方法論記事

Hippophae rhamnoides subsp. sinensisとHippophae gyantsensisの多糖類含有量と抗酸化活性の比較研究

DOI：

10.3791/68855

⸱

2025年8月15日

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1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究では、Hippophae rhamnoides subsp. sinensis Rousi と Hippophae gyantsensis (Rousi) Y. S. Lian の多糖類含有量を、熱水抽出によって得られ、フェノール硫酸比色法によって定量化されました。また、これら2種のカバの多糖類のin vitro抗酸化活性を2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジルフリーラジカル消去実験を通じて調べました。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この論文は、研究価値の高い2つのカ バ 種、すなわち Hippophae rhamnoides subsp. sinensis Rousiと Hippophae gyantsensis (Rousi)Y. S. Lianの多糖類の収量、含有量、および抗酸化活性に関する、適切に設計された詳細な比較研究を報告しています。 H.rhamnoides subsp. sinensis と H. gyantsensis の総多糖類は、熱水抽出によって得られました。収率を比較し、フェノール硫酸比色法により多糖類含有量を正確に測定し、比較しました。一方、多糖類の抗酸化活性は、2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル(DPPH)フリーラジカル消去によって評価されました。結果は、 H.rhamnoides subsp. sinensis (1.18%±0.02%)の多糖類収量(原料に対する粗抽出物の割合)が、 H.gyantsensis (3.12%±0.06%)よりも有意に低いことを示しました(P <0.01)。 H.rhamnoides subsp. sinensis (352.97±1.07 mg/g) の多糖類含有量 (抽出物中の純粋な多糖類として定義) は、 H. gyantsensis (300.21 ± 1.49 mg/g) よりも有意に高かった (P < 0.01)。 H.rhamnoides subsp. sinensis 多糖類のDPPHフリーラジカル除去活性の半阻害濃度(0.026±0.004 mg / mL)は、 H.gyantsensis 多糖類(0.021±0.004 mg / mL)よりもわずかに低かった。しかし、2つの カバ 種の間に有意差は見られませんでした(P > 0.05)。本実験により、 H.rhamnoides subsp. sinensis とH . gyantsensisの多糖類の収量、含有量、抗酸化活性の違いが明らかになりました。この研究は、シーバックソーンの品質評価と多糖類有効成分のさらなる開発のための科学的根拠を提供することができます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

シーバックソーンは、Elaeagnaceae科の植物の乾燥した熟した果実です。脾臓を活性化して消化を助け、咳を和らげて痰を排出し、血液循環を促進し、うっ血を消散する特性があるため、中国で一般的に使用されている薬用および食用材料であり、インド、ロシア、フィンランド、その他のヨーロッパ諸国では栄養補助食品やヘルスケア製品の重要な供給源です1.シーバックソーンには、フラボノイド、フェノール化合物、多糖類、配糖体、有機酸などの生理活性成分が豊富に含まれており、伝統的な中国医学への応用の長い歴史があります 2,3。一般に、フラボノイドはシーバックソーンの最も重要な生理活性化合物と考えられています。しかし、多糖類は最近、優れた生理学的および薬理学的活性も持っていることが認識されており、そのため科学研究者の注目を集めています。シーバックソーン多糖類は、免疫系の調節、肝臓の保護、脂質代謝障害と腸内細菌叢の調節、ならびに抗酸化作用、抗炎症作用、抗腫瘍作用、血糖降下作用を持つことが実証されています4,5,6。これらは天然の抗酸化物質として作用するため、新しい機能性食品や医薬品の開発が可能になります。一方、シーバックソーン多糖類は胃酸によっても分解されやすく、人体の栄養素の吸収と利用に有益です7,8。

温水抽出 (HWE)、マイクロ波支援抽出、および超音波支援抽出は、シーバックソーン多糖類の抽出に一般的に使用される方法です9。異なる抽出方法によって得られた多糖類の構造は、単糖組成、分子量(Mw)、分岐度、ウロン酸含有量、グリコシド結合タイプ、およびトリヘリックス立体配座の点で10異なります11,12。一般に、高Mw多糖類溶液は高粘度と低溶解度を有しており、生物学的活性と用途に影響を与える可能性があります13。HWE は、その単純さの利点により、実験室および産業環境で多糖類抽出に最も一般的に採用されている技術です14,15。さらに、これはシーバックソーン多糖類の最も一般的に使用される抽出方法の1つです9。したがって、この研究では、HWE によって多糖類を抽出しました。多糖類含有量を決定する主な方法には、フェノール - 硫酸法とアントロン - 硫酸法16、17、18、19 が含まれます。フェノール硫酸法は、検出手順が簡単で、安定性が高く、感度が高いため、広く適用されています20。フェノール-硫酸法21により、シーバックソーンから抽出された多糖類の含有量を測定しました。そこで、本実験では、フェノール硫酸法を用いて多糖類の含有量を測定しました。フェノール - 硫酸反応後に形成されるオレンジ色の化合物溶液の深さは、多糖類の含有量に比例し、490 nm22の波長で測定できます。

天然多糖類は、in vivoおよびin vitroで顕著な抗酸化活性を示します。ラズベリー多糖類は、腸内細菌叢を調節することにより、高脂肪食モデルにおける酸化ストレスを軽減する可能性があります23。多糖類はプエラリア・ロバタの主活性成分であり、抗酸化作用を含む多様な生物活性を示します24。Douらは、ブラックベリー多糖類が抗酸化などの生理学的機能を持っていることを発見しました25。多糖類の抗酸化活性は、通常、2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル(DPPH)、ヒドロキシル、スーパーオキシドアニオンラジカルを含むさまざまなフリーラジカルを除去する能力、およびそれらのABTSラジカルカチオン除去能力に基づいて評価されます26。DPPH分析は、水素原子移動によって紫色のDPPHラジカルを淡黄色の安定した分子に還元する抗酸化物質の能力を測定するため、広く使用されています27。残りの紫色DPPHラジカルは、約515〜520 nmの紫外(UV)可視(Vis)分光光度計を使用して定量し、抗酸化活性を決定します28,29。

以前の研究では、シーバックソーン多糖類の含有量と抗酸化活性が調査されてきました21。しかし、これらの研究の大部分は Hippophae rhamnoides subsp. sinensis.これは、中国で最も頻繁に利用され、広く分布しているカバ種であり、中国薬局方に正式に記録されています。チベット医学で頻繁に使用され、四川省チベット薬材カタログに記録されている中国の西蔵固有の種であるHipphophae gyantsensisに関する研究は、ほとんど報告されていません。さらに、さまざまなカバ種の多糖類、すなわち H. rhamnoides subsp. sinensis と H. gyantsensis の含有量と抗酸化活性を比較した研究はありません。したがって、この研究ではまず、HWE によって抽出され、フェノール硫酸比色法によって定量化された H. rhamnoides subsp. sinensis と H. gyantsensis の多糖類含有量を比較します。これら 2 つのカバ種の多糖類の抗酸化活性は、DPPH フリーラジカル除去アッセイを通じてさらに調査されました。本研究は、上記の2種の海馬の活性多糖類成分の品質評価とさらなる開発のための科学的データを提供することが期待されています。

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プロトコル

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1. サンプルと材料

  1. 青海西藏高原からさまざまな カバ のシーバックソーンサンプルを収集します。
    注:サンプルは、成都中医薬大学のYue Liu准教授によって同定されました。バウチャー標本は成都中医薬大学民族医学部に寄託されました。サンプリング情報を 表1に示します。この研究で使用した試薬と機器の詳細は 、材料表に記載されています。
  2. サンプルを40°Cのオーブンで72時間乾燥させます。
  3. 各シーバックソーンサンプル20gを粉末に粉砕し、3番ふるいに通します。各サンプルを3回並列反復で処理します。ふるいにかけられなかったサンプルを粉砕し続け、すべてふるいにかけられるまでふるいにかけます。
  4. フォローアップ研究のためにサンプルを-20°Cで保存します。

2. シーバックソーン多糖類の抽出

注:この研究では、多糖類30を得るためにいくつかの変更を加えたシーバックソーンの以前に確立された抽出方法を採用しました。

  1. 5.0 gのシーバックソーンサンプル粉末を秤量し、250 mLの丸底フラスコに入れます。粉末に50 mLの無水エタノールを加え、室温(RT;25°C)で24時間浸して親油性成分を除去します。各サンプルを3回並列反復で処理します。
  2. 一晩浸したサンプル粉末をブフナー漏斗を使用してろ過し、濾液を廃棄してフィルター残留物を取得します。フィルター残渣を50mLの脱イオン水で3回洗浄し、40°Cで一定の重量に乾燥させます。
  3. 脱脂フィルター残渣を乾燥した250 mLの丸底フラスコに移し、150 mLの脱イオン水を固液比1:30(g/mL)で加え、80°Cのウォーターバスで2回、毎回2時間還流抽出します。濾液を分離して、粗海クロウメモドキ多糖類溶液を得る。
  4. ロータリーエバポレーターを使用して50°Cで1.5時間抽出物を濃縮します。濃縮溶液は、後で使用するために4°Cの冷蔵庫に保管してください。
  5. Sevage試薬(CHCl 3:C4H9OH = 4:1、v:v)を粗多糖類溶液に、Sevage試薬:粗多糖類溶液の体積比1:4で添加します。マグネチックスターラーで混合物を1050rpmの速度で20分間攪拌します。
  6. 液体を50mL遠心分離管に移し、4000 × g で15分間遠心分離し、上清を回収します。2つの相の間の界面に白い凝集沈殿物が現れないまで、上記の操作を3回繰り返します。
  7. タンパク質除去後のシーバックソーン多糖類抽出物を濃縮します。無水エタノール沈殿のために無水エタノールを体積比1:3で加え、混合物を4°Cで一晩置きます。
  8. 無水エタノールの上層を取り除き、混合物を50mL遠心分離管に移し、4000 × g で15分間遠心分離して沈殿物を得る。沈殿物を凍結乾燥して、総多糖類を得る。
  9. 以下の式(1)を使用して、総多糖類収量を計算します。
    figure-protocol-1
    注:式(1)では、 m はシーバックソーン多糖類の重量(g)を表し、 M はシーバックソーンサンプルの質量(g)を表します。

3. 多糖類含有量の測定

  1. 溶液の調製
    1. フェノール試薬溶液の調製
      1. フェノール3gを正確に計量し、茶色のメスフラスコに移します。50 mLの脱イオン水を加えてフェノールを溶解します。
      2. 均一になるまで混合物を完全に振ってください。フラスコにラベルを付けて、後で使用するために保管します。
    2. グルコース標準溶液の調製
      1. 10 mgの無水ブドウ糖を正確に計量し、10 mLのメスフラスコに移します。脱イオン水を加えてブドウ糖を溶解し、混合物をよく振ってください。
      2. 混合物を脱イオン水で所望の体積に希釈して、グルコース標準溶液を得る。
    3. 試験サンプル溶液の調製。
      1. 凍結乾燥シーバックソーン多糖類(ZG1-ZG5およびJZ1-JZ5)5 mgをメスフラスコ(n = 10)に正確に計量します。脱イオン水を各フラスコに加え、最終容量は50 mLになります。
      2. 多糖類が完全に溶解するまで混合物を20分間超音波処理します。各サンプルを3回並列反復で処理します。
  2. 標準曲線の構築
    注:フェノール-硫酸法では、多糖類が濃硫酸と反応してフルフラール誘導体を生成し、フェノールと縮合してオレンジがかった黄色の化合物を形成します。この化合物の最大吸収波長は約490nmです。したがって、この実験の検出波長は490nm22に設定されました。
    1. 標準グルコース溶液を脱イオン水で0.1 mg / mLの濃度に希釈します。マイクロピペットを使用して、200、300、400、500、600、および700 μLのグルコース標準溶液を6本の別々の清潔な試験管に慎重に移します。総量1.0mLまで純水を加え、各溶液を穏やかに混合して均一に希釈します。
    2. 上記の試験管に1.0mLの6%フェノール溶液と5.0mLの硫酸を加えます。よく混ぜて冷ましてから、RTで30分間放置します。
      注:フェノールは有毒な化合物であり、濃硫酸は腐食性があります。フェノールおよび硫酸溶液を調製するときは手袋を着用し、手順はヒュームフード内で行う必要があります。
    3. 前述の試料をキュベットに移し、試料の代わりに純水をブランクとして使用する。490 nmでの吸光度をUV-Vis分光光度計と3回の反復で測定します。
    4. グルコース濃度をx軸、吸光度値をy軸とする標準曲線をプロットします。回帰式を取得し、相関係数(R²)を計算します。
      注:UV-Vis分光光度計は、30分前に予熱する必要があります。このステップで吸光度を測定する場合、吸光度は0.2〜0.8でなければなりません。したがって、サンプルの濃度を定量化する必要があります。
  3. 方法論研究
    1. 精度テスト:
      1. JZ2を取り、手順3.1.3で説明した方法に従って試験溶液を調製します。フェノール硫酸比色法は、手順3.2.2で説明した方法に従って行います。
      2. 続いて、ステップ3.2.3で概説した手順に従って吸光度を決定します。この手順を 6 回繰り返し、相対標準偏差 (RSD) を計算します。
    2. 安定性試験:
      1. 手順3.1.3で説明した方法に従って、JZ2サンプル溶液を調製します。サンプル調製後0、2、4、6、8、および10時間で、ステップ3.2.2で指定された方法に従ってフェノール硫酸比色を行います。
      2. 次に、手順 3.2.3 で概説した手順に従って吸光度を決定し、RSD を計算します。
    3. 再現性試験:
      1. 手順3.1.3で説明した方法に従って、JZ2サンプル溶液を調製します。6つの反復を並行して準備します。ステップ3.2.2で指定された方法に従ってフェノール硫酸比色を実施します。
      2. その後、手順 3.2.3 で概説した手順に従って吸光度を決定し、RSD を計算します。
    4. 回復テスト:
      1. JZ2を取り、手順3.1.3で説明した方法に従って試験溶液を調製します。9つの反復を並行して準備します。サンプル中の総多糖類含有量の80%、100%、および120%に相当する参照溶液を加え、3つの平行サンプルを調製します。
      2. ステップ3.2.2で指定された方法に従ってフェノール硫酸比色を実行します。続いて、ステップ3.2.3で概説した手順に従って吸光度を決定し、式(2)を使用して回収率を計算します。
        figure-protocol-2
        注:式(2)では、 A はシーバックソーンサンプル溶液中のグルコースの量を表し、 B は添加されたグルコースの量を表し、 C はグルコースを含む溶液とシーバックソーンサンプル溶液の測定値を表します。
  4. コンテンツの決定
    1. ステップ3.1.3で説明したようにサンプル溶液を調製し、ステップ3.2.2で指定された方法に従ってフェノール-硫酸比色を行います。
    2. ステップ3.2.3で概説した手順に従って吸光度を決定し、標準曲線法を使用して多糖類含有量を計算します。これらの操作をサンプルごとに 3 回並行して実行します。

4. DPPHラジカル消去活性31,32

  1. 2.7 mgのDPPHを空の50 mLメスフラスコに正確に計量します。それを50 mLの無水エタノールに溶解して、0.054 mg/mLの濃度のDPPHストック溶液を調製し、DPPH作業溶液を得る。
    注:DPPH溶液は暗所に保管する必要があります。
  2. 5 mgのビタミンC(Vc)を空の10 mLメスフラスコに正確に計量し、10 mLの脱イオン水に溶解して、0.5 mg/mLの濃度のVc溶液を調製します。連続して希釈して、0.5、0.125、0.03125、0.0078125、および0.001953 mg / mLの濃度のVc試験溶液を調製します。
  3. 各シーバックソーン多糖類(ZG1-ZG5およびJZ1-JZ5)の5mgを正確に計量します。各サンプルを10 mLの脱イオン水に溶解して、0.5 mg/mLの濃度のシーバックソーン多糖類サンプル溶液を調製します。上記の溶液を連続して希釈して、0.5、0.125、0.03125、0.0078125、および0.001953 mg / mLの濃度のシーバックソーン多糖類試験溶液を調製します。
  4. DPPH溶液を基質として使用し、96ウェルプレートに次のグループを調製します:陰性対照群A0 (150 μLの水と50 μLのDPPH溶液)、サンプルグループA1 (150 μLのサンプルまたはVc溶液と50 μLのDPPH溶液)、およびサンプル対照群A2 (150 μLのサンプルと50 μLの無水エタノール)。この手順は 3 回に分けて実行します。
  5. 暗闇の中で反応を30分間進行させます。次に、517nmでの吸光度を測定します。実験を3回繰り返し、式(3)を使用してDPPHフリーラジカルの消去率を計算します。
    注:DPPH溶液の吸光度は0.7±0.02に維持する必要があります。濃度が高すぎたり低すぎたりすると、吸光度の読み取り値が不正確になり、最終的な実験結果に影響を与える可能性があります。
    figure-protocol-3
    式(3)では、A0 は脱イオン水とDPPH溶液の吸光度、A1 は試料またはVcとDPPH溶液の吸光度、A2 は試料と無水エタノールの吸光度です。
  6. 半阻害濃度の計算(Ic50)
    1. 反応試験化合物濃度(0.5、0.125、0.03125、0.0078125、および0.001953 mg/mL)とそれに対応する反応値の割合との相関関係を示す、視覚的に整理されたデータテーブルを生成します。
    2. 非線形曲線フィッティング(GraphPad Prismを使用)を使用して、IC50 と標準誤差を決定します。

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結果

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粗多糖類の収量
多糖類はHWEによって抽出されました。ウォーターバスの還流を補足図1に示します。多糖類抽出物溶液の濃度を補足図2に示します。脱タンパク後の遠心分離成層効果を補足図3に示します。H. rhamnoides subsp. sinensisの5つのバッチの多糖類収量は、0.89%±0.01%、0.78%±0.02%、1.63%±0.03%、1.50%±0.01%、1.12±0.03%で、平均収量は1.18%±0.02%です(表2)。ステップ2.5の5つのバッチの多糖類収量は、0.07%±3.94%±0.06%、3.53%±0.05%、2.63%±0.08%、および2.83%±0.05%であり、平均収量は3.12%±0.06%です(表2)。t検定の結果、2つの種間の多糖類収量に有意差が見られました(P < 0.01)。今回の結果は、H. gyantsens...

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ディスカッション

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シーバックソーンはチベットの伝統的な薬です。多糖類はシーバックソーンの重要な成分です。多糖類含有量と抗酸化活性の測定については、多くの研究が行われてきました21。しかし、薬用種など、さまざまな カバ 種の多糖類含有量と抗酸化活性を比較したのはごくわずかです H . rhamnoides subsp. sinensis や H. gyantsensis。したがって、この研究では、フェノール硫酸比色法によって 2 種の カバ の多糖類含有量を決定し、DPPH フリーラジカル除去アッセイを通じてそれらの抗酸化活性を評価しました。

この実験の主な手順は次のとおりです。まず、フェノール硫酸比色法を使用して多糖類含有量を測定する場合、試薬の添加順序を逆にしないでください。最初にサンプルを添加し、次にフェノールを加え、最後に濃硫酸を加える必要があります。また、DPPH法で多糖類の抗酸化活性を測...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、中国国家自然科学基金(第82374145号)、四川省自然科学基金(第2025ZNSFSC0608号)、および中国国家自然科学基金(第U23A20520号)によって財政的支援を受けました

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
分析天びん(精度0.0001 g)ザルトリウス科学機器(北京)有限公司BSA224S-CW
分析天びん(精度0.00001 g)ザルトリウス科学機器(北京)有限公司CPA225D
卓上低速遠心分離機上海紫貴楽器有限公司TD4K-Z
DPPHの上海Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.CAS 1898-66-4
エタノール成都科龍化学製品有限公司CAS 64-17-5
EPチューブ湖南BKMAKホールディング株式会社BS-20-M2ミリリットル
凍結乾燥機株式会社ラブコンコラブコンコ
無水グルコース成都科龍化学製品有限公司CAS 50-99-7参照標準
グラフパッド プリム 9.5.0 GraphPadソフトウェア該当なしIC50 値と P 値を決定します。
熱風循環乾燥オーブン上海Yihengテクノロジー機器有限公司NB-DGG-9070A
L-アスコルビン酸北京ラブジックテクノロジー株式会社CAS 50-81-7陽性対照薬
マイクロプレートリーダー上海山浦バイオテクノロジー株式会社読み取り最大値 1500
96ウェルプレート北京ラブジックテクノロジー株式会社11512
オリジンプロ 2025オリジンラボ該当なしクリアランス率折れ線グラフの作成
ピペットチップ北京ラブジックテクノロジー株式会社BS-200-T200 & ムー;L
ピペットチップ北京ラブジックテクノロジー株式会社T-1000-B1000 & ムー;L
フェノール成都科龍化学製品有限公司CAS 108-95-2
ロータリーエバポレーター BUCHI Laboratory Equipment Trading (Shanghai) Ltd.ブチ R-100
標準試薬型純水システム青島フロムテクノロジー株式会社FBZ2001アップp
サーモスタットデジタルディスプレイウォーターバスGuan'an Scientific Instruments (Zhejiang) Co., Ltd.WB100-6階
紫外可視分光光度計上海マパダインスツルメンツ株式会社 V-1100D
超音波洗浄機Sheng Zheng ChaoJie Industrial Co.、Ltd.CJ-060SD型超音波洗浄機 360 W 50 Hz

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