方法論記事

低密度リポタンパク質の存在下での好中球細胞外トラップを用いた血管内皮細胞の刺激

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DOI：

10.3791/68830

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2025年8月12日

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1Department of Biological Chemistry, Showa Medical University Graduate School of Pharmacy

この記事について

サマリー

ヒト血漿からの低密度リポタンパク質 (LDL) の単離、HL-60 細胞の好中球様細胞への分化、LDL の存在下での好中球細胞外トラップ (NET) の調製、および NET と LDL の混合物によるヒト大動脈内皮細胞の刺激。

要約

好中球細胞外トラップ (NET) は、さまざまな非感染性疾患の原因因子として浮上しており、アテローム性動脈硬化症や血栓症などの心血管疾患に関与しています。NET 形成は血管壁で観察され、NET 形成の血漿マーカーは疾患の重症度とともに増加するという説得力のある証拠があります。ミエロペルオキシダーゼやプロテアーゼなどの好中球由来のNET成分は、血漿リポタンパク質と血管恒常性に影響を与えます。ここでは、低密度リポタンパク質(LDL)の存在下で形成されたNETで血管細胞を刺激する一連の方法について説明します。LDLは、超遠心分離によってヒト血漿から分画されました。HL-60細胞をオールトランス レチノイン酸で処理して好中球様細胞に分化させ、ホルボール12-ミリスチン酸13-酢酸(PMA)で刺激してNET形成を誘導した。PMAの除去とウォッシュアウトに続いて、細胞をさらにLDLとインキュベートしました。NETとLDLを含む収集された上清は、すぐにヒト大動脈内皮細胞(HAEC)を刺激するために使用されました。代表的な応答として、NET処理によって誘発されたHAECの形態学的変化はLDLの存在によって増強され、LDLと組み合わせたNET形成がHAECの応答を増強することを示唆しています。これらの方法は、好中球活性化およびNET関連炎症下での内皮細胞に対するLDLの影響を調査するのに有益であり、血漿LDLの増加に関連する心血管疾患の根底にあるメカニズムについての新たな洞察を提供します。

概要

好中球細胞外トラップ (NET) は、細菌感染時に活性化された好中球によって産生され、非感染性の生理学的に妥当な条件下で、ヒストン、ミエロペルオキシダーゼ (MPO)、好中球エラスターゼ1 などの縮合解除された DNA とタンパク質を放出します。これらの成分は辺縁細胞や組織を解体し、持続的な炎症を引き起こす可能性があるため、NET形成は、関節リウマチ、乾癬、糖尿病、アルツハイマー病、がん転移、心血管疾患など、さまざまな急性および慢性疾患の発症と進行の原因因子として浮上しています2。アテローム性動脈硬化症3 および腹部大動脈瘤4 のヒト血管病変の組織学的分析により、好中球浸潤と NET 形成が共局在していることが示されました。循環血中では、シトルリン化ヒストン、NET-DNA、MPO などの NET マーカーのレベルは、冠動脈疾患の重症度とともに増加します5。アテローム性動脈硬化症の初期段階では、NET 形成は脂質蓄積に先行することが多く、これはマクロファージ駆動の泡細胞形成を介して発生します 6,7。これらの現象は、NET形成中に細胞外に放出されたMPOおよびタンパク質分解酵素が、血管組織だけでなく、リポタンパク質などの血液成分にも作用する可能性があることを強く示唆しています。リポタンパク質は壊れやすい脂質タンパク質複合体であり、MPO8などのNET由来タンパク質によって損傷を受ける可能性があります。したがって、NET の形成はリポタンパク質の構造的および生化学的変化を引き起こし、それによって血管の恒常性に影響を与える可能性があります。しかし、血管細胞誘発性調節不全および炎症反応に対するNET形成とリポタンパク質の相乗効果は不明のままである。

ここで、この原稿は、HL-60由来の好中球様細胞から調製されたNETとヒト血漿から分画した低密度リポタンパク質(LDL)による処理によって誘導されたヒト血管内皮細胞の細胞応答を調べる方法を提供します。代表的な結果は、超遠心分離によるヒト血漿からのLDLの分別と、LDLとの共インキュベーション後にNETで刺激されたヒト大動脈内皮細胞(HAEC)の細胞応答を示しています。この方法は、他のリポタンパク質が関与する血管細胞の研究に広く適用できます。

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プロトコル

LDL調製のプロトコールは、昭和医科大学薬学部倫理委員会で承認されました(第231号)。ヘルシンキ宣言に従って書面によるインフォームドコンセントが得られ、すべての参加者が自発的にこの研究への参加に署名しました。細胞は、層流フードを使用して無菌的に操作されました。包含基準は 22 歳から 65 歳の年齢層でした。除外基準には、喫煙習慣、既存の心血管疾患(冠状動脈性心疾患、脳卒中、末梢動脈疾患など)、重度の肝機能障害、糖尿病、高血圧、脂質異常症、重度の炎症性疾患、がんなどの制御不能な慢性疾患が含まれていました。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1. ヒト血漿からのLDLの単離

  1. 抗凝固剤ヘパリン (10 単位/mL) の存在下で健康な人間のボランティアから全血を採取します。
  2. ヘパリンチューブ(4°Cで15分間700 × g )で得られた45〜50 mLのヒト全血を遠心分離します。遠心分離機の速度をゆっくりと下げてください。血漿画分を含む上層を収集します。
  3. ステップ1.2と同じ減速設定で2回(700 × g、4°Cで15分)遠心分離を行い、血球を除去します。1:1,000 容量の 250 mM EDTA(pH 7.4)を添加して、リポタンパク質の二価金属イオン媒介酸化を防ぎます。
  4. 2.7 mLの血漿を4 mLポリカーボネート(4PC)チューブに入れ、250 μM EDTA(PBS/EDTA)を含む900 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を重ね、超遠心分離機(600,000 × g、4°Cで7分間)します。
  5. カイロミクロンを除去するために、最上層の900 μLを廃棄します。900 μLのPBS/EDTAを血漿および超遠心分離機(600,000 × g、4°Cで2.5時間)に積み重ねます。
  6. 超低密度リポタンパク質(VLDL)を除去するために、最上層の900 μLを廃棄します。このステップは、他のリポタンパク質画分によるLDLの汚染を防ぐために重要です。
  7. 540 μLの0.5 mg / mL KBr溶液を加えて密度を d = 1.063に調整し、続いてピペットで穏やかに混合し、超遠心分離機(600,000 x g、4°Cで2.5時間)します。
  8. LDLを含む最上層を540 μL回収します。黄橙色の層は、LDL分離が成功したことを示します9。透析膜への移送。
  9. LDL画分を暗所で4°Cで2 LのPBS / EDTAに対して3回透析し、KBrを除去します。
  10. 使用前にLDLを暗所で4°Cに保管してください。

2. ポリ-L-リジンまたはゼラチンでコーティングされたウェルの調製

  1. 0.1%ポリ-L-リジン溶液を滅菌水で希釈し、続いて0.2μm滅菌フィルターでろ過することにより、0.01%ポリ-L-リジン溶液10 を調製します。使用前に4°Cで保管してください。
  2. 152 μL/ウェルの0.01%ポリ-L-リジン溶液を12ウェルプレートの各ウェルに加え、少なくとも5分間インキュベートします。
  3. 溶液を取り出し、200 μL/ウェルの滅菌水で1回洗浄し、少なくとも2時間乾燥させます。
  4. NET の調製に使用する前に室温で保管してください。

3. ゼラチンコーティングウェルの調製

  1. 使用前に、2%ゼラチン溶液を滅菌水で希釈して、0.1%ゼラチン溶液を調製してください。
  2. 152 μL/ウェルの0.1%ゼラチン溶液を12ウェルプレートの各ウェルに加え、少なくとも5分間インキュベートします11。
  3. 溶液を取り出し、200 μL/ウェルの滅菌水で1回洗浄し、少なくとも2時間乾燥させます。
  4. 使用前に室温で保管してください。

4. ヒト大動脈内皮細胞(HAEC)の維持と調製

  1. 2%子牛胎児血清(FCS)、5 ng / mL上皮成長因子、10 ng / mL塩基性線維芽細胞成長因子、20 ng / mLインスリン様成長因子、0.5 ng / mL血管内皮成長因子、1 μg / mLアスコルビン酸、22.5 μg / mLヘパリン、および0.2 μg / mLヒドロコルチゾンを含む完全培地を使用して、非コーティング培養フラスコで初代HAECを培養します。 メーカーの指示に示されているとおりです。細胞が70%〜80%コンフルエントになるまで、隔日で培地を交換します。
  2. 刺激のために、ゼラチンでコーティングされた12ウェルプレートにHAECを播種します。合流点に達するまで、隔日で培地を交換します。継承4と7の間で実験を行います。

5. HL-60由来好中球様細胞とそれに続くNETの調製

  1. 未処理の皿を使用して、5%ウシ胎児血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地でHL-60細胞を維持します。
  2. HL-60由来好中球様細胞の調製には、HL-60細胞10mLあたり2×106 細胞を2μMオールトランス レチノイン酸(AtRA)を含むRPMI-1640培地で4日間培養します。

6. LDLを用いたNETの調製

  1. 2 μM AtRA による処理の 4 日後に HL-60 細胞を収集します。HL-60細胞が好中球様細胞に分化した後、細胞は小さくなります。
  2. 細胞を遠心分離します(220 × g、18〜22°Cで4分間)。上清を吸引し、同量の無血清RPMI-1640で細胞を洗浄します。
  3. 細胞を遠心分離し(220 × g、18〜22°Cで4分間)、無血清RPMI-1640で細胞を再懸濁します。
  4. 細胞をカウントし、無血清RPMI-1640で細胞を2×106 細胞/ mLに再懸濁し、ポリ-L-リジンで事前にコーティングされた12ウェルプレートのウェルに0.5 mLの細胞懸濁液を播種します。少なくとも30分間培養します。
  5. 300 nMホルボール12-ミリスチン酸13-酢酸(PMA)の有無にかかわらず、100 μLの無血清RPMI-1640を最終濃度0または50 nM PMAまで添加します。30分間培養します。
  6. 培地を取り出し、無血清RPMI-1640で細胞を一度洗浄します。培地を20 μg/mLのLDLの有無にかかわらず無血清RPMI-1640に置き換え、2時間培養します。
  7. 培地を回収し、遠心分離(700 × g、18〜22°Cで3分間)して細胞破片を除去します。

7. NETおよびLDLによるHAECの刺激

  1. 培地を0.5 mLの新鮮な培地と交換します。刺激前に少なくとも30分間培養します。
  2. NETおよびLDL(ステップ6.7)およびLDLを含む培地167 μLをHAEC皿に加えます。12時間以上の刺激後に誘発されたHAECの形態学的変化を確認します。

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結果

カイロミクロンを除去した後、続いて連続超遠心分離によりヒト血漿からVLDL画分を抽出した後、ヒト血漿をKBr溶液と混合して密度をd = 1.063に調整しました。このステップでは、残りの沈殿剤は溶液に完全に溶解せず、気泡を生成する激しい混合を回避してLDLを無傷に保ちました。超遠心分離後、LDLは最上層の黄橙色9(図1)によって視覚的に評価され、そのすぐ下にある無色の溶液と区別されました。通常、PBS/EDTAに対して採取したLDL画分の透析後、45〜50mLのヒト血液から約23〜25mLの血漿を採取し、約4mg/mLのタンパク質を含む4.3mLのLDL画分を得ることができる。

HL-60細胞を2μM AtRAで処理すると、細胞サイズが減少した好中球様細胞(dHL-60)への細胞の分化が誘導されました。特に、dHL-60の調製では、dHL-60細胞が接着細胞の表面に付着する傾向があり、細胞収量の低下につながるため、接着細胞用の培養皿の使用は避けるべきである。...

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ディスカッション

このプロトコルは、LDLの共存によって誘導されたdHL-60細胞からのNETの調製を説明し、その後HAEC応答の分析に使用されます。このプロトコルの重要性は、他の多くの研究が-20°Cで凍結したNETのストック溶液を利用しているにもかかわらず、細胞の刺激にNETおよびLDLを含む新鮮な培地を使用することである。 リポタンパク質は脂質とタンパク質の複合体であるため、凍結融解中にその無傷の構造と特性が失われ、LDLの変性と凝集を引き起こします。現在の方法の利点は、好中球様細胞から放出されるNET形成産物(脱凝縮DNA、ヒストン、MPO、エラスターゼなど)およびリポタンパク質が無傷のままであり、すぐにHAECに適用できることです。したがって、NET形成中に好中球様細胞から放出される酵素の活性が維持されます。特に、このプロトコルの結果は、LDLの変化に対するNETとの共インキュベーションの影響を反映している可能性があります。以前の研究では、ネイティブLDLはPMA処理されたdHL-60細胞からのDNAまたはMPOの放出を増強しなかったことが報告されています

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

本研究は、日本学術振興会科研費(研究課題番号23K10897、19K07069)の支援を受けました。英語の編集をしてくれたエディテージ(www.editage.jp)に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.1%ポリ-L-リジンシグマ・アルドリッチP8920-100MLです
10cm皿コーニング430591
12ウェル組織培養プレート隼353043
2%ゼラチンシグマ・アルドリッチG1393-20ML型
4PCチューブヒマックS404332A
オールトランスレチノイン酸和光188-01113どのベンダーでも代用可能
セルロース透析チューブミスミグループ株式会社0327-23-37-07 (UC18-32-100)どのベンダーでも代用可能
EDTAの道珍島345-01865どのベンダーでも代用可能
内皮細胞増殖培地 2 キットプロモセルC-22111
ウシ胎児血清ギブコ10270-106どのベンダーでも代用可能
ヘパリンナトリウム(5,000単位/5mL)持田製薬株式会社どのベンダーでも代用可能
高速冷凍遠心分離機トミーSRX-201型加速:9、減速:7
ヒト大動脈内皮細胞ロンザCC-2535
KBr和光168-03475どのベンダーでも代用可能
キーエンス顕微鏡ソフトウェアキーエンスBZ-IIアナライザー
マイクロ超遠心分離機ヒマックCS150GX
顕微鏡オリンポスCK40
顕微鏡キーエンスBZ-9000タイムラプスイメージング用(オプション)
顕微鏡カメラニコンDS-Fi3 (英語)
顕微鏡カメラソフトウェアニコンDS-L4
ペニシリン/ストレプトマイシンギブコ15140-122 100MLどのベンダーでも代用可能
リン酸緩衝生理食塩水(×10)2.6 gのNaH2PO4·2H2O、29 g Na2HPO4·12H2O、80 g の NaCl および 2.0 g の KCl を蒸留水中に溶かし、1 L の容量に調整します。(どのベンダーでも代用可能)
PMA(ホルボール12-ミリスチン酸13-酢酸)和光162-23591どのベンダーでも代用可能
試薬パックロンザCC-5034(CC-5022:HEPES緩衝生理食塩水、CC-5012:トリプシン/ EDTA、CC-5002:トリプシン中和溶液) 
ローターヒマックS100AT6-0242
RPMI-1640(フェノールレッド入り)和光189-02025どのベンダーでも代用可能
RPMI-1640(フェノールレッド無し)和光186-02155どのベンダーでも代用可能
T-25フラスココーニング3275

参考文献

  1. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
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