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方法論記事

ヒトコロノイド単層を横切る蛍光トレーサーのフラックスを検出することによる腸バリア透過性の測定

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DOI：

10.3791/68857

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2025年10月17日

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Children's Hospital Colorado, 2Department of Medicine, Mucosal Inflammation Program, Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Colorado, 3Rocky Mountain Veterans Hospital

この記事について

サマリー

既知のサイズの蛍光タグ付き糖の転座速度が組織由来のヒト腸コロノイドの透過性を反映する腸バリアの完全性を測定する技術について説明します。

要約

腸バリアは管腔抗原と宿主免疫系の間の調節の重要な部位であり、その調節不全は複数の胃腸疾患に関与しています。腸管オルガノイドは、腸のバリアの完全性の違いを理解し、モデル化するための有用なツールとなり得ます。ここでは、ヒトコロノイドを使用して、オルガノイド単層を横切る蛍光トレーサーのフラックスを測定することにより、機能的な腸バリアの違いを定量化するプロトコルについて説明します。単層を合流まで成長させた後、FITC-デキストランなどの蛍光トレーサーを頂端チャンバーに追加し、経時的に基底外側チャンバーへの転座を検出します。蛍光トレーサーの転座の増加は、より透過性、またはより弱い上皮バリアを反映しています。このプロトコルは、複数の条件にわたる機能的な腸バリアの違いを並行して評価できる適応可能なプラットフォームです。このプロトコルのバリエーションを使用して、さまざまなサイズ、形状、および化学構造の分子に対する経上皮透過性、および上皮細胞の頂端または基底外側の孤立した処理または微小環境の変化の文脈での透過性の違いを評価できます。これにより、疾患状態におけるバリア破壊のメカニズムと治療法をより深く理解できるようになります。

概要

腸粘膜は、腸管腔内の代謝産物、抗原、微生物と免疫系および腸循環との接触を調節する上で重要な役割を果たす複雑な構造です。腸上皮細胞はこのシステムの重要な構成要素であり、健康な状態では高度に選択的なバリアを形成します。上皮を横切る輸送は、複数のメカニズムを通じて発生する可能性があります:経細胞能動的または受動的輸送、タイトジャンクションおよび接着ジャンクションによって調節される傍細胞細孔またはリーク経路。これらの経路のいずれかが分子によって上皮を横切って移動するために使用できるかどうかは、疎水性、サイズ、および化学構造によって決まります。上皮を横切ると、これらの分子は粘膜免疫細胞とより容易に相互作用し、腸の血液またはリンパ循環に入ることができます 1,2腸のバリアの破壊は、炎症性腸疾患やセリアック病などのいくつかの炎症性胃腸疾患の特徴です 1,3,4,5,6,7.この弱体化した腸バリアは、病原性抗原の転座調節不全を通じて、これらの疾患プロセスの病態生理学に役割を果たし、局所的または全身的な炎症反応を引き起こす可能性があります。

腸のバリアを測定するためのいくつかの確立されたプロトコルがあります。in vitro研究では、伝統的にT84やCaco-2細胞などのがん細胞株を使用して、経上皮電気抵抗(TEER)を測定し、タイトジャンクションおよび接着ジャンクション成分を定量化します8。ex vivo では、生検または切除された腸サンプルの Ussing チャンバーを使用して経上皮電流を測定できます9。in vivo 研究では、通常、不活性トレーサーを経口投与し、これらのトレーサーの血液または尿の吸収を測定します10,11。これらの技術は腸バリアの研究に有用であることが証明されていますが、いくつかの制限があります:形質転換された不死細胞株は、本質的に代謝および細胞骨格の変化を持ち、腸バリアに不十分に定義された方法で影響を与えます。患者、患者サンプル、またはモデル生物へのアクセスは制限される可能性があります。in vivo 研究では、交絡因子を制御したり、分子レベルで結論を出したりすることが困難です。したがって、このバリア破壊の証拠は複数の疾患モデルで報告されていますが、これらの腸バリア欠損のメカニズムの理解は依然として限られており、胃腸疾患のこの側面をターゲットにして治療する能力はとらえどころのないままです。

ヒト腸管オルガノイドは、腸管バリア欠損の原因と治療法を解明するユニークでエキサイティングな機能を提供します。組織由来のヒト腸オルガノイドは、腸陰窩の基部に位置する成体幹細胞に由来する初代細胞培養物である12。これらの細胞は、生検または手術標本から分離され、培養して、それらが由来する患者に見られる遺伝的およびエピジェネティックな変化を維持することができます13,14,15。それらは、癌細胞株の代謝変化を持たず、成熟腸上皮に存在するさまざまな細胞型に分化できるため、従来の不死細胞株よりも生理学的に関連するモデルとして機能します16,17,18。さらに、それらはin vitroで増殖できるため、さまざまな治療と成長条件の並行しての細胞効果の制御研究によりアクセスしやすく、有用です。腸管オルガノイドモデルにも固有の制限があり、特に他の非上皮細胞型の欠如と全身系のコンテキストがありますが、ヒト腸オルガノイドは胃腸疾患の複数の側面に対して信頼できるモデルを提供することが示されています13。

これらの中で、腸オルガノイドは腸のバリア欠損を厳密にモデル化することが示されており、バリア傷害の設定におけるタイトジャンクション組織とTEERの予想される変化を示しています19,20,21。ここでは、オルガノイド単層を横切る蛍光タグ付き分子のフラックスが検出されるヒトコロノイドのバリア完全性を評価する1つの手法を採用します22。このプロトコルでは、オルガノイドは半透膜上で増殖し、分極した二次元単層に成熟します。このアッセイでは、上皮単層の頂端表面に蛍光トレーサーを添加し、反対側のその存在を時間の経過とともに定量化します。トレーサーのフラックスの増加は、より漏れやすい、またはより透過性の高い上皮を反映しています。このアッセイは機能的なバリアの読み出しを提供し、タイト接合部と付着接合部の構造の評価に付加することができます。さらに、TEER測定はバリア完全性の基本的な評価を提供するためによく使用されますが、ここで説明するフラックスアッセイは、さまざまなクラス、電荷、およびサイズの分子の透過性を検出するように適応させることができ、それによってバリアをより詳細に特徴付けることができます。この目的のために、いくつかの市販の蛍光トレーサーを使用できます。さらに、重複しない蛍光スペクトルを使用することにより、複数のトレーサーに対する透過性を同時に評価できます。さらに、このアッセイの単層構成により、細胞の頂端または基底外側表面にのみ特異的に適用された増殖条件に対するバリア応答の評価が可能になります。これにより、治療薬の効果、微小環境の変化、および共培養条件の制御された評価が可能になります。

腸のバリア欠損は、いくつかの胃腸疾患の発症において重要な病原性の役割を果たすことが知られていますが、「リーキーガット」という用語は、精度のない一般的なメディアでますます使用されており23、欠陥のある腸バリアを標的とする取り組みは成功に限られています。これは、腸の関門を評価および特徴付けるための改良モデルの必要性を浮き彫りにしています。記載されているシステムは、生理学的ヒト組織由来の腸管オルガノイド単層を使用して、制御された条件下での機能的バリアの完全性を評価します。

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プロトコル

すべてのサンプルは、コロラド大学治験審査委員会 (IRB) によって承認されたプロトコル (プロトコル番号 14-2012) に従って取得および使用されました。

注:ステップ1〜3のすべての手順は、無菌技術で無菌バイオセーフティキャビネットで行う必要があります。プロトコルの概略図を 図1に示します。

1. 凍結培養物からのヒトコロノイドの確立

注:解凍したオルガノイドの凍結培地への曝露を最小限に抑えるために、細胞を解凍する前に、すべての材料がバイオセーフティキャビネットで準備されていることを確認してください。プロトコルは、凍結保存された組織由来のヒトコロノイドから始まります。ヒトコロノイドを誘導し、凍結保存するためのプロトコルは、以前に説明されています24。

  1. ヒト腸管オルガノイドステム培地の調製
    1. Wnt-3A/Noggin/R-Spondin 3コンディショニング培地(L-WRN)を、前述のプロトコル25,26に従って調製する。
    2. L-WRN培地に次の成長因子を補充します:上皮成長因子[50 ng / mL]、ニコチンアミド[10 mM]、A83-01 [500 nM]、SB202190 [10 μM]、CHIR99021 [3 μM]、チアゾビビン[4 μM]、SB431542 [4 μM]、ガストリンI [10 nM]。
    3. 添加したL-WRN培地を市販の腸管オルガノイド培地と1:1で混合します。
    4. 使用直前に、Y-27632 [10 μM]を補給してください。
      注:最適な腸管オルガノイドステム培地の組成は、ラボおよびコロノイドラインによって異なる場合があります。補充されたL-WRN培地のみの使用、または市販の腸管オルガノイド培地のみの使用も可能な場合があります。このプロトコルでは、L-WRN コンディショニング培地と市販培地を等量使用することで、コンディショニング培地のみを使用する場合と比較してバッチ間の変動に対してより回復力が高く、市販培地のみを使用する場合と比較して費用対効果が高くなります。
  2. 分化培地の調製
    1. DMEM/F12に10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、および2 mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチドを補充します。
    2. 添加されたDMEM/F12をステップ1.1の腸管オルガノイドステム培地と1:1で混合します
  3. 細胞外マトリックス(ECM)の調製
    1. ECMを氷上で一晩解凍し、100 μLのアリコートを調製します。
      注:アリコートは-20°Cで再凍結できます。 詳細については、製造元の説明書を参照してください。
    2. 細胞をプレーティングするまで氷上でアリコートをインキュベートします。
  4. オルガノイドの解凍とプレーティング
    1. クライオバイアルの内容物を37°Cのウォーターバスで解凍し、バイアルが水没したままになるようにしますが、キャップは解凍されるまで水面上にあります。
    2. バイアルの内容物を、13 mLの氷冷添加DMEM / F12培地を含む15 mLのコニカルチューブに移します(ステップ1.2.1から)。
    3. 200 × g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。
    4. 上清を吸引し、細胞ペレットの上に約1 mLの残存量を残します。
    5. チューブを氷の上に置きます。氷冷で添加されたDMEM / F12(ステップ1.2.1から)1 mLを加え、懸濁液を10〜15回ピペットでピペットで移動させてペレットを再懸濁します。
    6. 200 × g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。
    7. ピペットを使用して上清を除去し、細胞ペレット上に残留洗浄培地をできるだけ残さないようにします。
    8. 解凍したECMをペレットに100 μL加えます。オルガノイドが塊がなく均一に分散されるように、完全に再懸濁します。気泡の侵入を避けるためにゆっくりとピペットを踏み入れます。
    9. 約10個のドームまたはECMの3次元液滴(それぞれ約10 μL)を6ウェルプレートの1つのウェルにピペッティングすることにより、ECMをプレート化します。
    10. プレートをすばやく反転させ、37°Cで5〜10分間、またはドームが固まるまでインキュベートします。
    11. ドームがセットされたら、2 mLの腸管オルガノイドステム培地(ステップ1.1から)をウェルに加えます。
    12. 5%CO2を含む加湿インキュベーターで37°Cでインキュベートします。メディアは 2 日ごとに交換してください。
    13. オルガノイドがECMドームの面積の約75%以上を占めているか、中心の破片が蓄積している場合は、ステップ2に進みます。

2. ヒトコロノイドの継代と拡張

  1. ウェルごとに、ECMドームを破壊することなくウェルから成長培地を吸引します。
  2. 1 mLの氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でドームを穏やかに洗浄し、PBSを除去します。
  3. 各ウェルに1 mLの氷冷トリプシンを加えます。ピペットを使用して、上下にピペッティングしてECMドームを破壊します。混合物を10〜15回ピペットで移動させ、ECMを完全に解離させます。
  4. プレートを37°Cで3〜5分間インキュベートします。
  5. 氷冷で添加されたDMEM / F12(ステップ1.2.1から)1 mLをウェルに加え、トリプシンを中和します。細胞がそれぞれ2〜3個の細胞のクラスターに解離するまで、混合物を20〜30回激しくピペットで移動させます。
  6. 細胞懸濁液を15 mLのコニカルに移します。
  7. さらに1 mLの補充DMEM / F12(ステップ1.2.1から)を使用してウェルを洗浄し、洗浄液を15 mLコニカルに加えます。
  8. 補充されたDMEM / F12(ステップ1.2.1から)を加えて、15 mLコニカルで総容量13 mLに達します。
  9. ステップ1のステップ1.4.3-1.4.12に進み、適切な量のECMを使用して追加のウェルに拡張します。
    注:100 μL ECM中のオルガノイドのコンフルエントウェルは、通常、2〜3ウェル(200〜300 μLのECM)に継代できます。オルガノイドのコンフルエントウェルは、ステップ3の約3〜6個の単層に十分です。

3. ヒトコロノイド単層の生成

  1. コラーゲンコーティング細胞培養インサート
    1. ポリスチレン細胞培養インサート(孔径0.4μm)を24ウェルプレートに入れ、各インサートの頂端チャンバーに100 μLのコラーゲンコーティング溶液を加えます。
    2. 蒸発を防ぐために、プレートをシールフィルムで密封します。
    3. 4°Cで4〜24時間インキュベートします。
      注:このインキュベーション時間内の結果に違いはありませんが、都合の良い一時停止ポイントに合わせて、インキュベーション時間を短くまたは長く選択できます。
  2. オルガノイド単分子層のめっき
    1. 手順2.1〜2.5に従って、オルガノイドを解離します。
    2. 細胞懸濁液を70 μmの細胞ストレーナーを通して50 mLのコニカルチューブに通します。
    3. 補充されたDMEM / F12をそれぞれ1 mLでウェルをすすぎます(ステップ1.2.1から)。この洗浄培地を収集し、セルストレーナーに通します。
    4. 50 mLコニカルチューブ内の総容量が15 mLに達するまで、添加されたDMEM / F12(ステップ1.2.1から)でセルストレーナーを洗浄します。
    5. 濾液を15 mLのコニカルに移します。
    6. 200 × g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。
    7. ペレットの上に1mLを残して上清を吸引します。
    8. さらに1 mLの補充DMEM / F12培地(ステップ1.2.1から)を加え、再懸濁します。
    9. 懸濁液を顕微鏡で調べて、完全な解離を確認します。必要に応じて、細胞がほとんど単一細胞になるまで激しくピペットで移動します。
    10. 200 × g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。 ピペットを使用して上清を除去し、細胞ペレット上に残留洗浄培地をできるだけ残さないようにします。
    11. 少量(200〜1000 μL)の腸管オルガノイドステム培地に再懸濁します(ステップ1.1から)。氷の上に置いてください。
    12. 細胞懸濁液のアリコートを取り、好ましい方法を使用して生細胞をカウントするために使用します。生細胞数を使用して、インサートあたり100,000個の生細胞をプレーティングするために必要な細胞懸濁液の量を決定します。
    13. インサートメンブレンに触れずに、各インサートからコラーゲンコーティング溶液を吸引します。
    14. 適切な量の腸管オルガノイドステム培地(ステップ1.1から)を各インサートの頂端チャンバーに追加し、細胞懸濁液を添加すると最終容量を200 μLにします。
      注:必要に応じて、ステップ3.2.12の細胞懸濁液を100,000細胞/ 200 μLの最終濃度に調整してから、200 μLを頂端チャンバーにプレーティングできます。ただし、細胞懸濁液全体を単層プレーティングに使用しないと、培地の過剰な無駄につながる可能性があります。
    15. 適切な量の細胞懸濁液を頂端チャンバーに加えます。
    16. 500〜1000 μLの腸管オルガノイドステム培地を基底外側チャンバーに加えます。
      注:典型的なコロノイドには500 μLで十分です。細胞が代謝的に活性が高い場合、または老廃物の蓄積に敏感な場合は、基底外側チャンバーでより大きな容量を使用することが、成長を維持するのに役立つ場合があります。
    17. すべてのインサート/ウェルについて繰り返します。
    18. 5%CO2を含む加湿インキュベーターで37°Cでインキュベートします。
    19. メディアは週に一度交換してください。
      注:目的の処理は、プレーティングの前後にいつでもインサートの頂端および/または基底外側チャンバーに適用できます。

4. 経上皮電気抵抗(TEER)と単層成熟の測定

  1. 抵抗の測定
    1. オーム設定では上皮ボルト/オームメーターを使用してください。プローブを70%エタノールに浸したタスクワイプで拭いて掃除します。電極の長いアームを基底外側コンパートメントに配置し、短いアームをインサートの頂端コンパートメントに配置します。測定を記録します。
      注:TEER測定値も関心のあるエンドポイントである場合は、バックグラウンドとして細胞のないコラーゲンコーティングインサートの抵抗測定も行います。次に、TEERは(抵抗-バックグラウンドインサート抵抗)xインサートの表面積として計算されます。このプロトコルにおけるインサートの表面積は 0.33 cm2 です。この計算により、TEERはオーム・cm2で得られます。 材料表に記載されているものとは異なる上皮ボルト/オームメーターを使用する場合は、メーターの使用に関する製造元の説明書を使用して抵抗を測定してください。
    2. 測定値が頭打ちになるまで毎日繰り返します。
      注:プラトーは通常、TEERが200オーム・cm2を超える2〜3週間後に発生しますが、コロノイドラインと成長条件によって異なります。
  2. 耐性が頭打ちになったら、ステム培地を分化培地に置き換えてオルガノイドの成熟を開始します(ステップ1.2から)。
  3. 毎日のTEER測定を継続します。TEERの増加と2番目のプラトーが予想されます。
    注:2番目のプラトーは通常、1500〜2500オーム・cm2のTEERで約7日発生しますが、これはコロノイド系統と成長条件によって異なります。
  4. TEER測定値が2回目に頭打ちになったら、ステップ5に進みます。

5. FITC-デキストランフラックスアッセイ

注:このプロトコルは、FITC-デキストラン4 kDa(ストークス半径14 Å)を使用します。ただし、実験のニーズに応じて、異なるサイズ、電荷、および蛍光色素の蛍光トレーサーを使用できます22。複数のトレーサーを同時に使用する場合もありますが、その場合は、励起スペクトルと発光蛍光スペクトルが重複していないことを確認する必要があります。ステップ5.1〜5.3は、37°Cに設定された加温キャビネット(非加湿、非CO2 インキュベーター)で実行することをお勧めします。 これが利用できない場合は、使用前に試薬を37°Cに温め、細胞、バッファー、および採取したサンプルは、インキュベーション期間中は37°Cに保つ必要があります。

  1. 試薬調製
    1. ハンク緩衝生理食塩水(HBSS)を10 mM HEPESで調製し、pHを7.4に調整します。37°Cまで温めます。
      注:必要に応じて、目的の処理でHBSS + HEPESを調製します。頂端チャンバーで80 μL/ウェル、基底外側チャンバーで1 mL/ウェルに十分な量を準備します。
    2. 温かいHBSS+HEPESを約50mLを小さなビーカーに注ぎ、インサートをすすぎます。液体廃棄物用の大きなビーカーを近くに用意してください。
    3. FITC-デキストラン4 kDaを完全に解凍します。HEPESを含むHBSSで1.25 mg / mL溶液を調製します。ウェルあたり80 μL、標準曲線に1 μLを割り当てるために、適切な量のFITC-デキストラン溶液を調製します。
      注:開始濃度は、トレーサーのサイズと予想される透過性に基づいて調整できます。例えば、試薬を節約するために、より小さい、またはより透過性の高いトレーサーを、より低い濃度で添加することができる。心尖チャンバーに治療を適用する必要がある場合は、適切に処理されたHBSS + HEPESでFITC-デキストラン溶液を調製します。
  2. FITCデキストランの単分子層への応用
    1. 1 mLのHBSS+HEPES(必要に応じて処理)を適切なウェルに加えて、新鮮な24ウェルプレートを調製します。
    2. 鉗子でインサートをつかみ、ウェルから持ち上げ、温かいHBSS + HEPESを含むビーカーに浸して頂端チャンバーを満たし、廃ビーカーの上に反転させて洗浄液を空にして、オルガノイド単層を洗浄します。
    3. この洗浄をさらに2回繰り返します。
    4. ステップ5.2.1で調製した新鮮なプレートの適切なウェルにインサートを入れます。
    5. 80 μLのFITCデキストラン溶液を頂端チャンバーにそっとピペットで入れます。単層を乱さないように、インサートの側面にピペットを当てます。
    6. すべての単層に対して手順5.2.5を繰り返します。
    7. 湿度を維持するために、空のウェルにHBSSまたはPBSを追加します。
  3. フラックスサンプルの収集
    1. ステップ5.2.7の直後に、各ウェルの基底外側チャンバーから70 μLを平らで底が透明な黒色96ウェルプレートのウェルに回収し、37°Cで光から保護したままにします。 これは時点 0 になります。
    2. プレートを光から保護して37°Cでインキュベートします。
    3. 30分ごとに2時間、基底外側ウェルでバッファーを混合し、ステップ5.3.1の透明底96ウェルプレートの空ウェルにさらに70 μLを収集します。
  4. 標準曲線の作成
    1. 1 μLの予備済みFITC-デキストラン溶液(1.25 mg/mL、ステップ5.1.3)を999 μLのHBSS+HEPESに加えます。これは、標準曲線の 1:1000 または 1.25 μg/mL の希釈になります。
    2. この溶液を150 μLの溶液を取り、150 μLのHBSS+HEPESに加え、よく混合して1:1に連続希釈します。これをさらに10回連続して繰り返し、合計12段階の希釈を行います。
      注:これにより、1250、625、312.5、156.25、78.13、39.06、19.53、9.77、4.88、2.44、1.22、および0.61 ng / mLの標準曲線が作成されます。細胞株の透過性に応じて、標準曲線を多かれ少なかれ濃縮する必要がある場合があります。実験を初めて実行するときは、標準曲線を別の濃度で作り直す必要がある場合に備えて、追加のFITC-デキストラン1.25 mg / mL溶液を予約してください。
    3. ステップ5.3.1および5.3.3の標準曲線の各希釈液70 μLを96ウェル透明底板の空ウェルにピペットで移動します。2 番目の反復について繰り返します。
  5. 蛍光プレートリーダーで、励起490 nm、発光520 nm、プレートの底面からの読み取り、ゲイン100、読み取り高さ7 mmの設定で蛍光を測定します。
    注:選択した蛍光色素に応じて励起/発光波長を調整します。
  6. データ分析
    1. x軸に濃度、y軸に蛍光で標準曲線をプロットします。これを使用して、線形回帰方程式を決定します。
    2. この線形回帰式とサンプルの蛍光測定値を使用して、各サンプルの各時点でのFITC-デキストラン濃度を計算します。
    3. 各サンプルの濃度を経時的にプロットし、マイクログラム/分(μg/min)を表す線形回帰方程式の傾きを計算します。これを細胞培養インサートの表面積(0.33 cm)で割って、フラックス速度をマイクログラム/分/平方センチメートル(μg/min/cm2)として決定します。

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結果

このプロトコルを使用して、炎症シグナル伝達の存在下および非在時における健康なヒトコロノイドの透過性を分析しました。IFNγ、TNFα、およびIL-1β(それぞれ10 ng / ml)を含むサイトミックスと呼ばれる炎症性サイトカインの混合物の添加は、腸上皮細胞モデル20,27でTEERによって測定された腸バリア機能障害を誘発することが以前に示されています。このバリア機能障害が、記載されている FITC-デキストラン フラックス アッセイを使用して再現できるかどうかを判断することを目的としました。

単一のドナーからの健康なヒトコロノイドを増殖させ(図2A)、説明されているように単層にプレーティングしました(n = 6)。分化培地中でプラトーTEERに達した後(ステップ4; 図2B)、サイトミックス(IFNγ、TNFα、およびIL-1β、それぞれ10 n...

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ディスカッション

これは、ヒトコロノイド単層の生理学的に代表的なモデルにおける腸バリアを評価するためのプロトコルです。ここで説明する蛍光トレーサーフラックスアッセイは、TEER、Ussingチャンバー測定、タイトジャンクションタンパク質発現の評価など、他のタイプのバリアアッセイで収集できるものを超えて、バリアの機能的完全性に関する情報を提供します。さらに、患者由来の腸オルガノイドモデルを使用することは、形質転換されていない細胞代謝やコロノイドが得られる腸の領域に特異的な変化など、不死の細胞株よりも複雑なヒト生理学13,19を再現する利点をもたらし、in vivo研究よりも制御性、アクセス性、容易さを備えています。

プロトコルには、その原則を特定の目的に合わせて調整するために使用できるいくつかの適応があります。さまざまな電荷、サイズ、または構造を持つ複数の蛍光トレーサー、および重複しない励起/発光スペ...

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開示事項

開示や利益相反はありません。

謝辞

ショーン・コルガン博士は、NIH 助成金 DK1047893、DK50189、DK095491、DK103639、および VA メリット BX002182 から資金提供を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15 mLコニカル遠心分離管セルトリート229411
2 mLめねじ極低温バイアル コーニング430488
50 mLコニカル遠心分離管セルトリート229421
6ウェルプレート, 組織培養処理セルトリート229106
70 & ムー;M細胞ストレーナー隼352350
96ウェルブラック/クリア底板サーモサイエンティフィック165305
A83-01 R&D2939
BioTek SynergyプレートリーダーアジレントシナジーH1
セロメーターオートT4明視野セルカウンターネクセルコムCMT-AT4P
セルメーターセル計数チャンバーネクセルコムNC1531583
CHIR99021シグマ・アルドリッチSML1046-5MG
コラーゲンコーティング液 セルアプリケーション125-50
DMEM/F-12ギブコ11330057
DMSOのシグマ・アルドリッチD2650-100MLの
エタノール100%フィッシャーサイエンティフィックA4094
EVOM2 ボルトオームメーター、Stx2電極付き世界の精密機器NC9792051
ウシ胎児血清 (FBS)サイトバSH30396.03こんにちは
フィルターピペットチップフィッシャーサイエンティフィック02-707-000, 02-707-002, 02-707-006, 02-707-008
フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストラン、4kDaシグマ・アルドリッチ46944
ガストリンI(人間)R&D3006
グルタMAX フィッシャーサイエンティフィック35050061200 mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチド
ハンクス緩衝生理食塩水 10xサーモサイエンティフィック14065056
ヘペス 1Mサーモサイエンティフィック15630080
インターフェロンガンマ組換えヒトバイオレジェンド575308
インターロイキン1ベータ組換えヒトサーモサイエンティフィック200-01B-500UG
IntestiCult 腸管オルガノイド増殖培地 (ヒト)STEMCELLテクノロジー06010 市販の腸管オルガノイド培地
ライブ倒立顕微鏡オリンポスIX85
マトリゲルコーニング354234細胞外マトリックス(ECM)
微生物学的培養器フィッシャーサイエンティフィック151030515
懸濁培養用マルチウェルプレート、24ウェルグライナーバイオワン662102
ニコチンアミドR&D4106
パラフィルムミリポアシグマHS234526Bシーリングフィルム
パスツールピペット(ホウケイ酸ガラス)フィッシャーサイエンティフィック〒13-678-20B
PBS ギブコ10010-023
ペニシリンストレプトマイシン(10,000 U / mL)ギブコ15140122
組換えウーズ上皮成長因子R&D2028-EG
冷蔵遠心分離機ベックマン・コールターBE-AX15R型
SB202190 R&D1264
チアゾビビンR&D3845
ThinCert細胞培養インサート、24ウェルプレート用、0.4&μ。mグライナーバイオワン662641
トリプシン-EDTA(0.25%)フィッシャーサイエンティフィック25200114
腫瘍壊死因子α組換えヒトR&D10291-TA-100
Y-27632 二塩酸塩 トクリスTB1254-GMP

参考文献

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