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方法論記事

Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4 検出のための複合リコンビナーゼポリメラーゼ増幅 CRISPR/Cas12a アッセイ

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DOI：

10.3791/68841

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2025年11月14日

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1Department of Plant Pathology, Faculty of Agrisciences, Stellenbosch University, 2CIRAD, UMR PVBMT, 3Department of Genetics, Faculty of Agrisciences, Stellenbosch University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、外来植物病原体 Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4の検出のために、組み合わされたリコンビナーゼポリメラーゼ増幅CRISPR/Cas12aアッセイが示されている。

要約

定期的かつ正確な監視は、植物の病気の効率的な管理の中心です。どの行動方針が最も適切であるか、予防、根絶、または行動が必要かどうかを示すことができます。宿主植物の症状のみに基づく監視は、生物的ストレスと非生物的ストレスによって引き起こされる症状の類似性のために、しばしば信頼できません。ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) や定量的 (q)PCR などの実験室ベースの分子法は、植物病原体の検出に最も一般的かつ確実に使用されますが、高価な機器と熟練したオペレーターに依存しています。ここでは、侵襲性病原体 Fusarium oxysporum f. sp . cubense tropical race 4(Foc TR4)を検出するための、簡略化されたDNA抽出、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)、およびクラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復(CRISPR)/ Cas12a(RPA-Cas12a)を組み合わせたプロトコルについて説明します。この技術は、利用可能な分子検出アッセイと比較して特異性が向上し、分析的に堅牢であり、高価で高度な実験装置の必要性を排除する、シンプルなシングルチューブ検出の代替手段を提供します。

概要

土壌媒介性真菌病原体フザリウム・オキシスポラム・フ・スプ・キューベンセ(Foc)によって引き起こされるフザリウム萎凋病は、歴史上最も壊滅的な国境を越えた植物病原体の1つとして世界的に見なされています1。新しい地域に導入されると、感染した植物が症状を発症するまで、フォックは目に見えないままになります。これには数か月かかる場合があり、真菌が知らず知らずのうちに定着して広がる可能性があります。一度確立されると、回復力のあるクラミドスポアの生産とバナナ生産の多年生の性質のために、経済的に根絶することはほとんど不可能です。したがって、予防と早期発見の重要性は、脆弱な生産者を保護する上で最も重要です1.Foc熱帯人種4(TR4)によって引き起こされるこの病気の現在の流行は、高リスク地域で症候性のバナナ植物を特定するために、定期的な監視による検出が必要です。水分ストレスや特定の栄養素欠乏などの非生物的制約により、Foc TR4感染によって引き起こされる症状と同様の外部黄変が生じます。また、異なるFoc種族による感染による症状は区別できない。したがって、信頼性の高いFoc TR4検出には、実験室ベースの精製とその後の表現型および分子ベースの検出が必要です2。Foc TR4検出には、PCR、定量的(q)PCR、ループ媒介等温増幅(LAMP)アッセイ3、4、5、6、7など、さまざまな分子アッセイが利用可能です。ただし、これらのプロトコルのほとんどは依然として高価で専門的なスキルと機器を必要とし、実験室環境で実施する必要があります。リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)は等温で実行できるため、そのような機器の必要性がなくなり、現場検出プロトコル8のために検討することができます。

クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復(CRISPR)-Casシステムは、分子診断の改善のためにますます利用されています9。これらのシステムは、安価でシンプルで、特別な機器を使用する必要がないため、現場での検出を検討できるため、採用されています。CRISPRベースの診断には、通常、標的配列の等温増幅、それに続くCRISPR-Casタンパク質による標的認識、および標的10,11の存在を示すDNAまたはRNA蛍光レポーター色素の側副切断が含まれます。特にCRISPR-Cas12aシステムでは、CRISPR RNA(crRNA)がCas12aを誘導して核酸標的を認識して切断します。このcrRNAは、相補的な配列へのハイブリダイゼーションを通じて、特定のDNAまたは目的のRNA領域を標的とするように設計できます。結合すると、Cas12aが一塩基特異性で標的を切断し、続いてレポーター分子12の側副切断が続きます。最近、CRISPR-Cas12aシステムは、さまざまな経済的に重要な真菌植物病原体13、14、15、16、17、18、19、20を検出するために採用されました。

このプロトコルでは、ポータブル蛍光光度計と安価な発光ダイオード(LED)青色光トランスイルミネーター21の下で肉眼の両方で視覚化されたFoc TR4の検出のための簡素化されたDNA抽出、組換えポリメラーゼ増幅(RPA)、およびCRISPR / Cas12a技術(RPA-Cas12a)を組み合わせた単一チューブ検出技術の開発が説明されています.この方法は、予防および封じ込め戦略を改善するために、現場での検出用にさらに最適化できます。同様のアプローチを利用して、他の植物病原体のCas12aベースの検出アッセイを設計することもできます。

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プロトコル

1. 植物材料からのDNA抽出の簡素化

メモ: 概要については、 図 1 を参照してください。

  1. DNA抽出を行います。
    1. 症候性偽茎の各部分250 mgを別の抽出バッグに移します( 材料表を参照)。
    2. 2 mLの0.5 M NaOH-PVP(材料表)を植物材料の入った袋に加えます。感染した血管を抽出バッグに入れて、乳棒のような手動グラインダーを使用して粉砕します。
      注:バッグから十分な液体抽出物を得るために、必要に応じて1〜2 mLの補助0.5 M NaOH-PVPを追加します。
    3. 195 μL の 100 mM Tris-HCL(pH 8.0)(材料表)を 1.5 mL チューブに加えます。
    4. バッグから5 μLの抽出物を1.5 mLチューブに195 μLの100 mM Tris-HCL(pH 8.0)でピペットで入れ、抽出物を40倍に希釈します。
    5. チューブを15〜30秒間ボルテックスし、使用するまで-20°Cで保存します。

2. crRNAの合成と品質管理

  1. 文字起こしを実行します。
    1. RNA転写キット(材料表)を使用して、0.2 mL PCRチューブに以下を追加します:1.5 μLの10x T7反応バッファー、1.5 μLの各dNTP、1.5 μLのT7 DNAポリメラーゼミックス、1 μLのヌクレアーゼフリー水、および10 μLの100 μM T7テンプレートDNA、合計容量20 μL。
    2. チューブを37°CでウォーターバスまたはPCR装置で少なくとも4時間インキュベートします。
    3. 分光光度計(材料表)を使用して、転写されたRNAの量を測定します。ヌクレアーゼフリーの水またはTEバッファーを使用して、RNAを40 μLの容量で250 ng / μL(10 μg)に希釈します(補足ファイル1)。
      注:転写されたRNAは、DNase処理と洗浄ステップを続行するまで-80°Cで保存できます。
  2. DNase処理とcrRNAクリーンアップを行います。
    メモ: すべての手順は室温で実行してください。RNAとDNase I酵素を氷上に保ちます。
    1. 製造元の指示22に従って、RNA洗浄キット(材料表)に含まれるDNase IでRNAサンプルを処理します。
    2. プロトコルII22に従って、製造元の指示に従ってRNA洗浄キットを使用してRNAサンプルを洗浄します。
    3. 洗浄したcrRNAをナノドロップして、存在する量と質を測定します。ヌクレアーゼフリーの水を使用してRNAを100 ng / μLに希釈し、使用するまで-80°Cで保存します。
    4. RNAローディング色素(材料表)でcrRNAをウォーターバスで70°Cに10分間加熱し、crRNAを1.5%アガロースゲル上で電気泳動して、合成されたcrRNAを視覚化します(図2)。

3. in vitro Foc TR4検出のためのリコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)-Cas12aワンチューブ反応

メモ:概要については、 図3 を参照してください。

  1. RPAとCas12aの反応混合物を調製します。
    注:これらのステップは、試薬と材料を予冷した状態で、氷上のDNAのない空間で実行してください。実験前に、作業面とピペットを漂白剤と70%エタノールで拭きます。この研究で使用されたすべてのオリゴヌクレオチドに関する情報については、 表1 を参照してください。
    1. 20 μL Cas12a反応混合物を別の0.5 mLチューブ(材料表)に次の試薬容量で調製します:2 μLの10x NEBuffer r2.1(50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、100 μg/mL組換えアルブミン、pH 7.9)、0.4 μLの10 μM LbCas12aタンパク質、0.6 μLの100 ng/μL crRNA、 0.4 μLの10 μMレポーター、および16.6 μLの脱イオン水。
      注:LbCas12aタンパク質、crRNA、およびレポーターの最終濃度はそれぞれ200 nMです。
    2. 9.5 μLのRPA反応混合物を別の0.5 mLチューブに調製し、試薬容量を同様にします:5 μLの2x反応バッファー(メーカーのガイドラインに従って最終濃度1倍)、1.6 μLのdNTPミックス(最終濃度1.6 mM)、1 μLの10x Basic E-Mix(メーカーのガイドラインに従って最終濃度1倍)、10 μMの各RPAプライマー0.5 μL(最終濃度各0.5 μM)、 0.5 μL の 20x コア反応混合物 (メーカーのガイドラインによる最終濃度の 1 倍)、および 0.4 μL の脱イオン水。
    3. 8本のチューブストリップを氷の上のチューブラック(材料表)に入れます。
    4. 20 μL Cas12a反応混合物をチューブベースに移します。
    5. 9.5 μL RPA反応混合物をチューブストリップの蓋に移します。0.5 μLの280 nM MgOAc(最終濃度14 nM)をチューブストリップの蓋内のRPA反応混合物に加え、上下にピペッティングして混合します。
    6. 0.5 μLの脱イオン水をノンテンプレートコントロール(NTC)チューブの蓋に加え、RPAとCas12aの反応混合物が結合しないように慎重に閉じます。
      注:結果の信頼性を確保するために、非テンプレートコントロール(NTC)が含まれています。
  2. テンプレートDNAを加えて反応を開始します。
    1. 0.5 μLのテンプレートDNAを、MgOAcを含む10 μLのRPA反応混合物に、NTCを除くチューブストリップの蓋に入れ、DNAの代わりに脱イオン水を加えます。アッセイが意図したとおりに機能することを確認するために、常に既知のポジティブコントロールFoc TR4 DNAを1つのウェルに追加してください。上下にピペッティングして混合します。
    2. チューブストリップの蓋を慎重に閉じて、RPA反応とCas12a反応が混ざらないようにします。
    3. ポータブル蛍光光度計(材料表)の電源を入れ、RPA-Cas12aアッセイの ランプロファイル を作成します(補足ファイル2)。保存した ランプロファイル を開き、チューブストリップをポータブル蛍光光度計に入れ、37°Cで30分間インキュベートします。
      注意: チューブストリップを取り扱うときは、チューブの底に触れないように注意してください。代わりに、左上端と右端の外縁を持ちます。
    4. 30分後にポータブル蛍光光度計からチューブストリップを取り外します。チューブを6回反転させてRPA反応とCas12a反応を混合し、ミニ遠心分離機( 材料表を参照)で5秒間スピンダウンします。
    5. チューブストリップをポータブル蛍光光度計に戻し、保存した ランプロファイルを使用して37°Cでさらに30分間インキュベートします。
  3. 結果を視覚化します。
    1. ポータブル蛍光光度計で測定された平均相対蛍光単位(RFU)を解釈します(補足ファイル2 およびユーザーマニュアル23)。
    2. 青色光トランスイルミネーターを使用して、465 nmの励起波長のLED青色光の下でチューブを視覚化します(補足ファイル3)。携帯電話のカメラで画像をキャプチャします。

   

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結果

Genie IIIポータブル蛍光光度計で実施した場合の、簡略化されたDNA抽出とそれに続くRPA-Cas12aアッセイの組み合わせを使用して、感染した植物材料からFoc TR4を正常に検出したことを 図4Aに示します。陽性サンプルは可視蛍光(レーン6-8)を示し、陰性サンプルは低い終点蛍光(レーン1-5)を示します。サンプルチューブをLEDブルーライト下で観察すると、Foc TR4に感染したサンプルも可視蛍光を示しました(図4B)。対照的に、Foc TR4に感染していない植物組織からのDNAは、目に見える蛍光を生成しませんでした。

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ディスカッション

定期的な監視は、Foc TR4 やその他の重要な侵入害虫の効果的な予防と封じ込めの取り組みのための重要な戦略です。現場で適用でき、病原体を迅速かつ正確に特定できる検出プロトコルは、意思決定を迅速に追跡し、監視活動に関連するコストを制限できます。この目的のために、ここで提示されたプロトコルは、Foc TR421の迅速かつ高感度な検出のために、サンプリングされた植物材料に対して直接実施された簡略化されたDNA抽出を組み合わせ、その後RPAとCas12a反応を組み合わせた1本チューブアッセイに含まれました。

提示されたRPA-Cas12a複合プロトコルの最も重要な利点の1つは、それが提供する二重の特異性です。増幅ステップでは、特異的なRPAプライマーに依存し、その後、Cas12a crRNAによる標的配列の認識により、一塩基特異性を有することが示されています12。Cas12プロトコルの初期最適化では、crRNAの転写はLiら<...

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開示事項

著者は、競合する金銭的または知的利益を宣言していません。

謝辞

私たちは、未評価の研究者プログラムに対する競争的支援の下で、南アフリカ国立研究財団(助成金番号:138109)からの資金提供に感謝します。また、欧州連合のホライゾン2020研究およびイノベーションプログラムであるマリー・スクロドフスカ・キュリー・フェローシップのINDICANTSプロジェクト助成金番号:890856に基づく資金提供にも感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
EnGen lba Cas12a(CFP1)タンパク質ニューイングランド・バイオラボM0653T
EnGen lba Cas12a 希釈剤ニューイングランド・バイオラボB0653A
エッペンドルフPCRチューブメルクEP0030124332
エッペンドルフ・セーフロックマイクロ試験管メルクEP0030121708
エクストラクションバッグズ・ユニバーサルビオレバ430100
GeneRuler 100 bp DNAラダーサーモ・フィッシャー・サイエンティフィックSM0241 / SM0242
ジーニー遠心分離機ミニ6KOオプティジーンオプフージ
ジーニーIIIオプティジーンhttps://www.optigene.co.uk/instruments/genie-iii/ 
ジーニー・ストリップ・ホルダーオプティジーンGBLOCK-01 / GBLOCK-02 / GBLOCK-03
ジーニーストリップオプティジーンOP-0008-50 / OP-0008-500
HiScribe T7 高収量RNA合成キットニューイングランド・バイオラボE2040S型
NanoDrop ND-1000 UV/VIS 分光光度計サーモ・フィッシャー・サイエンティフィックhttps://caeonline.com/buy/spectrometers/nanodrop-nd-1000/293669253
NEBuffer 3ニューイングランド・バイオラボB7003S
NEBuffer r2.1ニューイングランド・バイオラボB6002S
ポリビニルピロリドン(PVP)粉末シグマ・オルドリッチ9003-39-8
RNAクリーン&コンセントレーター-5キットザイモリサーチR1013
RNAローディングダイサーモ・フィッシャー・サイエンティフィックR0641
スマートブルーブルーライトトランスイルミネーターアキュリス・インスツルメンツE4000-E
水酸化ナトリウム(NaOH)ペレットメルク、EMPARTAK277
トリス(ヒドロキシルメチル)アミノメタンメルク77-86-1
TwistAmp リキッドベーシックキットツイストDxTALQBAS01

参考文献

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