初代ラット精巣上体脂肪細胞における脂肪分解の正確な定量のためのグリセロール放出のMTTベースの正規化

Summary

細胞生存率の変動やアッセイの干渉などの実験的アーティファクトは、脂質が豊富な初代脂肪細胞におけるグリセロール放出の正確な定量を妨げます。これらの課題を軽減するために、MTT ベースの正規化戦略を使用して細胞代謝活性のグリセロール測定値を調整し、それによって脂肪分解定量の信頼性を高めます。

Abstract

重要な代謝経路である脂肪分解には、貯蔵されたトリグリセリドが遊離脂肪酸とグリセロールに加水分解されることが含まれます。ただし、脂質が豊富な初代脂肪細胞におけるグリセロール出力の正確な定量は、細胞生存率の変動やアッセイの干渉などの実験的アーティファクトによって混乱することがよくあります。これらの制限に対処するために、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物(MTT)ベースの細胞生存率アッセイを使用して、グリセロール放出測定値を正規化する簡単な方法が確立されました。このプロトコルは、脂肪細胞と水溶液の間の比重差を利用し、脂肪分解出力と細胞生存率の同時定量を可能にします。薬物スクリーニング実験では、プラバスタチンとシンバスタチンは腹部脂肪細胞からのグリセロール放出を有意に増強しましたが、アトルバスタチンとロバスタチンはグリセロール出力を有意に変化させませんでした。これらの発見は、MTT ベースの正規化が脂肪分解を正確に定量するための堅牢で便利なアプローチを提供し、肥満やメタボリックシンドロームを標的とした創薬への応用の可能性を示唆しています。この研究は、真の代謝反応と非特異的膜漏出を区別するために、従来の脂肪分解アッセイを再評価する必要性を強調しています。

Introduction

脂肪組織は、白色脂肪組織 (WAT) と褐色脂肪組織 (^{BAT) に}分けることができます1。WATはトリグリセリドとして余剰エネルギー貯蔵の機能を果たし、BATは^寒さの刺激下で化学エネルギーを熱エネルギーに変換する体温を維持するための発熱機能を持っています1。脂肪組織には内分泌機能もあります².さまざまなホルモン、サイトカイン、代謝産物(総称してアディポカインと呼びます)を分泌し、中枢神経系からの食物を求める行動と^{周囲組織の}代謝活動を調節することにより、体のエネルギーバランスを制御することができます2。

脂肪分解は、一連の脂肪分解酵素^3,4の作用下での細胞内脂質の段階的な加水分解プロセスです。脂肪細胞では、脂質は主にトリグリセリドの形で脂質滴に貯蔵^{されます5。}脂質滴は脂質滴関連タンパク質ペリリピンファミリーで覆われており、脂肪分解酵素^によるトリグリセリドの加水分解を防ぎます^6,7。しかし、脂肪分解シグナルが増強されると、脂肪細胞におけるペリリピンファミリーの発現レベルが低下し、脂肪分解酵素が脂質滴に入ります^3,4。その結果、トリグリセリドはグリセロールと遊離^{脂肪酸に分解}されます^3,4,5。

脂肪分解は、貯蔵されたトリグリセリドをグリセロールと遊離脂肪酸に分解するもので、脂肪細胞代謝の基本的なプロセス^です8。グリセロールなどの脂肪分解産物を直接測定すると貴重な洞察が得られますが、特に浮遊初代脂肪細胞では、実験グループ間の細胞数の違いから生じる操作エラーにより、正確な定量化が困難でした。この研究は、細胞生存率アッセイを採用して、初代ラット腹部脂肪細胞からのグリセロール放出の定量化を正常化することにより、この課題に対処することを目的としていました。測定方法を標準化することにより、標準化されたグリセロール放出アッセイは、脂肪細胞における肥満およびメタボリックシンドロームを標的とした創薬の潜在的なツールとして適用されました。

Protocol

このプロトコルは、脂肪細胞と水溶液の間の比重の違いを利用して、96ウェルプレートの同じウェルにおけるグリセロール放出(脂肪分解の指標として)と3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物(MTT)細胞生存率の同時測定を可能にし、それによって実験ワークフローを合理化し、効率を高めます。

すべての動物処置はARRIVEガイドラインに準拠し、実験動物のケアと使用に関する国立衛生研究所ガイド(NIH Publication No. 8023、1978年改訂)に従って実施されました。研究プロトコルは、施設動物管理および使用委員会によって承認されました (承認番号 202112、2021 年 5 月 5 日に承認)。この研究で使用した雄のWistarラットは、標準的な飼育条件下で少なくとも8週間齢で、体重は≥200gでした。精巣上体白色脂肪組織を、ラットあたり0.6〜0.8 gの典型的な収量で収集しました。特に、高齢のラットまたは高脂肪食を与えられたラットは、白色脂肪組織量(多くの場合1.5〜3 g)の有意な増加を示し、一貫した組織解離効率を維持するために消化酵素(コラゲナーゼなど)濃度の比例調整が必要でした。雄ラットのみの使用により、雌の発情周期ホルモン変動による潜在的な交絡効果が回避されました。菌株の選択(Sprague-Dawley、Wistar、またはLong-Evansなど)は、脂肪組織応答の遺伝的均一性を確保するために、実験内で一貫して維持されました。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1. 初代ラット腹部脂肪細胞の単離

1. 雄の成体ウィスターラットを、7%クロラール水和物(蒸留H₂Oに溶解)の腹腔内注射で麻酔します(施設で承認されたプロトコルに従って)。
2. 反射反応がないか確認して完全麻酔を確認し、滅菌手術用ハサミを使用して腹部正中線切開を行います。
3. 精巣上体脂肪パッドの左右から内臓脂肪組織を慎重に取り除きます。
   注:精巣上体脂肪細胞は比較的大きく、浮力があるため、分離と分析が容易です。
4. 収集した組織をリン酸緩衝生理食塩水(PBS; 図1A)。
5. PBSで組織を2回洗浄し、付着した血管や血栓などの不純物を除去します。
6. 洗ったティッシュを細かく切ります。

2. ラット初代腹部脂肪細胞の精製

1. 解剖した脂肪組織をトリプシンおよびII型コラゲナーゼ(10 mLトリプシン溶液中10 mg)とともに37°Cで振とう下で2時間インキュベートします。
2. 消化された脂肪組織を細胞ストレーナーでろ過します(図1A)。
3. 濾液を室温で120 × g で3分間遠心分離し、残留酵素活性を除去します。
4. 浮遊脂肪細胞(上部の白色層)を清潔なチューブに移し、PBSで洗浄します。
5. 濾液を室温で120 × g で3分間遠心分離してPBSを除去します。
6. ろ過した脂肪細胞(上部の白色層)を、10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を添加したダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)で30分以内にインキュベートします。

3. グリセロール放出の分析

1. ろ過した脂肪細胞(ウェルあたり10個、⁴〜10個^、5 個、200 μL)を96ウェル細胞培養プレートに播種します。
   注:脂肪細胞は、標準的な血球計算盤を使用して定量しました。脂肪細胞サイズのばらつきが大きいため、一部の大きな細胞は正確にカウントできませんでした。したがって、細胞数は脂肪細胞の実際の数を正確に反映していない可能性があります。主な目標は、正確な定量化ではなく、ウェル全体に細胞を均一に分布させることでした。
2. 脂肪細胞を0.05%ジメチルスルホキシド(DMSO、対照群として)および50μMのアトルバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチン、およびシンバスタチンで37°Cで穏やかに振とうしながら4時間処理します。
   注: これらの治療条件は参考として提供されており、実験の特定の目標とデザインに基づいて必要に応じて調整される場合があります。
3. 細胞培養培地(下の赤い層)を収集して、脂肪分解の開始を示すグリセロール放出を分析します(図1B)。
4. 市販のグリセロール放出アッセイキットを使用して、さまざまな治療に反応した脂肪細胞の脂肪分解を評価します。
5. マイクロプレートリーダーを使用して570 nmの吸光度を測定します。

4. 細胞生存率の解析

1. MTT粉末を蒸留H₂Oに5mg/mLの濃度で溶解し、0.22μmフィルターで滅菌してから使用してください。
2. グリセロール放出分析に続いて、MTT溶液(最終0.5 mg / mLまで)を細胞に加え、37°Cで2時間インキュベートします。
3. 浮遊脂肪細胞(上部の紫色の層)をDMSOを含む清潔なチューブに移して、細胞生存率を分析します(図1B)。
4. 形成された紫色のホルマザン結晶を短時間可溶化するためにボルテックスします。
5. マイクロプレートリーダーを使用して570 nmの吸光度を測定します。

5. 正規化の計算

1. すべての実験を3回行い、4回繰り返します(n = 4)。
   注:各独立した実験(n = 4)について、脂肪細胞を3匹のラットから単離し、各治療条件を3回に分けて実施しました。
2. 治療グループごとに、グリセロール放出吸光度値を対応する細胞生存率吸光度値で割ります。
3. データを平均±標準偏差(SD)として表示します。
   注:平均とSDは、関数=AVERAGE(range)および=STDEVを使用してMicrosoft Excelを使用して計算されました。S(範囲)。グループ比較では、GraphPad Prism 6 を使用して、比較平均の関数 t 検定を使用して、対応のない両側 t 検定 を実行しました。
4. スチューデントの t 検定を使用してグループ間の差の統計的有意性を決定し、 P 値が 0.05 未満であれば統計的に有意であると見なされます。

Results

予備的な薬物スクリーニングの後、抗高脂血症薬スタチンを使用して、正規化されたグリセロール放出法⁹による脂肪細胞の脂肪分解効果を調査しました。

ラット初代腹部脂肪細胞からのグリセロール放出に及ぼすスタチンの影響
初代ラット腹部脂肪細胞の脂肪分解に対するスタチンの効果は、細胞を50 μMのプラバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン、ロバスタチン、および0.5%DMSOで4時間処理することによって評価されました。グリセロール放出の分析は、プラバスタチンとシンバスタチンによる治療が対照群と比較して脂肪分解効果を誘発することを示しました(図2)。しかし、脂肪分解の有意な誘導はプラバスタチン治療でのみ観察され(P < 0.05)、シンバスタチンでは観察されませんでした(図2)。

初代ラット...

Discussion

この研究は、脂質を含んだ初代脂肪細胞の脂肪分解を測定するためのより正確な方法を提供します。プラバスタチンとシンバスタチンは、ラット精巣上体脂肪細胞のグリセロール放出を誘導し、生存率を低下させることが判明しましたが、アトルバスタチンとロバスタチンは有意な効果を示さなかった。シンバスタチンの投与により、脂肪細胞からのグリセロール放出の増加が最小限に抑えられました。この問題に対処するために、MTT アッセイを使用して脂肪分解の測定を標準化しました。このアプローチにより、プラバスタチンとシンバスタチンの両方によって誘発される脂肪分解効果の評価が大幅に向上することが明らかになり、おそらく細胞生存率への影響に起因します。

脂肪分解評価における方法論的進歩
この研究は、脂質を含んだ初代脂肪細胞の脂肪分解を評価するために MTT アッセイを利用することの重要性と利点を強調しています。この方法の統合により、特に脂肪細胞の生存率が実験条件や試験化合物によって影響を受ける可能性があるシナリオにおい...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22-µMフィルター	サンゴンバイオテック株式会社	F513165-0001	シリンジフィルター, AQUOシステム, 滅菌
3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル臭化テトラゾリウム	サンゴンバイオテック株式会社	A600799-0001	1グラム
96ウェル細胞培養プレート	サンゴンバイオテック株式会社	F603204-0001	不妊
アトルバスタチンカルシウム塩	ケイマンケミカル	10493-5	5ミリグラム
セルストレーナー	サンゴンバイオテック株式会社	F513450-0001	80スクリーンメッシュ
クロラール水和物	サンゴンバイオテック株式会社	A500288-0250	250グラム
ジメチルスルホキシド	サンゴンバイオテック株式会社	A460700-0100	100ミリットル
ダルベッコの修正イーグル培地	サンゴンバイオテック株式会社	E600003	500 mL、高グルコース、滅菌
ウシ胎児血清	サンゴンバイオテック株式会社	E600001	100 ml, 滅菌
グリセロール比色アッセイキット	ケイマンケミカル	10010755-96	96ウェル
ロバスタチン	ケイマンケミカル	10010338-5	5ミリグラム
雄の成体ラット	莆田大学	ウィスター	約10〜12週間
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液	サンゴンバイオテック株式会社	B540732-0010	10 mL、滅菌
リン酸緩衝生理食塩水	サンゴンバイオテック株式会社	E607009-0500	500 mL、滅菌、カルシウムまたはマグネシウムなし
プラバスタチンナトリウム塩	ケイマンケミカル	10010343-5	5ミリグラム
シンバスタチン	ケイマンケミカル	10010344-5	5ミリグラム
トリプシン溶液	サンゴンバイオテック株式会社	E607003-0100	100 mL、EDTAおよびフェノールレッドなし、滅菌
II型コラゲナーゼ	サンゴンバイオテック株式会社	A004174-0100	100ミリグラム