キメラ抗原受容体T細胞療法研究のための循環神経膠腫モデル

サマリー

本プロトコルは、in vivoでのキメラ抗原受容体T細胞療法の治療効果を調査するために、側脳室注射による循環神経膠腫モデルを確立します。

要約

脳脊髄液 (CSF) 中の循環腫瘍細胞は、神経膠腫における腫瘍再発および頭蓋内転移の重要な要因です。多くの研究が、CSF 内の循環腫瘍を標的にして排除するための効果的な戦略を特定しようとしています。キメラ抗原受容体 (CAR) T 細胞療法は、さまざまな循環腫瘍に頻繁に使用されています。しかし、適切な循環神経膠腫モデルがないため、研究は限られています。ここでは、循環神経膠腫モデルが開発され、CAR T 細胞療法の研究に適用されました。このモデルは、頭蓋内疾患の局所治療に広く使用されている側脳室注射を使用して構築されました。神経膠腫細胞を側脳室に注入して、頭蓋内原発腫瘍を形成しました。側脳室から脱落した腫瘍は、CSFの循環腫瘍を示すために使用されました。このモデルは構築が簡単で、循環神経膠腫の CAR T 細胞療法に関するさまざまな研究に適用できます。その結果、循環神経膠腫モデルは、循環腫瘍の効果的な CAR T 細胞療法研究のための独自の神経膠腫転移モデルを提供します。

概要

神経膠腫は、成人で最も一般的な原発性悪性脳腫瘍です ^1,2。手術、放射線療法、化学療法などの現在の治療法は有効性が限られており、生存期間の中央値はわずか14〜15か月です^3,4,5。CSF 中の循環神経膠腫細胞は、腫瘍の再発と頭蓋内転移に重要な役割を果たします ^6,7。したがって、循環神経膠腫細胞を排除するためのより効果的な治療戦略を開発することが緊急に必要とされています。

神経膠腫に関する最近の研究は、主に頭蓋内原発腫瘍に焦点を当てています ^8,9。しかし、クリニックで対処する必要がある最も重要な問題は、循環神経膠腫細胞をどのように標的にして排除するかです。したがって、手術前後の循環神経膠腫に関する研究には、より多くの注意が必要です。キメラ抗原受容体 (CAR) T 細胞療法は、循環腫瘍細胞の研究で使用される最も一般的な戦略です^10,11。しかし、頭蓋内腫瘍の特殊な解剖学的構造により、循環神経膠腫の研究に重要な適切な循環神経膠腫モデルを開発することは困難です 12,13,14,15,16。

この研究により、側脳室注射に基づく独自の循環神経膠腫モデルが生成されました。このモデルでは、神経膠腫細胞を側脳室に注入し、10 日目に CSF 中の頭蓋内原発腫瘍と循環腫瘍を in vivo 生物発光イメージングおよびフローサイトメトリー分析によって検出します。CAR-T 療法は、循環神経膠腫モデル マウスの腫瘍量が約 6.5 × 10⁵p/s に達したときに開始されました。CAR-T 細胞の治療効果を評価するために、腫瘍量を 5 日ごとに監視しました。このモデルは、神経膠腫患者の腫瘍細胞の落屑状態を模倣しており、循環神経膠腫に関するさまざまな研究に使用できます。

プロトコル

この研究の動物実験はすべて、南京医科大学の治験審査委員会と動物倫理委員会 (IACUC-1905048) によって承認および監督されました。本研究には、生後6〜8週齢のC57BL/6J雌マウスを使用しました。使用する試薬と機器は、材料表に記載されています。

1.動物の準備

1. マウスをバリア、12時間/ 12時間の明暗サイクル、周囲温度24°C、相対湿度50%のケージに収容します。
2. マウスの体重を量り、50 mg/kg ペントバルビタールナトリウムと 10 mg/kg キシラジンの腹腔内注射でマウスを麻酔します¹⁷。
   注:ペントバルビタールナトリウムとキシラジンの組み合わせは、マウス定位固定注射手順で広く使用されています。適切な麻酔は、つま先をつまんでも反応がないことによって確認され、手術前に動物が完全に意識を失っていることが確認されました。角膜の乾燥や損傷を防ぐために、麻酔中に動物用眼科軟膏を目に塗布しました。
3. 実験動物用シェーバーでマウスの頭の毛を取り除き、マウスの頭と手足を定位固定装置に固定します。
4. ヨードフォアを使用してマウスの頭を綿棒で滅菌し、マウスの体の残りの部分を滅菌手術用タオルで覆います。
5. 右額上部の正中線に沿って頭皮をメスで1cmほど切ります。
   注:感染を防ぐために、すべての手術器具は使用前に適切に滅菌する必要があります。怪我をしないように器具の取り扱いには注意が必要であり、すべての手順は無菌環境で実行する必要があります。
6. 鼻クリップとイヤーロッドを調整し、ラムダ縫合糸とブレグマの間のZ軸の高さの差が0.05mm以下であることを確認します。

2. 循環神経膠腫モデルの構築

1. リンドウバイオレットを浸した綿棒を使用して、正中線の右側に1.5 mm、後側に1.1 mmのポイントをマークします(座標:AP -1.1 mm、ブレグマからML -1.5 mm)。
2. 直径0.5mmの小型頭蓋ドリルを使用して、目標座標に穴を開けて硬膜を露出させます。
3. 生理食塩水ですすぎ、骨片を取り除きます。
4. 深さ制限ストッパー付きのマイクロシリンジ(GL261-Luc-Gfp、0.1%BSAを含むPBS中の1×10⁵細胞/ μL)を使用して、5 μLの腫瘍細胞懸濁液を抽出します。
5. 針を0.2 mm / sの速度で3.0 mmの深さまで挿入し、針を0.5 mm戻し、10秒間一時停止して組織圧を安定させます。
6. キャリブレーション済みのマイクロインジェクションポンプを使用して1 μL/minで細胞を注入し、注入後10分間の滞留時間で逆流を最小限に抑えます。
7. マイクロシリンジをゆっくりと引き出し、滅菌綿棒で注射部位に30〜60秒間圧力をかけます。
8. 吸収性外科用縫合糸(6-0)で頭皮を縫合し、ヨードフォアで切開部を再消毒します。
9. 精密に制御された37°Cの加熱パッドにマウスを置き、再温め、その健康状態を監視します。
10. 持続的な正心反射と自発的な移動を示した後、マウスを清潔なケージに戻します。
11. in vivo 生物発光イメージングシステム(IVIS Spectrum)でマウスを画像化し、腫瘍形成後10日目に移植された腫瘍を検出します。
12. マウスにD-ルシフェリンカリウム塩(150 mg / kg)を腹腔内注射します。
    注:滅菌D-PBSを使用してD-ルシフェリンカリウム塩を希釈します。
13. 10分間の待機期間中、2%イソフルランを1 L / min O₂で使用して麻酔を誘発します。
    注:イソフルランは、麻酔蒸気への曝露を最小限に抑えるために、換気された化学フードで使用する必要があります。これは、処置中の動物と研究者の両方の安全を確保するためです。
14. ノーズコーン を介して 1.5%イソフルランで麻酔を維持します。
15. IVIS Spectrumを使用して生物発光イメージングを実行します。
16. マウスの小脳髄質貯水槽に穴を開けてCSF採取を行います。
    注:CSFは、イソフルラン麻酔下でマウスの小脳髄質槽に穴を開けることによって採取されました。麻酔、外科的曝露、サンプル採取を含むすべての手順は、汚染と感染のリスクを最小限に抑えるために SPF 条件下で実行されました。マウスを定位固定フレームにうつ伏せに置き、シスターナマグナを解剖顕微鏡下で注意深く露出させました。27 G ハミルトン注射器針を使用して貯水槽に穴を開け、フリーハンド技術を使用して CSF を採取しました。各マウスから約5〜10 μLの透明なCSFが得られました。感染のリスクをさらに減らすために、穿刺前に手術部位をヨードフォアで滅菌し、すべての手術器具をオートクレーブ滅菌しました。CSF採取後、穿刺部位を滅菌綿で優しく圧迫し、体液漏れを止めました。次に、マウスを加温パッドの上に置き、麻酔から完全に回復するまで継続的に監視しました。不快感を軽減するために術後鎮痛薬が投与されました。動物は、神経学的症状や感染の兆候がないことを確認するために、少なくとも連続3日間毎日観察されました。
17. フローサイトメトリーを実行して、CSF中の腫瘍細胞を検出します。GFP⁺ 集団は腫瘍細胞を表します。
    注:マウス神経膠腫細胞株GL261は、ルシフェラーゼ(Luc)を運ぶように操作されています。蛍光値が~5×10に達し、CSF中に⁵p/sand腫瘍細胞が検出されると、手順は成功します。使用したイメージングソフトウェアはLiving Image 4.5.2で、イメージングパラメータはLuminescentに設定されました。
18. CAR-T細胞の治療効果を評価するために、腫瘍形成に成功したマウスを選択します。

3. 側脳室へのCAR-T細胞注射による循環神経膠腫の治療

1. 循環神経膠腫モデルマウスの腫瘍サイズが~6.5 × 10⁵ p/sになったら、これらのマウスをCAR-T治療に選択します。
2. 循環神経膠腫モデルマウスの体重を量り、50 mg / kgのペントバルビタールナトリウムと50 mg / kgキシラジンの腹腔内注射でマウスを麻酔します。
3. 手順1.3〜1.5のプロセスを繰り返します。
4. 頭皮と頭蓋骨を分離し、循環神経膠腫モデルの構築中に開けられた穴を正確に特定し、手順2.2〜2.3で説明した手順に従います。
5. マイクロシリンジで10 μLのCAR-T細胞懸濁液を吸引し、マウスの側脳室に針を慎重に挿入し、定位装置を使用して注射深さを調整し、CAR-T細胞溶液をゆっくりと投与します。
   注:GL261細胞の注射と一致して、CAR-T細胞を右側脳室(座標:AP -1.1 mm、前脳からML -1.5 mm)に注射し、注入深さは2.5 mmでした。対照群は、CAR-T細胞の代わりにPBSで処理されました。
6. 針を10分間保持してから、針をゆっくりと取り外し、注射完了後の出血を防ぐために滅菌ガーゼで注射点を軽く押します。吸収性外科用縫合糸(6-0)で頭皮を縫合し、切開部を消毒します。
7. 精密に制御された37°Cの加熱パッドにマウスを置き、再温め、その健康状態を監視します。
8. 持続的な正心反射と自発的な移動を示した後、マウスを清潔なケージに戻します。
9. in vivo 生物発光イメージングを実行して、マウスの腫瘍の成長を監視します。光学イメージングにより、CAR-T 細胞の治療効果を評価できます。
10. マウスの体重を1日おきに測定し、5日ごとにBLIイメージングを実行して、最終エンドポイントに達するまで腫瘍の成長をより正確に追跡します。
11. マウスを安楽死させ、脳組織を4%パラホルムアルデヒドで24〜48時間固定します。
12. 組織をパラフィンに埋め込み、厚さ5μmのスライスに切片します。
13. 切片を脱パラフィンし、段階的なアルコールで再水和し、ヘマトキシリンで染色し、エオシンで対比染色し、カバーガラスで切片を取り付けます。
    注:本研究では、最終評価項目は30日目であり、マウスは腹腔内注射によるペントバルビタールナトリウムの過剰摂取によって安楽死させました。マウスの死骸は、処分のために南京医科大学医学実験動物センターに引き渡されました。廃棄された針は鋭利物容器に入れられ、南京医科大学の検査設備管理部門に引き渡され、集中処分されました。

結果

CAR-T療法の循環神経膠腫モデルの概略図を 図1に示します。CAR-T 細胞は、治療効果を実証するために、マイクロシリンジを使用して側脳室に注射されました。この方法により、循環神経膠腫細胞を標的とする CAR-T 細胞を脳に直接送達できます。注射手順は、GL261細胞をマウス側脳室に移植した後、11日目に実行されました。さまざまな時点で (15、20、25、および 30 日目)、 in vivo 生物発光イメージングとフローサイトメトリーを使用して腫瘍反応を監視し、CSF 中の GFP⁺ 腫瘍細胞を検出し、それによって CAR-T 細胞の投与が成功したことが確認されました。

実験のタイムラインを図2Aに示します。

ディスカッション

側脳室注射を使用してこの研究で確立された循環神経膠腫モデルは、大幅な進歩をもたらし、既存のモデルに比べていくつかの利点を提供します。側脳室注射技術は再現性が高く、比較的短い時間枠で一貫した腫瘍モデリングを可能にします。これにより、CSF への腫瘍細胞の播種を調査し、CAR-T 細胞などの治療法の有効性を評価しようとしている研究者にとって貴重なツールとなります。血液脳関門を通過することが困難な従来の静脈内CAR-T注入とは異なり、脳室内注射はCAR-T細胞を腫瘍周辺に正確に送達することを可能にする^10,18。The New England Journal of Medicine に掲載された 2024 年の研究では、再発性 GBM 患者 3 名が新しい CAR-T 療法後 1-5 日以内に有意な腫瘍退縮を経験し、1 人の患者の腫瘍がほぼ消失したと報告されています¹⁹。この方法の実装を成功させ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
吸収性外科用縫合糸	上海浦東金環医療製品有限公司	R611
カー-T	クリエイティブバイオラボ
D-ルシフェリンカリウム塩	MCEの	ハイ-12591B
GL261-Luc-GFP	上海中橋新州バイオテクノロジー有限公司	ZQ0932
生体内生物発光イメージングシステム	タノン	タノン ABL X6
実験動物用シェーバー	ビヨタイム・バイオテクノロジー	FS600
マウス	南京医科大学の動物コア施設
マイクロインジェクションポンプ	RWDの	R462
マイクロシリンジ	ハミルトン	87943
ミニ頭蓋ドリル	RWDの	78001
ペントバルビタールナトリウム	化学資源	57-33-0
定位固定装置	RWDの	68043
キシラジン	化学資源	7361-61-7