに取り付け、グリセロールゼラチンで密封してから、直接画像化します。
    注:染色された大動脈を新しいプレートに移して洗浄し、残留オイルレッドOによる汚染を防ぎます。
    注意: オイル レッド O は、通常、可燃性で刺激性のイソプロパノールで調製される親油性染料です。ORO溶液は、ヒュームの吸入を避けるために、化学ヒュームフードで取り扱ってください。皮膚や目との接触を避けてください。オイルレッドO染色液は、可燃性の化学廃棄物容器に別々に収集する必要があります。地域の有害廃棄物処理規制に従って廃棄してください。

5. イメージング

  1. 染色された大動脈を白い背景に取り付けて、コントラストを高めます。船舶の柔軟性を維持します。
    注:高コントラストの背景は、画像解析ソフトウェアを使用したより効率的なプラーク認識を容易にします。ユーザーの好みに基づいて、他の背景色を使用することもできます。
  2. フラットベッドスキャナーまたは高解像度カメラを備えた解剖顕微鏡を使用して、大動脈全体を画像化します。
  3. サンプル全体で均一な照明と一貫した倍率を確保します(例:6〜8倍の倍率)。イメージング中に大動脈が乾いた場合は、生理食塩水またはPBSを浸したキウイワイプを使用して水分補給してください。

6. アテローム性動脈硬化性病変の定量化

  1. ImageJで画像を開きます。以下の手順では、ImageJを例に分析手順を説明します。
    注:他の画像解析ソフトウェア(Zeiss Zen、Fijiなど)も、ユーザーの好みや可用性に応じて使用できます。
  2. 既知の基準(スケールバーや定規など)を使用してスケールを設定します。 直線ツール を使用して、既知の距離に描画します。[ 解析]>[スケールの設定]に移動し、距離と単位を入力し、[ グローバル]を選択して[ OK]をクリックします。
  3. ポリゴンまたはフリーハンド選択ツールを使用して、大動脈領域全体の輪郭を描きます。
  4. [解析] > [測定] を使用して面積を計測します。
  5. 画像>色しきい値の調整を使用してアテローム性動脈硬化性プラーク領域>特定します。彩度と明るさを調整して、オイルレッドのO陽性領域を分離します。
  6. [ 選択 ]をクリックして、染色領域のバイナリ選択を生成します。[ 分析]> [測定]を使用して、選択した領域を測定します。バッチ内のすべての画像に同じしきい値設定を適用します。
    注:残留脂肪またはアーティファクトが偽陽性染色を引き起こす可能性があることを考えると、ユーザーは、特定の実験ニーズと画質に基づいて、手動または半自動でプラーク領域を定義することを選択できます。プラーク面積の手動トレースは、血管面積の総量を定義するのと同じ方法を使用して実行できます。
  7. 結果(ファイル>結果として保存>)を.csvとしてエクスポートして、さらに分析します。
  8. プラーク面積/大動脈総面積を 100% ×として表現します。アテローム性動脈硬化性プラーク負荷のより正確な評価を得るには、解剖学的領域(例えば、大動脈弓、特に小湾曲、および総大動脈)によってプラーク面積を定量化し、その結果を各領域の総表面積に対するプラーク面積の割合として表します:プラーク面積(%)=(プラーク面積/領域の総面積)×100%。
    注:潜在的なバイアスを最小限に抑えるために、盲検分析をお勧めします。多数の画像を解析する場合、マクロレコーダー(プラグイン>マクロ>記録)を使用してしきい値設定から測定までのワークフロー全体を自動化し、処理 >バッチ>マクロを使用して一括処理できます。これにより、効率的で再現性のあるハイスループット分析が可能になります。

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結果

大動脈壁における脂質沈着の程度を評価するために、AAV8-PCSK9D377Y を注射し、年齢が一致した対照マウスとともに12週間西洋食を与えた雄C57BL / 6Jマウスから単離された大動脈に対して、表面オイルレッドO染色を実施しました。PBS による全身灌流と慎重な解剖の後、大動脈全体を慎重に縦方向に解剖し、オイル レッド O で染色して、脂質を含有するアテローム性動脈硬化病変を視覚化しました。全体的な実験手順を 図2に示します。 図3に示すように、オイルレッドO陽性領域(赤)は対照マウス(プラーク被覆率0%)ではほとんど観察されなかったが、AAV8-PCSK9 D377Y 注射マウス(平均プラーク被覆率17%)では、特に大動脈弓および分岐点周辺で著しく増加した(病変部位はApoeまたはLdlr欠損マウスで観察されたものと類似していた)。定量分析では、対照と比較して、AAV8-PCSK9 グループでプラーク負荷の有意な増加がさらに実証されました。これらの結果は、AAV8-...

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ディスカッション

この研究で説明されているエンフェイスオイルレッドO染色法は、大動脈全体のアテローム性動脈硬化性病変負荷を評価するための堅牢で再現性があり、時間効率の高いアプローチを提供します。この研究では、大動脈全体ではなく、プラーク分析の対象領域として大動脈弓と胸部大動脈を具体的に選択しました。この決定は、通常、Apoe−/−およびLdlr−/−マウスなどの古典的な遺伝子ノックアウトモデルと比較して、アテローム性動脈硬化性プラーク形成の広範囲が少ないAAV8-PCSK9D377Yモデル20の性質によって導かれました。同じ期間のWD栄養(例えば、12〜16週間)を受けた場合、AAV8-PCSK9D377Yモデルは、プラークの蓄積が主に大動脈弓に局在し、より小さな病変領域を示す傾向があります。さらに、研究目的で動物を使用するという「...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金からの助成金(助成金番号82370444)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
C57BL/6J マウスGemPharmatech NO. N000013
 4% パラホルムアルデヒドBeyotimeP0099組織
AAV8-PCSK9D377Y ウイルス粒子を固定するには WzbiopAV208001アテローム性動脈硬化症を誘発する
ファイン鉗子インサイエンスツールNo. 11254-20大動脈郭清用
ImageJNIH1.47
イソプロパノールサンゴン バイオテクノロジーA600918余分なオイルをきれいにするには オイルレッド
オイル レッド O 0.5% イソプロパノールのポリ サイエンティフィック R&D CorpS1849-32OZオイルレッドO染色用
酸緩衝生理食塩水ServicebioG4202大動脈の灌流と洗浄用
スプリングハサミファインサイエンスツールNo. 15003-08大動脈解剖用
体顕微鏡MshotMZ62動脈解剖とイメージング用
西洋の食事 研究ダイエットD12108Cテローム性動脈硬化症を誘発する
ファ溶液 リン 実 大ア

参考文献

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