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方法論記事

足場のないマウス卵胞培養のためのカスタマイズ可能なアガロースモールドの製造と使用

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DOI：

10.3791/68871

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2025年10月24日

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1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 3Roy J. Carver Department of Biomedical Engineering, Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

in vitro の配偶子形成を補完する新しい足場を含まないアガロースカビで卵胞を培養する方法について説明します。

要約

卵胞は、女性の生殖機能と健康を維持するために必要なホルモンと配偶子を生成する卵巣の機能単位です。卵胞形成、排卵、黄体形成をin vitroで 再現する能力は、幅広い基礎的、翻訳的、および臨床的有用性を持っています。最先端の in vitro 卵胞増殖システムは、卵胞の 3 次元 (3D) 構造を維持しており、これはヒトにおける減数分裂能力のある中期 II 卵母細胞の発達に不可欠です。最近、マウス多層二次卵胞の in vitro 卵胞増殖のための足場フリー法が開発され、検証されました。このために、カスタム 3D プリント金型を使用して、卵胞の体積膨張に対応するマイクロウェルでアガロースをマイクロパターン化しました。この足場のない環境で増殖した卵胞は、十分に確立されたアルギン酸ベースのカプセル化 in vitro 卵胞増殖 (eIVFG) システムと比較して、同等のホルモン産生と生存率を示しました。重要なことに、アガロースマイクロウェルはスケーラブルな方法であり、技術的に要求が低く、eIVFGと比較して卵胞の成長と排卵率が改善されていることです。この方法論により、材料固有の浸出液やその他の環境汚染物質に非常に敏感な細胞である卵母細胞と生体適合性のあるカスタマイズ可能な金型が製造されます。さらに、このシステムの卵胞は同じ焦点面で培養されるため、リアルタイムのタイムラプスイメージングと分析が可能になります。この新しいアプローチのアクセシビリティを高めるために、この記事では、マスターモールドの設計と3Dプリント、24ウェルまたは96ウェルプレート用のシリコンモールドの作成、およびアガロースモールドでの単離された多層二次卵胞の培養に必要な方法について詳しく説明します。このセットアップは、費用対効果の高いタイムラプスイメージングシステムと統合することもでき、モルフォキネティック分析を可能にします。さらに、下流の組織学的分析のために金型にパラフィンを埋め込むことができます。全体として、このユーザーフレンドリーな方法は卵胞培養のための多用途ツールであり、卵胞内の生殖細胞の分化と成熟を促進して完全な in vitro 配偶子形成を維持するためにさらにカスタマイズできます。

概要

卵母細胞、または雌の配偶子は、受精時に細胞質の大部分と遺伝物質の半分を胚に寄与し、これは次世代の発達に不可欠です。卵形成は、原始生殖細胞が減数分裂に入り、前期Iで停止する胚発生中に始まります。これらの卵母細胞は原始卵胞内に存在し、卵巣予備能、そこから徐々に動員される有限で再生不可能なプールを構成します。卵胞は卵胞形成として知られるプロセスで発達し、最終的に受精可能な成熟配偶子を生成することを目標としています1,2,3,4,5。卵胞の発達は、パラクリンシグナル伝達が卵胞の生存と成長に不可欠である初期のゴナドトロピン非依存期から始まります。卵胞が二次段階まで成熟すると、卵胞はゴナドトロピンに依存するようになり、内分泌シグナル伝達への移行が見られます。二次卵胞の重要な特徴は、新しく発達したテカ層とともに、少なくとも2つの直方体顆粒膜細胞の完全な層に囲まれた卵母細胞です。テカ細胞は卵胞の最外層を形成し、アンドロゲンと構造的サポートを提供します 6,7。最後に、排卵中の黄体形成ホルモン(LH)の急増に応答して、液体で満たされた洞腔が形成および破裂し、減数分裂IIで停止した受精能力配偶子を放出します2,8,9。

卵母細胞は、卵形成および卵胞形成中に、受精の発達能力と、核および細胞質の成熟と呼ばれる初期の着床前胚の発達をサポートする能力を達成します10,11,12。卵母細胞は卵胞形成全体を通して拡張するため、細胞質の成熟は形態学的に明らかです。テーカ細胞、顆粒膜細胞、卵丘細胞などの体細胞増殖の結果として、卵胞自体が著しい体積膨張を経験します。マウスでは、卵胞の直径は、初期の二次卵胞から排卵前の卵胞まで5倍に増加します。卵母細胞と周囲の体細胞の間の双方向のコミュニケーションは、卵形成に不可欠です。一次卵胞では、透明帯は卵母細胞から分泌されるタンパク質から形成され、これらの卵胞コンパートメント間のコミュニケーションは、これら2つの卵胞コンパートメントの間に物理的接触を提供するトランスゾーン投影によって部分的に媒介されます13,14。したがって、卵胞微小環境は、卵母細胞の成長、および核および細胞質の成熟を正しく調整するために不可欠です2,5。これらのプロセスをサポートする個別のメカニズムをよりよく理解するには、高度で生理学的に関連する in vitro 培養技術が必要です。in vitroで卵胞を培養する能力は、生殖補助医療と生殖能力の保存15、16、17、18、種の保存19、20、医薬品開発21、毒物学スクリーニング22、23など、幅広い用途があります。

in vitro卵胞培養システムは、in vitro配偶子形成(IVG)24としても知られる多能性幹細胞から配偶子を生成する能力のための不可欠な中間ステップでもあります。研究者らは、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞を利用して、さまざまな種の配偶子を発達させており、多くの場合、体細胞に依存して天然の卵胞微小環境を再現しています 25,26,27,28,29,30.これらの方法によって主要な概念実証のマイルストーンが達成されましたが、マウスの体外受精後の胚発生率と生きた子孫率の低さに反映される、低品質の卵母細胞の課題が依然としてあります31,32。他の種ではまだ出生は達成されておらず、卵子形成と卵胞形成を完全にサポートするためのプロトコルの継続的な改良の必要性が強調されています。

現在、卵胞培養にはいくつかの戦略が利用されています。技術的に最も要求が低く、スループットが最も高いアプローチは、卵胞をプラスチック製の皿またはメンブレンインサート33,34に入れる足場のない方法です。ここで、顆粒膜細胞は培養表面に付着し、卵母細胞33,34との接触を失います。卵胞構造の崩壊により、これらの技術の有用性と生物学的関連性が制限されます。しかしながら、低付着プレートまたは逆滴での足場のない培養により、卵胞はいくつかの哺乳類種35、36、37において構造的完全性を維持することができる。残念ながら、これらの技術では、卵胞間の相互作用と卵胞が受ける機械的サポートの量を制御することは困難です。したがって、in vivo生理学をよりよく再現するために、卵胞を定義された調整可能な化学組成および/または機械的特性を持つヒドロゲルにカプセル化する培養法が開発されました33,34,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53です。たとえば、アルギン酸カプセル化されたin vitro卵胞増殖系は、in vivoで観察された主要なトランスクリプトームシグネチャを再現することができます21。

カプセル化された培養プロトコルの成功と価値にもかかわらず、いくつかの欠点があります。これらは技術的に困難で、手間がかかり、スループットが低く、自動イメージング方法と互換性がない可能性があります。さらに、カプセル化された培養法は、卵胞37の体積膨張が高いため、より大きな哺乳類種に対して多段階のアプローチを必要とする。さらに、カプセル化された技術は全方向に均一なサポートを発揮し、排卵前に卵胞をヒドロゲルから放出する必要があります。これは、卵胞が周囲の卵巣微小環境と相互作用し、動的な生体力学的サポートを提供する生体内では発生しません54。例えば、硬い卵巣皮質は原始卵胞の静止を維持しますが、成長中の大きな卵胞は通常、より柔らかい髄質コンパートメント55,56に見られます。有能な卵母細胞を持つ卵胞が末端サイズに達すると、卵胞壁と卵巣表面上皮の修飾により排卵が可能になります。したがって、卵胞が抵抗をほとんどなく一方向に成長させる培養技術は、in vivoの生理学をよりよく模倣できる可能性があります。

新しいアプローチでは、マウス多層二次卵胞の再現性があり、スケーラブルで、技術的に要求が低く、費用対効果の高い培養法が開発されました57。ここでは、正確に制御可能な形状(形状、寸法)と空間配置(数、近接性)を備えた超低接着アガロースマイクロウェルが、手頃な価格の方法で製造されています。アガロース型の卵胞は、一方向を除くすべての方向で機械的サポートを受け、同じ焦点面で培養されるため、高度なモルフォキネティック分析のためのタイムラプスイメージングが可能になります。光造形 (SLA) 3D プリンティングは、マスター金型を製造するための親しみやすい方法として利用され、その後、アガロースを鋳造するための浸出液のないシリコーン型を作成する成形ステップが続きました。卵胞の成長と排卵の結果は、従来のeIVFGと比較して、卵胞全体の生存率、成熟、または黄体形成を損なうことなく、新しいシステムを使用して達成されました57。このプロトコルペーパーでは、アガロースモールドのカスタマイズと製造に必要な手順、多層二次卵胞の播種と培養方法、処理方法、および最終的にタイムラプス分析を実行する方法について説明します(図1)。

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プロトコル

このプロトコルに関連するすべての動物手順は、ノースウェスタン大学の施設動物管理および使用委員会 (IACUC) によって承認され、実験動物のケアおよび使用に関する国立衛生研究所のガイドに従って実施されました。

1. マスター金型設計を適応させる

このセクションでは、24ウェルマスターモールドベース設計(補足ファイル1)と呼ばれる、24ウェル培養プレート用のマスターモールドのコンピューター支援設計(CAD)にカスタムマイクロウェルが導入される設計段階(図1)で実行される最初のステップについて説明します。マイクロウェルの寸法は、卵胞の支持量と最大成長サイズを決定し、ウェルの数によって、アガロースカビあたりの卵胞の最大数が決まります。適応されたマスターモールド設計は、次のセクションでアガロース鋳造用の生体適合性シリコーンモールドを作成するために使用されます。

  1. CADソフトウェアを使用して 、24ウェルマスターモールドベース設計 .stepファイルを開きます(図2A)。
  2. オブジェクトの内部表面積を選択し、[設計]ワークスペースの[ソリッド]タブに移動し、[スケッチを作成]を選択して目的のマイクロモールド設計を挿入します(図2Bi)。
  3. 希望のxy寸法とマイクロウェルの数を紹介し、ツールバーで 仕上げスケッチ を選択します(図2Bii)。
    注:多層二次卵胞の場合、500 x 700 μmのスタジアム幾何学的形状が以前に使用されていました57。印刷解像度は、使用する樹脂と SLA プリンターによって異なります。マイクロウェル間の間隔は最小400μmです。
  4. 押し出し機能を使用して深さ800 μmのマイクロウェルを作成します(ソリッド |作成 |押し出し)をクリックします。必ずカット操作を選択し、マイクロウェルキャビティを作成します(図2Biii)。
  5. 半径0.100 mmのフィレットを選択します([設計] |ソリッド |修正 |フィレット)をマイクロウェルの上部に
    注:丸底マイクロウェルを作成するには、培養ウェルの底に フィレット 操作を再度使用し、 半径値を マイクロウェル設計の半径と等しくします。たとえば、500 μm x 700 μmのウェルを設計する場合は、半径0.250 mmの値を選択します(図2Biv)。
  6. 新しいマスター金型設計のコピーを .step 形式でエクスポートします ([ファイル] | [エクスポート] をクリックします)。

2. シリコンモールド容器の作成

注:3Dプリント部品からの細胞毒性化合物の浸出を防ぐために、2つの生体適合性シリコーン型が作成されます。このセクションでは、設計段階の最後のステップ(図1)について説明し、シリコーン成形に使用される2つの容器になります。ここでは、セクション 1 から作成された新しいマスター金型設計と、24 ウェル シリコン キャスト コンテナ 1 と 2 の 3 つの異なる CAD ファイルが使用されます (それぞれ図 2Ci-ii および補足ファイル 2、補足ファイル 3)。

  1. 24ウェルシリコンキャストコンテナ1.stepファイルを開き、新しいマスターモールドデザインを外部コンポーネントとして挿入します(ソリッド |挿入 |コンポーネントの挿入)。
    1. 構成部品を右クリックし、「 リンクを解除」(Break Link ) を選択して、新しいマスター金型設計へのリンクされた参照を削除します。
  2. 新しいマスターモールド設計を中央に置き、24ウェルシリコンキャストコンテナ1面を内側に向けるようにします。
    1. ブラウザで 新しいマスター金型設計 オブジェクトを右クリックし、[ 移動/コピー ]オプションを選択します。
    2. [移動タイプ]セクションで[自由移動]操作を選択し、必要に応じてオブジェクトを X 軸上で 180° 回転します。
    3. [移動タイプ]セクションで、新しいマスター金型設計オブジェクトの中央を原点として、24 ウェル シリコン鋳造コンテナ 1 サーフェスの中心をターゲット点として、ポイントツーポイント操作を選択します。
    4. [ OK ]を選択して、オブジェクトを整列させます。
  3. コンテナをターゲットボディとして、マスターモールドを工具ボディ設計として 切削操作を選択します (図2Ciii)。これにより、シリコーン成形の最初のステップ用の容器が作成されます(図2Civ)。
    注:最初のセクションで設計されたマイクロウェルは、セクション3で説明したように3Dプリントされるマイクロピラーになりました。SLA 印刷は積層造形方法です。したがって、マイクロピラーを印刷すると、マイクロウェルを印刷するよりも印刷解像度が向上します。
  4. 結果の 新しい24ウェルシリコンモールド1 を.stlおよび.stepファイルとして保存してエクスポートします。

シリコン容器の3. 3D印刷

注:このセクションでは、目的のマイクロウェル設計機能を備えた新しいCAD設計が3Dプリントされる製造段階(図1)で実行される最初のステップについて説明します。

  1. 新しい24ウェルシリコンモールド1および24ウェルシリコンキャストコンテナ2の.stlファイルを3Dプリント準備ソフトウェアで開きます。
  2. マイクロピラーを上に向けてプリントの向きを合わせ、 ドリル穴 機能を使用して幅1mmの開口部を作成します(図2D)。このチャネルが印刷物の側面に開いていることを確認してください。
    注:印刷中のカッピング効果を回避し、印刷後に埋めることができるボア穴、または最初のシリコン成形後に余分なシリコン材料を除去できます。
  3. 2つの容器デザインを25μmの層厚で印刷します(図3A)。
    注:各モデルは、印刷の欠陥や処理中の損傷を考慮して、3回に分けて印刷してください。
  4. 印刷プラットフォームから型を取り外し、製造元の指示に従って 95% イソプロパノールで洗浄します。マイクロピラーセクションに95%イソプロパノールを広範囲にスプレーします(図3B)。圧縮空気で残りのエタノールを取り除きます。
  5. 残りのエタノールを少なくとも30分間蒸発させます。
    注:この段階で、幅1mmのドリルチャネルをシールできます。これは、プリントの外側に p200 ピペット チップを使用して、未重合樹脂を少量垂らすことで行うことができます。毛細管力がチャネルを満たします。
  6. 3Dプリントを60°Cで紫外線で15分間硬化させます。
  7. 実体顕微鏡を使用して各プリントを検査し、欠陥のある3Dプリントを破棄します(図3C-F)。すべてのプリントを目視で徹底的に検査し、すべてのマイクロピラーが分離され、サイズと外観が均一であることを確認します(図3D)。マイクロピラーが結合された欠陥マスターモールドを廃棄します(図3E)。
    注:一般的な問題は、未洗浄の樹脂が残っていることによるマイクロピラーまたはブリッジの損傷です(図3Fi、ii)。
  8. ドリルチャネルが満たされていない場合は、プリントの外側をパラフィルムで覆い、さらに使用するまで保管してください。

4. シリコンモールドの製造

注:このセクションでは、2つのシリコーン成形ステップが行われる製造段階(図1)の最終ステップについて説明します。これは、3D プリントされた部品による有毒な浸出水の放出を防ぐために必要です。

  1. 要約すると、製造元の指示に従ってシリコンを準備します。
    1. パートAとBの容器の内容物を完全に混合し、ビーカーをはかりに置き、重量比1A:1Bで容器に注ぎます。余分な材料があることを確認してください。
    2. 側面と底を必ずこすりながら、3分間よく混ぜます。
    3. 材料を真空デシケーターに入れ、閉じ込められた気泡を除去するために5分間放置します。気泡が残っている場合は、最大2回まで脱気を繰り返します。
  2. 混合物をシリコンモールド容器1に均一な流れで注ぎます。シリコーンモールドの平坦性を確保するために、混合物レベルが3Dプリントと同じレベルか、わずかに低いことを確認してください(図4Ai、ii)。
    1. p200ピペットチップを使用して閉じ込められた空気を取り除き、必要に応じて真空脱気を使用します。
  3. シリコーンを室温で少なくとも5時間、できれば一晩硬化させてから離型します。
  4. 3Dプリントされた金型からシリコンを取り出し、実体顕微鏡を使用してマイクロモールドの完全性を目視で確認します(図4Aiii、B)。必要に応じて、ドリルチャネルから余分な材料を取り除きます(図4Aiv)。ブリッジングまたは損傷したマイクロウェルのある金型を廃棄します(図4C)。
  5. シリコンモールドをシリコンモールドコンテナ2に入れて、2番目のシリコン成形ステップを行います(図4Av)。シリコン容器 2 の側壁には 1 mm の開口部があり、シリコン型を配置すると覆われます。
  6. シリコン型に胚に安全な鉱物油を軽くスプレーし、マイクロウェルから余分な油を取り除きます。これは、硬化後に両方のシリコーン部品を分離する離型剤として機能します。
  7. 手順4.1で説明した混合手順を繰り返し、混合物をシリコンモールド容器2に注ぎます。シリコンモールドの平坦性を確保するために、混合物レベルが3Dプリントより低いか同じ高さであることを確認してください(図4Avi)。
  8. シリコーンを室温で少なくとも5時間、できれば一晩硬化させてから、離型させます。
  9. 3Dプリントされた金型からシリコンを取り出し、シリコン金型1と2を互いに分離します(図4Avii)。実体顕微鏡を使用してマイクロピラーの完全性を視覚的に確認します(図4D)。マイクロウェルに気泡や余分な油が存在する場合は、金型を廃棄します(図4E)。
  10. シリコンモールドを70%エタノールで洗浄し、層流フードで30分間自然乾燥させます。
  11. 滅菌パウチに入れ、オートクレーブでドライサイクルで滅菌します(ジャケット圧力:20 psi、チャンバー温度:250°F、滅菌時間:15分)。

5.培地の調製

注:卵胞の単離および培養、卵母細胞のin vitro成熟、および黄体形成のための卵巣組織の消化には、解剖培地(DM)、酵素培地(EM)、維持培地(MM)、成長培地(GM)、成熟培地(IVM)、および黄体化培地(LM)の6種類の培地が必要です。これらの培地の調製は、Simon et al.33によって分析されたさまざまな培地コンポーネントの重要性の説明とともに、Converseら38によって以前に説明されているように見られ、それらの目的を表1に簡単に記載します。

  1. 培地は最大1週間前に準備し、4°Cで保存します。

6. カスタムアガロースカビと卵胞培養の鋳造と保管

注:このセクションでは、セクション4で生成したシリコンモールドから卵胞培養用のカスタムアガロースモールドを鋳造する方法について説明します。アガロース型は、卵胞培養の2週間前まで4°Cで作成および保存できます。

  1. 金型を滅菌パウチに入れ、セクション4.11で説明されているようにドライサイクルを使用してオートクレーブします。使用前に型を冷ましてください。
  2. 滅菌1.5%アガロース(w / v)溶液をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に電子レンジまたはホットプレートで溶解して、アガロース溶液を作ります。水を入れたビーカーに入れた滅菌コニカルチューブを利用して、アガロースをより均一に加熱し、液体アガロース溶液の凝固を遅らせます。
  3. 滅菌アガロース溶液を層流フード内のシリコンキャストにピペットで入れます。ゆっくりとスムーズにピペットを切って気泡の形成を最小限に抑え、金型の上部が平らで凸状または凹面にならないようにします。鋳造時の上部は培養時の型の底になり、平らに置く必要があります。24ウェルプレートのマイクロモールドには約600 μLのアガロースを使用し、96ウェルプレートに収まるマイクロモールドには85 μLのアガロースを使用します。
  4. マイクロモールドを固まるまで~3分間冷まします。シリコンキャストを反転させて、マイクロモールドを100mmのペトリ皿に排出します。
  5. マイクロモールドに亀裂、マイクロウェルの合流、不完全な境界などの変形がないか顕微鏡で評価します。マイクロモールドを滅菌PBS + 1%ペニシリン-ストレプトマイシンに入れ、使用前に4°Cで最大2週間保存します。
    注: プレート間を移動する際の時間の経過に伴う劣化やマイクロモールドの損傷を考慮して、必要以上に多くの金型を作成してください。
  6. 卵胞単離の日に、750 μLのメンテナンス培地でマイクロモールドを少なくとも1時間(合計2回のインキュベーション)2回平衡化します。
  7. すべてのメンテナンス培地を取り除き、750 μLの増殖培地を加え、インキュベーターに1時間入れます。
  8. 播種前に、新鮮で平衡化された成長培地と交換してください。

7.後期二次卵胞の単離と培養

注:このセクションでは、卵胞培養用のアガロースマイクロモールドで卵胞を単離して播種する方法について説明します。多層二次細胞は 8 日間培養され、生存率が 80% 以上でなければならず、成熟卵母細胞を生成します。二次卵胞の単離と培養は、他の場所で非常に詳細に説明されています38。確立されたアルギン酸カプセル化およびアガロース型への播種のための卵胞の単離と選択は一貫しています。

  1. マウスから卵巣を解剖し、周囲脂肪組織と滑液包から除去します。卵巣を2.5 mLの酵素培地に入れ、前述のように37°Cのオービタルシェーカーで20分間インキュベートします57。
  2. 卵胞分離の前に、体外受精皿に2 mLの維持培地をピペットで入れ、インキュベーター(37°C、5%CO2)に入れます。
  3. 250 μLのFBSでクエンチ反応します。酵素単離後の後期二次卵胞を選択し、DMとともに体外受精皿に移します。
  4. 卵胞を事前に平衡化された維持培地を含む体外受精皿に移し、インキュベーター(37°C、5%CO2)に1時間置きます。
    注:後期二次卵胞の開始サイズは150〜180μmで、顆粒膜細胞の2層以上が存在します。
  5. 750 μLの新鮮なGMをアガロースマイクロモールドに加え、インキュベーターに保存して播種の準備をします。アガロースマイクロモールドの周囲の隣接するウェルに滅菌PBSを追加して、湿度を維持し、培養期間を通じて培地の蒸発を最小限に抑えます。
  6. 事前に平衡化され、GMに沈めたアガロース型に卵胞を播種します。200 μmのストリッパーチップを使用して、顕微鏡下で高品質の多層二次卵胞をアガロースマイクロモールドに移します。10個の卵胞が24ウェルプレートの各マイクロモールドに移され、各卵胞が別々の隣接するマイクロウェルにあることを確認します。
    1. ストリッパーの先端を曲げて、より正確な操作と卵胞のマイクロウェルへの移送を可能にします。
    2. MMとGMはCO2 で緩衝されているため、温度とpHの変化を最小限に抑えるために卵胞を迅速に移します。
    3. 10個の卵胞すべてが移されたら、マイクロモールド内の卵胞が同様の開始サイズであることを確認してください。
  7. 播種したマイクロモールドをインキュベーターに少なくとも1時間戻し、イメージング前に卵胞が回復できるようにします。
  8. 卵胞を4倍および10倍の倍率で1日おきに画像化し、卵胞の生存と成長の結果を定量化します。
    注:タイムラプスイメージングは、モルフォキネティック測定を実行するように設定することもでき、セクション9で詳しく説明します。
  9. 培地の50%を1日おきに交換します。
  10. 使用済み培地をドライアイスでスナップフリーズし、-80°Cで保存します。 この条件付け培地を使用して、エストラジオールELISAによるホルモン産生を評価します。
    注:播種日(培養期間の開始)にGMを行った場合、培地は4°Cで保存し、培養期間全体にわたって利用できます。
  11. 培養の8日目にすべての増殖培地(750 μL)を取り出し、スナップフリーズします。
  12. 成長培地をIVM培地に置き換えて、 体外 排卵を可能にします。
    注:排卵は、タイミングと破裂の特徴を評価するために、タイムラプスイメージングの下でも発生する可能性があります。
  13. IVM培地を追加してから14〜16時間後に卵丘-卵母細胞複合体(COC)を除去し、成熟状態をスコアリングします。
    1. 成熟状態を定義すると、最初の極体の押し出しによるMII(健康な卵母細胞の期待される結果)、極体または胚小胞の欠如によるGVBD / MI(成熟の遅延)、卵母細胞の中心に見える球状核によるGV(減数分裂の進行の欠如)または変性して平らになったおよび/または暗くなった卵母細胞。
  14. オプション:染色体の整列、形状、体積などのMII卵母細胞の紡錘体パラメータは、卵母細胞の質および胚の結果と密接に相関しているため58,59、それらを使用して、in vitro卵形成の成功を評価します。紡錘体の形態を評価するには、ホールマウント免疫細胞化学によってMII卵を固定して染色します。
    1. 固定:卵を3.8%PFAと0.1%Triton X-100で37°Cで20分間固定します。ブロッキングバッファー(10%Tween-20および0.3%BSAを含むカルシウムおよびマグネシウム(PBS + / +)を含むPBS)で卵を3回洗浄します。
    2. スピンドル染色:
      1. 卵を透過処理バッファー(PBS +/+、0.1%Triton X-100および0.3%BSAを含む)で室温で15分間インキュベートします
      2. ブロッキングバッファーで2回すすぎます。
      3. 卵をAlexa Fluor 488結合抗α-チューブリン中で1μg/mLの濃度でホイルで包んだロッカー上で室温で2時間インキュベートします。
      4. DAPI含有封入剤で顕微鏡スライドにマウントする前に、ブロッキングバッファーで卵を3 x 20分間洗浄します。
      5. 卵母細胞の細胞骨格を観察するには、染色中に1:50のローダミンファロイジンを含めます。
    3. スピンドル全体にわたって幅1.0μmのzスタックを備えた63倍の対物レンズを使用して、共焦点顕微鏡でサンプルを画像化します。

8. カスタムアガロースモールドの下流用途

注:アガロースマイクロモールドは組織学的分析に利用でき、目的のさまざまな遺伝子またはタンパク質の定量化と局在化を可能にします。マイクロモールドは、複数の卵胞を並行して染色できる卵胞マイクロアレイを作成します。光コヒーレンストモグラフィー(OCT)は、卵胞を移すことなく実行することもできます(図1、アプリケーション)。光コヒーレンストモグラフィーは、サンプルの 3D 再構成を可能にし、共焦点顕微鏡と比較して浸透深度と解像度が高く、in vitro60 で培養された卵胞などの 3D サンプルのイメージングを向上させるイメージング技術です。

  1. 組織学アプリケーションの場合は、ステップ6.2で説明するようにアガロース溶液(1.5%w / v)を作成します。
    1. ウェル内のアガロースマイクロモールドを取り巻くすべての培地を取り除き、キャビティの角にあるp200ピペットを使用してマイクロモールドキャビティ内の培地を慎重に取り除きます。
    2. 100 μLの液体アガロース溶液を慎重にピペットで入れ、卵胞をかき混ぜることなくマイクロウェルとキャビティを充填して密封します。上部が平らであることを確認してください。滅菌済みのP10ピペットチップで気泡を取り除きます。
    3. アガロースを室温で2分間固化させます。マイクロモールドが完全に密閉されていることを顕微鏡で確認します。
    4. マイクロモールドを4°Cで一晩固定し、750 μLの固定液(変性デビッドソン溶液または3.8%パラホルムアルデヒド)で穏やかに揺らします。
    5. 固定剤を吸引し、密封されたマイクロモールドをエタノールの濃度を上昇させ、50%から始めて最後に70%のEtOHで洗浄します。
    6. 標準的な処理プロトコル(表2)を利用した自動組織処理装置を使用して処理し、パラフィンワックスに埋め込みます。埋め込むときは、マイクロモールドの向きに注意してください。切片化中の組織損失を最小限に抑えるために、包埋プロセス中にサンプルの前後にワックスがあることを確認してください。
    7. 埋め込みサンプルを厚さ5μmで連続切片し、帯電した顕微鏡スライド上に置きます。
    8. 自動染色機によるH&E染色を行い、イメージング前に封入剤で密封します。
  2. OCTを実行するときは、卵胞のあるマイクロモールドをIVM培地を含む50mmの皿に入れます。
    1. 代表的なOCT画像を生成するために使用される手順に従うには、軸方向の解像度が1.3 μm、横方向の解像度が9.4 μmの可視光スペクトル範囲内で動作するカスタムビルドのOCTシステムを使用して画像化します61,62。
    2. 1.58 x 1,58 mm2 視野で卵胞をスキャンし、512 A ラインと 512 B スキャンで構成され、B スキャンごとに 2 回、ボリュームごとに 3 回繰り返します。
    3. ImageJを使用してOCT画像を処理し、卵胞の3D構造を視覚化し、体積を定量化します。
      1. 開いているアプリケーションにファイルをドラッグして、画像をZスタックとしてImageJにアップロードします。
      2. Zスタックを3D画像として視覚化するには、 プラグイン|3D|ボリュームビューア。3D 画像を回転させて、さまざまな時点でさまざまな角度を表示します。
      3. [ファイル] |名前を付けて保存 |Tiff を使用して、画像を目的の場所に保存します。

9. 卵胞培養のタイムラプス解析

注:足場のない培養システムで増殖した卵胞は、同じ焦点面に存在し、インキュベーター内のタイムラプスイメージングと互換性があります。タイムラプスイメージングは、ステップ7.7で卵胞を播種した後に開始できます(図1、アプリケーション)。

タイムラプス全体を通してすべての変更が正確であることを確認してください。したがって、すべてのステップの後にスタック全体を調べて、測定値に不一致がないことを確認します。

  1. タイムラプスのセットアップ:
    1. ライトフォーカサー/集光器のキャップをハンドヘルド顕微鏡に置きます。
    2. マウントホルダー付きのハンドヘルド顕微鏡をインキュベーターに入れ、ソフトウェアがインストールされたラップトップに接続します。
    3. 培養物を顕微鏡の下によく配置して位置合わせし、顕微鏡の高さと焦点を調整して、すべての卵胞に焦点が合うようにします。オートホワイトバランス(AWB)では、 LEDコントロール で最適な照明条件を選択し、 自動露出 (AE)を オフにして、 最適な露光時間を選択します。
      メモ: 各メディア交換の前後に金型の位置合わせが同じであることを確認してください。それ以外の場合は、培養の 2 日ごとに個別に分析を行う必要があります。
    4. タイムラプスイメージングを開始し、 8日間 の期間と 30分の間隔を選択します。 写真 を選択し、 写真を撮らないときはLEDをオフにします。
  2. ImageJ 解析の前に、[測定値の設定] ダイアログ ボックス ([ 解析] | [測定値の設定] をクリック) で記録する測定値を指定します。
    注: ImageJソフトウェアに組み込まれる可能性のある測定の詳細については、ユーザーガイドのサブセクション30.763を参照してください。
  3. すべての画像を別の分析フォルダーに配置して、分析を開始します。
  5. 長方形の選択ツールを使用して、タイムラプス全体のすべての毛包が存在する領域を選択します。このためには、最初に最後の画像を使用し、スタックをスクロールして、毛包が切り取られていないことを確認します。次に、選択範囲をトリミングします(画像|切り抜きまたはCtrl + Shift + X、図5Ai、ii)。
  6. タイムラプススタックのスケールバーを設定します(Analyze |[スケールを設定])。イメージャーで作成した 0 日目の画像を利用して、卵胞やマイクロウェルなどの 3 つの識別可能な特徴を測定します。タイムラプススタックから同じ0日目の画像を使用し、測定値の1つのスケールを定義します。他の2つの測定値を使用して、正確なスケールが設定されていることを確認します。
  7. SIFTプラグインを使用してすべての画像を整列させます(プラグイン| 登録 | SIFTによる線形スタックアライメント(図5Bi、ii)。ケースごとに調整できる次の標準設定を使用します: SIFT を使用した線形スタック アライメント、initial_gaussian_blur = 1.60 steps_per_scale_octave = 3 minimum_image_size = 64 maximum_image_size = 1024 feature_descriptor_size = 4 feature_descriptor_orientation_bins = 8 closest/next_closest_ratio = 0.92 maximal_alignment_error = 25 inlier_ratio = 0.05 expected_transformation= リジッド補間。
  8. スタックを 8 ビットのグレースケールに変換します (画像 |タイプ |8ビット)。
  9. ローリングボールの背景減算を使用して背景を削除します(プロセス |背景を減算、図5Ci、ii)は、ケースごとに調整できる次の設定を使用して使用します:転がるボールの半径= 70.0ピクセル。[スムージングを無効にする] を選択します。
  10. イメージのしきい値を設定します( [イメージ] |調整 |Threshold) を使用して、次の設定を使用してタイムラプス画像を 2 つのピクセルクラスに分割します: setThreshold(35, 255, "raw"); run("Apply LUT", "stack"); setOption("BlackBackground", true); run("Convert to Mask", "method=Intermodes background=Dark calculate black")。
  11. 長方形の選択を使用して各卵胞を個別に測定し、粒子分析機能を選択します([分析] |パーティクルを解析します)。次の設定を使用します: Analyze Particles..."、"size= 8000-Infinity display exclude include summarize overlay add composite stack (図 5Di,ii)。
    1. 結果を保存する前に、各画像のROIが正確であることを確認してください(図5Ei,ii)。サマリーと結果を に保存します。CSV 形式。
    2. 他のすべての卵胞についてこれを繰り返します。

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結果

プロトコールセクション7に記載されているように、この新しい技術を使用して卵胞の生存と成長がサポートされているかどうかを判断するために、同じマウスからの卵胞を単離し、アガロースマイクロモールドで並行して培養するか、0.5%アルギン酸にカプセル化しました。培養の隔日からの卵胞の代表的な画像は、培養期間を通じて洞腔の正常な発達、成長、および形成を示しました(図6A)。以前に発表された結果は、卵胞の生存率が培養方法間に有意差を示さず、アガロース57で培養された卵胞の直径が有意に大きいことを示しました。これは、アガロースマイクロモールドがアルギン酸カプセル化と比較して改善された速度で卵胞形成をサポートすることを示しています。

アガロースマイクロモールドで培養された卵胞からの卵母細胞の減数分裂の進行と紡錘体の整列が評価されました。排卵は、プロトコルステップ7.11で説明されているように、両方の条件で卵胞の排卵を誘発しまし...

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ディスカッション

in vitro 配偶子形成と成熟は、卵母細胞生物学の基礎的な理解のための重要な技術であり、生殖補助医療、生殖能力の保存、種の保存に応用できる可能性があります。IVGをサポートする方法は、多くの場合、体細胞との共培養に依存して、再建された卵巣を作成します30。これらの支持細胞の重要性は、卵胞体細胞微小環境が健康な卵母細胞の成長と発達に重要であるin vivoでよく知られています2,3,8,9。残念ながら、現在のin vitro卵胞培養法では、活性化が低下した卵母細胞が生成され、in vivo配偶子と比較して受精と胚発生に悪影響を及ぼし、トランスクリプトームシグネチャが異なります

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、国立小児保健人間発達研究所(R01HD105752からFEDに、T32HD094699からEJ)とNIH共通基金のSenNetプログラム(U54AG075932とUH3CA268105からFED)、およびビル&メリンダゲイツ財団助成金(INV-003385からFED)によって資金提供されました。ビル&メリンダ・ゲイツ財団の助成条件に基づき、この投稿から生じる可能性のある著者承認原稿バージョンには、クリエイティブ・コモンズ表示4.0ジェネリック・ライセンスがすでに割り当てられています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
<ストロング>材料・化学
 50 mL 発泡スチロール遠心分離機管グローブ・サイエンティフィック941-11017-CS
1.5 mL マイクロ遠心分離機チューブフィッシャー・サイエンティフィックMCT-150スナップ、凍結、保存のためにメディアを保存するために
100mmディッシュ、未処理フィッシャー・サイエンティフィック08-757-100D アガロースマイクロモールドの製造と保存
100%エタノールメルセデス・サイエンティフィック1200組織処理
1000 & micro;L ピペットの先端、保持率が低い中科学PR-1000BK文化のヒント 
200 & マイクロ;L ピペットの先端、保持率が低い中科学PR-200BK文化のヒント 
24ウェルプレートコーニング353047文化
35mmアンテナファルコン351008卵巣を分離し、エニズマティック培地で培養するために
エタノール95%メルセデス・サイエンティフィック1210組織処理
アガロースホーファーGR140マイクロモールド
バイオエクストラ ミネラルオイル、ライトオイル、マウス胚細胞培養に適していますシグマ・オルドリッチM5310-500ML生体適合性の脱モールド剤として使用
牛血清アルブミン MPバイオメディカル103700グロースメディア
クリーニングダスター、10オンス、6個入りパックオフィスデポ 110284圧縮空気
クリアV4レジン 1LFormlabs, IncRS-F2-GPCL-043Dプリンティング樹脂
コーニング 再利用可能なプラスチック低量型100 mLビーカー、ポリプロピレン、目盛りコーニング1000P-100シリコーン成分の混合用ビーカー 
DNAse Iキアゲン79254酵素媒体
エコフレックス 00-45 ほぼクリアスムースオン社B09M8Y9PTVシリコーン材料
F-12 + グルタMAXギブコ31765-035グロースメディア
胎児牛胎児シグマF-3385グロースメディア
胎児用牛血清(FBS)ピーク血清PS-FB2解剖媒体、酵素媒体、およびメンテナンスメディア&熟成媒体
フィッシャーブランド 滅菌ポーチフィッシャー・サイエンティフィック01-812-50 滅菌ポーチ
卵胞刺激ホルモン(FSH)EMDセロノ社ゴナール-F処方のみ グロースメディア&熟成媒体
Gibco DPBS、カルシウム、マグネシウムフィッシャー・サイエンティフィック14-040-182  ダルベッコのリン酸塩緩衝塩水
ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)シグマ・オルドリッチC1063-1VL熟成媒体
インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS)サーモフィッシャー41400045グロースメディア
インビトロジェン分子プローブ ロダミン・ファロイジンフィッシャー・サイエンティフィックR415卵子細胞骨格染色
体外受精料理サーモ・サイエンティフィック150260卵胞の分離、選択、そして前平衡化のために
Leibovit'z 15 (L15)ギブコ11415-064ディスセクションメディア&酵素媒体
リベラーゼシグマ・オルドリッチ5401119001酵素媒体
MEM?+ グルタマックスギブコ32561-037メンテナンスメディア、そしてnbsp;グロースメディア&熟成媒体
マウス表皮成長因子(EGF)BDバイオサイエンス354010熟成媒体
ナルジネ 透明ポリカーボネート クラシックデザイン 乾燥器サーモ・サイエンティフィック5311-0250真空乾燥器 
パラフィンフィッシャー・サイエンティフィック83-30組織処理および埋め込み
ペニシリン・ストレプトマイシンギブコ15140-122解剖媒体、酵素媒体およびメンテナンスメディア
ストリッパーチップオリジオMXL3-200文化
VECTASHIELD PLUSアンチフェードマウントメディウム(DAPI搭載)ベクター研究所H-2000卵核染色
キシレンメルセデス・サイエンティフィック9840組織処理
&α;-チューブリン(11H10)ウサギmAb(Alexa Fluor 488 Conjugate)細胞シグナル伝達技術5063S卵チューブリン染色
<ストロング>装備
プラットフォーム2建設Formlabs, IncBP-F3-02-01 3Dプリンターコンポーネント
Dino-Lite Edge AF4915ZTL、USB 2.0ダイノライトAF4915ZTLタイムラプスセットアップ用のイメージャー
フォーム3 レジンタンク V2.1 Formlabs, IncRT-F3-02-013Dプリンターコンポーネント
フォーム3B+3DプリンターFormlabs, IncF3B-P-プリンターFormlabsのステレオリソグラフィー(SLA)3Dプリンター
形の治療 Formlabs, IncFH-CU-01硬化プラットフォーム 
フォームウォッシュFormlabs, IncFH-WA-01洗浄プラットフォーム
ポンプ式の蒸気化スプレーボトルVWR0309-3005脱臼剤を塗る
Edgeシリーズ(T5、T8モデルを除く)向けのライトフォーカサー/コンセントレーターキャップダイノライトN3C-Rタイムラプスセットアップ用のイメージャーコンポーネント
RK-10ラックとRK-10-EXアームエクステンションを組み合わせたマウントホルダーバンドルダイノライトRK-10Aタイムラプスセットアップ用のイメージャーコンポーネント
組織埋め込み機ライカヒストコア・アルカディアマイクロモールドを埋め込むために
ティッシュプロセッサーライカTP1020マイクロモールドの加工
211DSシェイキングインキュベーター(軌道シェーカー)Labnet InternationalI-5211-DS卵胞を放出するために酵素培地で卵巣を培養すること
Software 
Autodesk Fusionオートデスク社コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェア。AutodeskはAutodesk Educationプログラムを通じて無料の教育アクセスを提供しています。
DinoCapture 3.0 バージョン 1.1.1.3  ダイノライト
イメージJ国立衛生研究所OCT画像の解析と卵胞の測定
プレフォームFormlabs, IncFormlabsのステレオリソグラフィー(SLA)プリンターと連携して動作するよう設計された無料のプリント準備ソフトウェアです。nbsp;

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