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方法論記事

マウスにおける二次中大脳動脈閉塞モデルにおける虚血性脳卒中再発性損傷の調査

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DOI:

10.3791/68806

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2025年9月16日

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of California, Davis, 2Department of Nutrition, China Medical University, 3Division of Neurosurgery, Department of Surgery, College of Medicine and Hospital, National Taiwan University, 4Institute of Toxicology, College of Medicine, National Taiwan University, 5Department of Medical Research, China Medical University Hospital, China Medical University, 6Department of Pediatrics, College of Medicine and Hospital, National Taiwan University

* These authors contributed equally

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サマリー

ここでは、再発性虚血性脳卒中の進行を調べるために、マウスの二次中大脳動脈閉塞の方法を提示します。外科的処置、術後のケア、神経細胞の病理学的変化、および生存率について説明します。

要約

脳卒中は、死亡と障害の世界的な原因の第 2 位であり、脳卒中の再発は予後不良と神経学的負担の増加に大きく寄与しています。急性臨床脳卒中管理の進歩にもかかわらず、再発性虚血性脳卒中の実験モデルは、処置が複雑で死亡率が高いため、依然として限られています。この研究では、マウスモデルで再発性虚血性脳卒中を確立し、2 段階の中大脳動脈閉塞 (MCAO) プロトコルを使用して脳の病理学的変化と機能障害を評価することを目的としました。成体雄C57BL/6Jマウスは、レーザードップラー血流モニタリング下で一過性MCAOを受けました。脳卒中の再発をシミュレートするために、最初の手術の 14 日後に二次 MCAO が実施されました。術後の評価には、自発運動分析、6 点スコアリング システムを使用した神経行動障害のスコアリング、低酸素誘導因子 1α (HIF-1α) および腫瘍壊死因子 α (TNF-α) などの炎症マーカー、およびヘマトキシリンとエオシン (H&E) 染色を使用した組織病理学的評価が含まれていました。MCAOの再投与後、マウスは対照群と比較して、自発運動活動の有意な低下、運動速度の低下、神経行動スコアの低下、および炎症マーカーの増加を示しました。病理組織学的検出により、再発MCAOマウスの皮質および海馬における中等度から重度の神経細胞壊死、神経瞳孔形成、局所出血が明らかになりました。炎症マーカーは、この再発性 MCAO 手順でも誘導されました。この 2 段階の MCAO マウス モデルは、一貫した神経学的および病理学的転帰で再発性虚血性脳卒中を効果的にシミュレートし、術後生存率を改善する方法を初めて提示します。このモデルは、機構研究のための信頼できるプラットフォームを提供する可能性があり、再発性脳卒中に対する神経保護療法の将来の評価に適用される可能性があります。

概要

脳卒中は依然として世界中で主要な死因と長期障害であり、重大な臨床的および社会経済的負担を引き起こしています。世界中で3,000万人以上が脳卒中とその影響(運動能力の喪失、認知障害、血管疾患のリスク増加など)の影響を受けています1,2。血栓溶解療法や血管内血栓除去術などの急性期治療が進歩したにもかかわらず、多くの生存者は依然として脳卒中再発のリスクが高く、予後の悪化、障害の拡大、死亡率の増加と関連しています。再発性脳卒中は、一次イベントから 90 日以内に患者の約 10-20% で発生し、一過性脳虚血発作または軽度の脳卒中の期間中にリスクが最も高くなります3。さらに重要なことは、再発性脳卒中は血管領域に影響を及ぼし、脳血行動態障害4、急性および慢性の免疫調節不全、皮質下ニューロン壊死5 などのより広範な梗塞と重度の損傷を引き起こすことが多く、脳がより脆弱になり、最初の虚血性損傷後により多くの合併症を引き起こす可能性があることを示唆しています。

最近のいくつかの研究では、実験動物で虚血性または出血性脳卒中モデルを実施し、ヒトの臨床状態に適合する領域固有の損傷パターン、神経血管反応の破壊、およびさまざまな内因性修復メカニズムを明らかにしました6,7。しかし、再発性脳卒中の研究モデルは、手順が複雑で死亡率が高いため、まだ確立されていません。以前のいくつかの研究では、再発性虚血性脳卒中を研究するための貴重なツールとして浮上した光血栓性マウスモデルが確立されています8,9,10。彼らは、脳卒中を再発したマウスにおける神経損傷の悪化、炎症反応の長期化、および認知機能の低下を示し、多発性梗塞性認知症や炎症性プライミングなどの根底にあるメカニズムを調査しました8,9,10。

別の研究では、両側線条体における再発性脳内出血の新しい高齢マウスモデルが示されており、コラゲナーゼを2回注射した結果、自発運動機能の回復が遅れ、再発マウスに認知機能喪失と神経損傷を引き起こしました11。光血栓性および出血性脳卒中マウスモデルは、固有の方法論の違いを反映して、再発性脳卒中中に異なる解剖学的領域に病変を頻繁に誘発することは注目に値します。このような変動は、ニューロン損傷の不均一なパターンを生成し、微小循環ダイナミクスを混乱させ、末梢免疫応答にさまざまな効果を発揮します11,12。対照的に、虚血性脳卒中の最も代表的なげっ歯類のパラダイムとして広く認められている MCAO モデルは、処置の安定性という利点があり、脳閉塞の部位と期間の両方を正確に制御できます。それにもかかわらず、MCAO と再発性 MCAO は、死亡リスクが実質的に高いことも示しており13,14、実験研究におけるより広範な適用性に重大な制限を課しています。本研究では、再発性脳卒中を模倣する、安定的で再現性のある2段階MCAOマウスモデルの確立を目指しました。関連する神経損傷、機能障害、および組織病理学的変化を評価しました。このモデルは安定した生存率も実証しており、再発性脳卒中の病態生理学および神経保護治療戦略に関する将来の研究への適用可能性を示唆しています。

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プロトコル

すべての動物実験は、国立台湾大学の施設動物管理および使用委員会 (IACUC) によって審査および承認され (研究計画 ID20230335)、実験動物の世話と使用に関する確立された倫理ガイドラインに従って実施されました。

1.動物の準備

  1. 体重20〜25 gの8週間齢の雄C57BL / 6Jマウスを、22±1°Cの制御された環境条件下で、相対湿度55%、12時間の光/12時間の暗サイクルで飼育します。食料と蒸留水を無料で入手できる人道的なケアを提供します。
  2. 28匹の雄マウスを偽(n = 8)、MCAO(n = 10)、および再発MCAO(n = 10)の3つのグループにランダムに割り当てます。動物を2週間隔離します(-d14)。-d7で順応、計量、およびグループ化を実行します。d0 で MCAO を管理します。D0、D2、D14、および D16 で行動テストを実施します。14 日目に再発性 MCAO 手術を行います。

2. 最初の外科的MCAO投与

  1. オートクレーブ滅菌によりすべての手術器具を滅菌し、各マウスの体重を量り、最初の切開の1時間前にカルプロフェンを5mg / kgで経口投与し、酸素混合ガス中で3%イソフルランで麻酔を誘導します。
  2. 呼吸数 (100-120 呼吸/分、BPM) を監視し、まぶたと嚥下反射をチェックして麻酔の深さを評価します。被験者を電子加熱プレートの上に置き、体温を37°Cに維持します。
  3. 頭の近くの背中と首を剃り、掃除機を使用してマウスの毛皮や破片を取り除きます。げっ歯類生存手術のために、眼科用軟膏を塗布し、皮膚をこすり洗いし、無菌手順で消毒します。
  4. はさみと皮膚鉗子を使用して、耳の間に最初の0.5cmの切開を行い、中央固定線の左側と頭蓋骨のブレグマの後方を露出させます。鉗子を使用して頭蓋骨の上部にある軟部組織を取り除きます。
  5. レーザードップラーアダプターをマウスの脳の中央に配置し、左横3 mm、後側2 mmの位置に組織接着剤で貼り付け、アダプターの端が頭蓋底にフィットするように事前にトリミングされていることを確認し、レーザードップラーキャップを接着剤で固定して、継続的な血流モニタリングを可能にします。
    注:このステップでは、レーザードップラーキャップを組織接着剤を使用してブレグマにしっかりと固定し、頭蓋骨の上正中線上の冠状縫合糸と矢状縫合糸の交点に配置して、脳血流の安定したモニタリングを確保します。
  6. 切片領域に自信が持てたら、マイクロピペットを使用して組織接着剤を引き出し、アダプターのベースの周りに接着剤を塗布します。
  7. 歯科用セメントを準備し、ドップラー キャップを囲むのに十分な量を塗布して、処置中の安定性を確保します。
  8. 動物を仰臥位に回転させ、首の正中線に沿って胸部入口からあごに向かって1cmの皮膚切開を行います。
  9. 鈍的解剖を続行して、二腹筋、胸骨舌骨筋、および胸骨乳突筋の後腹部を分離し、続いてリトラクターを使用して筋肉をそっと引き離し、総頸動脈(CCA)、外頸動脈(ECA)、および内頸動脈(ICA)を露出させ、CCAの周りに6-0シルクのセクションを配置します。
    注:このステップでは、CCAとECAの分岐の分離を容易にするために、唾液腺を上向きにする必要があります。ICAはCCAよりも上位に位置しています。皮膚鉗子による鈍的解剖は、血管破裂を防ぎ、周囲の軟部組織と神経を分離するために使用されます。
  10. ECAから突き出た小さな枝(上甲状腺動脈、STA)を見つけます。バイポーラ焼灼器を使用して、この小さな枝を燃やします。焼けた容器を切り裂きます。これにより、ECAがさらに分離されます。
    注:STAは通常、舌骨の大角のレベルより下に出現するECAの最初の枝です。怪我を防ぐために、バイポーラ焼灼器を使用して血管枝を燃やし、止血を実現します。
  11. ECAの周りに6-0シルク縫合糸の2つのセクションを配置します。ECAの遠位側に永久的な結び目を作り、分岐部位に緩い結び目を作ります。
  12. レーザードップラー針プローブを頭蓋骨のプローブアダプターに配置します。取得ソフトウェアに脳血流(CBF)の読み取り値が表示されていることを確認します。ベースラインの読み取り値を記録します。
    注:レーザードップラーによって得られたCBFの標準化された測定値は、灌流単位(PU)として提示され、ベースライン値は通常350〜450の範囲内で校正されました。灌流単位(PU)値の低下が観察された場合は、マウス内のレーザードップラープローブアダプターの位置を調整して、正確な測定を確保します(ステップ2.5を参照)。
  13. 微小血管血管クランプを使用してICAをクランプし、CCAの周りの6-0シルクセクションを使用してスリップノットを作り、CCAを一時的に結紮します。
    注:このステップでは、CBFの減少がレーザードップラーモニターで検出されます。
  14. シリコーンゴムでコーティングされたナイロンモノフィラメントを準備します。シリコンヘッドの先端から9〜10 mmのところにシルバーシャーピーを使用してフィラメントに印を付け、顕微手術用ハサミを使用して、ECAのタイトな縫合糸と緩い縫合糸の間に小さな切開を入れます。
    注:切開部位の残留血液は、血管の完全性を維持するために、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄およびすすぐ必要があります。
  15. フィラメント(シリコンヘッドから)を小さな切開からECAに慎重に挿入します。
    注:このフィラメント挿入ステップは、偽動物では省略されています。
  16. シリコンヘッドの約半分が挿入されたら、動脈とフィラメントの周りの緩んだ縫合糸を少し締め、ICAのクランプを取り外します。
  17. 最初のタイトな結び目の下のECAを切り、ECA容器とフィラメントを慎重に下(反時計回り)に回転させてシリコンヘッドが上を向くようにし、フィラメントの先端をICAに向かって押し上げます。
    注:このステップは重要であり、血管の破壊を最小限に抑え、絡み合いや破裂のリスクを減らすために、反時計回りにゆっくりと実行する必要があります。
  18. シリコン部分全体が血管に入ったら、保持縫合糸を少し締め、CCAのスリップノットを緩め、フィラメントの銀色のマーキングを使用してフィラメントを押し込み続けます。
  19. レーザー ドップラー ソフトウェアを継続的に監視し、CBF の急激な低下が観察されたときに抵抗により適切な力でフィラメントのさらなる前進が妨げられた場合は、遠位中大脳動脈への挿入を終了します。
    注: CBF を虚血前状態の 30% 未満に減らすことは、ロンガ法15 として知られる標準的な手順です。
  20. フィラメントをMCA内に40分間保持して、脳虚血性損傷を誘発します。
  21. 指定された 40 分間の虚血期間後にフィラメントを取り外して CBF を再確立し、組織接着剤を塗布して止血を達成し、対応する回復した CBF 測定値を記録し、すべてのレトラクターを取り外し、頭蓋骨に取り付けられたアダプターを取り外します。
  22. 血管近くの皮膚切開部を創傷クリップで閉じ、体温を37°Cで継続的に監視し、呼吸数を評価します。血圧と呼吸が160〜200BPM以内で安定していることを確認したら、麻酔を中止して回復させます。

3. 第2次MCAO管理

  1. 最初のMCAO手術の14日後に創傷クリップを取り外し、ステップ2.1から2.9を繰り返して頭蓋骨の準備を完了し、レーザードップラープローブの配置を固定し、CCAを露出させます。
  2. 周囲の組織からCCAを分離し、CCAの周囲に6-0シルク縫合糸の3つのセグメントを配置します。
  3. レーザードップラープローブをアダプターに配置し、ベースラインCBFを記録します。
  4. CCAの遠位側にスリップノットを作り、近位端に永久的な結び目を作り、その間に緩い結び目を作ります。
  5. 記載されているステップ2.14に従って、MCAO投与用の閉塞フィラメントのシリコーンゴムでコーティングされたナイロンを調製します。
  6. CCAをパーマネントの近くで小さな切開し、フィラメントをCCAに挿入します。
    注:血管の完全性を維持するために、切開部位の残留血液も洗浄し、PBSですすいでください。これは非常に重要です。
  7. 緩んだ結び目を少し締めて、スリップノットを外します。フィラメントに適切な力がかかり、CBFの著しい減少が検出されるまで、フィラメントをICAに進めます。
    注: CBF を虚血前状態の 30% 未満に減らすことも標準的な手順と見なされます。
  8. ステップ2.20で指定されているように、フィラメントを所定の位置に40分間維持して、虚血性損傷を誘発します。
  9. 指定された虚血間隔が完了したら、最初の MCAO 手術のステップ 2.21 および 2.22 で概説されている手順に従って、フィラメントを抜き、皮膚切開を閉じます。

4. 術後のケア

  1. MCAO 手術後の脱水症状を防ぐために、温かい生理食塩水を 10 mL・kg-1・day-1 で 1 日 2 回、3 日間連続して皮下投与します。10%ポビドンヨード溶液を手術部位に塗布し、アモキシシリン(10mg/kg)を投与して感染を防ぎます。カルプロフェン (5 mg/kg) を 3 日間経口投与して、術後のストレスを軽減し、1 回目と 2 回目の MCAO 処置後の獣医師の監督下での回復を促進します。
  2. マウスの健康状態を毎日評価します。外観の変化、および1回目と2回目の手順中の食物と水の消費量を記録します。

5. 動物の自発運動と神経生物学的損傷の評価

  1. 運動の軌跡、距離、速度を評価することにより、自発運動を評価します。マウスをテストボックス(10 x 20 x 15 cm)内に配置し、低輝度条件下で設定します。
  2. 30分間の安定化期間を通じてマウスをテスト環境に順応させ、その後10分間の正式な評価を行います。移動距離 (cm)、速度 (cm/s)、移動時間 (s)、ゾーン内の合計時間 (s)、最初の発生の潜時 (s)、方位度 (times) などのすべてのパラメーターを記録および分析して、自発運動活動を決定します。
  3. 修正された運動機能スコアリング システム (0-6 ポイント) 16 と mNSS スコア (運動機能評価の一部、6 ポイント) を参照して神経生物学的損傷を評価します 17。
  4. 損傷レベルを次のように定義します: 神経学的欠損がないことのスコア 0、手首または肩に影響を与える前肢の屈曲のスコア 1、横方向の押しに対する抵抗の低下を伴う前肢の屈曲のスコア 2、赤字側に向かって一方向の旋回のスコア 3、赤字側に向かって縦方向の回転のスコア 4、発作活動を伴う縦方向の回転のスコア 5、 そして、動きが完全に失われた場合はスコア 6。

6. ヘマトキシリンおよびエオシン染色プロトコル

  1. MCAOおよび再発性MCAO脳組織を10%ホルムアルデヒド緩衝液に固定し、1 mm冠状マウス脳スライサーを使用して標本を4等分に解剖します。病理学的評価のために3番目の前部を処理します。
  2. パラフィン包埋サンプルの再水和を行います:キシレンを10分間、95%エタノールを10分間、75%エタノールを10分間、50%エタノールを10分間、蒸留水(ddH2O)を10分間、PBSを10分間。
  3. サンプルを染色する:ヘマトキシリン染色を45秒間、温かいddH2Oで30°Cで1分間すすいだ。エオシン染色を30秒間、低温ddH2Oで45秒間染色します。
  4. サンプルを75%、95%、100%エタノール、キシレンでそれぞれ45秒間脱水して乾燥させ、60秒間自然乾燥させます。
  5. スライドを取り付け、暗いチャンバーに保管します。
  6. 確立された基準に従って病変の重症度を 5 段階評価で評価します: 1 = 最小 (<1%)。2 = わずか (1-25%);3 = 中程度 (26-50%);4 = 中等度から重度 (51-75%);5 = 重度 (76-100%)。獣医病理学者による盲検評価の下で脳組織の病理学的検査を実施します。

7. ウェスタンブロッティングプロトコル

  1. プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤(フッ化ナトリウム30 mM、オルトバナジン酸ナトリウム30 mM、およびピロリン酸ナトリウム30 mM)を添加したRIPAバッファーでMCAOおよび再発マウスの脳組織を均質化します。
  2. 遠心分離機で10,000 x gで溶解し、上清を回収します。ビシンコニン酸(BCA)アッセイを使用して上清タンパク質濃度を定量します。
  3. 前述のようにウェスタンブロッティングを行う18:100°Cの沸騰水で沸騰させて調製した変性総タンパク質20μgを8〜12%ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)にロードする。
  4. 100 Vで90分間移し、冷蔵室のPVDFメンブレン上にタンパク質を分離し、3%ウシ血清アルブミンでメンブレンを60分間ブロックします。
  5. 腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α、1:1000希釈)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH、1:2,000希釈)、および低酸素誘導性第1因子アルファ(HIF-1α、1:1,000希釈)と4°Cで一晩インキュベートします。メンブレンを適切な二次抗体とともに1時間インキュベートします。
  6. 強化された化学発光基質キット(ECL)を使用してタンパク質の発現を検出し、デジタルフォトイメージングシステムで視覚化します。

8. 統計分析

  1. データを平均±平均の標準誤差 (SEM) として提示し、一元配置分散分析 (ANOVA) を使用して統計分析を実行し、続いて Tukey の事後検定を実行して、複数のグループ間の差を判断します。 p が 0.05 の場合、結果を統計的に有意<解釈します。

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結果

初回および再発MCAOマウスにおける自発運動活動と神経損傷評価
最初の MCAO 手順では、シリコーン ゴムでコーティングされたナイロン モノフィラメントを ECA、ICA から MCA に 40 分間挿入しました。フィラメントが MCA 領域にとどまっているときに、レーザー ドップラー装置によって脳血流 (CBF) が顕著に低下する (ベースラインの <30%) 低下) ことが検出されました。この手順では、すべてのマウスがこの閾値を安定して達成し、生存しました。以前のいくつかの研究では、他の実験で14 日間の MCAO 外科的治療後に体重変化が回復し19 し、生存条件が安定していることが示されています 2,20,21。

したがって、この研究で...

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ディスカッション

脳卒中は依然として世界中で死亡と障害の第 2 位の原因であり、脳卒中を再発するリスクが高くなります。現在、医療技術や戦略の開発が進んでいるにもかかわらず、脳卒中とその再発の予防は改善するには不十分なままです。ここ数十年で、脳卒中のさまざまな研究モデルが、虚血性脳卒中の損傷とメカニズムの研究調査に広く使用されてきました。その中で、MCAO 手術法は、神経学的メカニズムの探索および保護研究の 40% 以上において、ヒトの虚血性脳卒中障害および合併症に最も近いと考えられています24。それにもかかわらず、外科的に 2 回目の MCAO 手順が複雑で多様性に富んでいるため、動物実験で虚血性再発性脳卒中を調査した研究はほとんどありません。Qiaoらは、ラット25で2番目のMCAOモデルを連続して確立しました。

私たちの発見と同様に、空胞化や細胞壊死喪失などの神経細胞の病理学的変化は、再発動物でより明白です(

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開示事項

著者には宣言すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、国立実験動物センターのチームによって技術的に支援され、台湾の国立台湾大学病院財団(112-S0074)、台湾の中国医科大学病院(CMU113-S-06)、および台湾の台北の国家科学技術委員会(112-2314-B-002-219)からの助成金によって財政的に支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
6-0シルク縫合 シンテー株式会社 TW。ST1NからST6
1mmコロナマウス脳スライサーサーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社、アメリカV11335
動物のヘアクリッパーアーバンナー。株式会社 TWMB033
コロナマウス脳スライサージビック楽器。アメリカ合衆国およびBSMAS001-1
デジタルフォトイメージシステムAzure Biosystem, Inc.、カリフォルニア州ダブリン、アメリカ合衆国Azure -300
電子バイポーラ・カウトライザーインディアマートアーロン940
電子ヒートプレートレプティズーAHM23
眼軟膏ローディ獣医ケア。私達17033-21-38
レーザードップラー検出器ムーア楽器 UK moorVMS-LDF1-HP
レーザードップラープローブアダプターサーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社05-700-76
運動活動検出器 オーキッド・サイエンティフィック社すべてのMaze追跡ソフトウェア。
(全迷路システム)オーキッド・サイエンティフィック社トラケジ。7.39 バージョン
微小血管クランプシンテー株式会社 TW。ST-M104
顕微外科血管はさみシンテー株式会社 TW。ST-V108
呼吸数モニターSDR scientific Ltd. 米国SAR-830/AP
シリコーンゴム被覆ナイロンモノフィラメントフィッシャー・サイエンティフィックNC1773962
皮膚鉗子シンテー株式会社 TW。ST-H212
スキンハサミシンテー株式会社 TW。ST-S014PK
滅菌綿棒ウィナー・メディカル401 003
転送システムセミドライシステム。バイオラッド研究所、アメリカ)1703940
<ストロング>ケミカルズ
10%ポビドン–ヨウ素溶液吉田製薬株式会社 JAPPVP–I 10%
75%エタノール溶液およびnbsp;シグマ・オルドリッチ。米国111727
アモキシシリンシグマ・オルドリッチ(アメリカ );A5955
牛血清アルブミンシグマ・オルドリッチ、アメリカ。A2153
カープロフェンPlexx Inc. 英国MD150-2
GAPDH抗体サンタクルーズ・バイオテクノロジー、カリフォルニア州、アメリカ合衆国SC-32233
H&解バイオパイオニア技術者 CO. TWG1005
低酸素誘導性因子1α抗体セルシグナル伝達技術、MA、アメリカ#36169
イソフルラン(麻酔薬)生命科学R510-22-10
無菌生理食塩水ノヴァ・テック社 USA1760RX
腫瘍壊死因子αセルシグナル伝達技術、MA、アメリカ#3707

参考文献

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Formal Correction: Erratum: Investigating Ischemic Stroke Recurrent Injury in a Secondary Middle Cerebral Artery Occlusion Model in Mouse
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