in vitroでのラットマクロファージによる同種および異種赤血球の食作用の定量的評価

サマリー

この研究では、単離されたラットマクロファージによる異種(ヒト)および同種(ラット)赤血球の食作用率を定量化および比較するための標準化された in vitro プロトコルについて説明しています。

要約

異種細胞移植は、免疫不全動物モデルであっても、重大な免疫拒絶反応に直面することがよくあります。残存免疫成分の中で、マクロファージは移植されたヒト細胞を積極的に食作用することができ、長期的な生着に課題をもたらします。これに対処するために、ヒトとラットの赤血球(RBC)のマクロファージを介した食作用を定量化するための標準化された in vitro アッセイを開発しました。ラット腹膜マクロファージを単離、培養し、ヒトまたはラットの赤血球に曝露しました。ヒト赤血球はCD235aを使用して同定され、ラットの赤血球はDeepRedで事前に標識されました。CD163を使用してフローサイトメトリー分析を実施し、マクロファージとゲート生細胞へのプロピジウムヨード(PI)の排除を特定しました。その結果、食作用活性に大きな違いが見られました:マクロファージの5.08%がヒト赤血球を飲み込みましたが、ラットの赤血球を食作用したのはわずか1.59%で、相対食作用指数は3.21でした。このプロトコルは、免疫適合性の定量的評価を可能にし、異種移植における自然免疫応答を評価するための再現性のある方法を提供します。これは、ドナーとレシピエントの選択を改良し、トランスレーショナルリサーチにおける免疫抑制戦略を導く可能性を秘めています。

概要

異種細胞移植の使用、特に動物モデルへのヒト細胞の生着は、生物^{医学研究において}不可欠な戦略です1。これにより、制御された in vivo 環境での細胞生存、生着、および免疫応答の評価が可能になります。マウスモデルは、その十分に特徴付けられた遺伝学と操作の容易さにより、歴史的にこの分野を支配してきましたが、そのサイズが小さいため、大量の血液量や高い細胞収量を必要とする研究では大きな制限が生じます。対照的に、ラットには、体重の増加、ヒトシステムとの生理学的関連性の改善、血液や腹膜マクロ^{ファージなどの}生物学的サンプルの収量の増加など、いくつかの利点があります2。その結果、ラットモデルは、造血および免疫^系の研究を含む研究でますます使用されています3。

異種移植における大きな課題の 1 つは免疫拒絶反応です。T細胞、B細胞、NK細胞が遺伝的に切除された免疫不全モデルでも、残存する自然免疫細胞、特にマクロファージは機能的に活性なままです⁴。マクロファージは宿主免疫系の第一選択の防御者として機能し、食作用を通じて外来細胞を認識して排除します⁵。このプロセスは、マクロファージ上のシグナル調節タンパク質アルファ(SIRPα)と、ほとんどの細胞型で発現する「私を食べないで」シグナルであるCD47との間の相互作用によって部分的に調節されています。ヒト細胞由来のCD47がげっ歯類SIRPαによって認識されない場合、この不一致は食作用の増強をもたらす可能性があります。これらの寛容な免疫不全動物でも、この現象は存在します ^6,7。

この文脈でマクロファージを介した食作用を定量化することは、細胞生存の可能性を評価し、移植戦略を最適化するために^{重要です8。}免疫拒絶反応を評価するためにさまざまな in vivo および ex vivo 方法が開発されていますが、マクロファージ食作用の標準化された in vitro アッセイは依然として限られています。従来の顕微鏡ベースの方法は、多くの場合、労働集約的であり、定量的な厳密さに欠けています。対照的に、フローサイトメトリーは、細胞タイプを正確に区別し、表面マーカー検出を通じて食作用の取り込みを測定できる単一細胞ベースのアッセイおよび定量プラットフォームを提供します。

この記事では、ラット腹膜マクロファージによるヒトおよびラット赤血球の異なる食作用を評価するための標準化された in vitro アッセイを開発しました。赤血球は、マクロファージを介した^{クリアランス}を阻害する「自己」シグナルとして作用するCD47の単純な構造と発現により、食作用アッセイの理想的なモデルとして機能します9。このプロトコルでは、ラット腹膜マクロファージを腹膜洗浄 によって 回収し、 in vitroで培養し、DeepRedで標識されたヒト赤血球または同種ラット赤血球のいずれかに曝露する。共インキュベーション後、フローサイトメトリーを使用して、マクロファージによる赤血球の内在化を評価します。マクロファージはCD163発現、ヒト赤血球はCD235a、ラット赤血球はDeepRed蛍光によって同定されます。死んだ細胞はPI染色 によって 除外され、生存可能なマクロファージのみが分析されます。

このアプローチにより、同種赤血球および異種赤血球の食作用活性 を in vitro で正確かつ定量的に評価できるようになり、マクロファージを介した免疫クリアランスの程度についての洞察が得られます。私たちの実験では、ラットマクロファージはラット赤血球(1.59%)と比較してヒト赤血球の食作用(5.08%)が有意に高く、相対食作用指数は3.21でした。これらの結果は、異種設定における自然免疫メカニズムの重要性を強調し、前臨床モデル検証におけるこのアッセイの価値を強調しています。

結論として、ここで提示されたプロトコルは、 in vitroでマクロファージ食作用を測定するための再現性のある効率的な方法を提供します。これは、異種移植、造血幹細胞研究、免疫適合性検査の分野で働く研究者にとって特に役立ちます。このアッセイは、食作用定量化のための標準化されたフレームワークを提供することにより、実験の再現性の向上と、種間移植モデルにおける自然免疫応答の理解の向上に貢献できます。

プロトコル

動物を含むすべての実験は、江蘇大学施設動物管理および使用委員会 (UJS-IACUC) によって承認された倫理方針および手順に従って実施されました (承認番号。UJS-IACUC-2021090102)。この研究は、江蘇大学付属病院の治験審査委員会によって承認されました。すべてのサンプルは、インフォームドコンセントを提供した患者から収集されました。除去した上清は専用の廃液タンクに入れ、病院の感染症科に引き渡します。

1.マクロファージの単離

1. 準備:実験用ラット、麻酔容器、ビーカー、麻酔薬としてのイソフルランなどの必要な材料を準備し、遠心分離機を4°Cで予冷します。
2. ラットの麻酔と犠牲:施設の動物管理ガイドラインに従って、過剰なイソフルラン麻酔を吸入した後、ラットを安楽死させます。
3. アルコール消毒:犠牲にしたラットをビーカーに入れ、ラットを完全に覆うのに十分な量の75%エタノールを加えます。10分間浸します。
4. 腹部液の注入と混合:ラットの腹部を消毒し、注射器を使用して正中線に沿って50 mLの氷冷滅菌PBSを腹腔内に注入します。
   1. ラットを軽く振って腹壁を指でマッサージして、腹腔内の体液が完全に混合されるようにします。2〜3分間マッサージします。
5. 腹液の採取:ラットの腹壁に小さな切開をし、体を少し傾け、注射器で腹液を吸引します。
6. 遠心分離:収集した液体を500 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
7. 赤血球溶解:赤血球溶解バッファーの細胞ペレット体積の3〜5倍を加え、1〜2分間穏やかに混合します。
   注:たとえば、細胞ペレットの容量が1 mLの場合、3〜5 mLの溶解バッファーを追加します。このステップは、室温または4°Cで実行でき、続いて400〜500 x g で5分間遠心分離します。4°Cでの遠心分離がより効果的です。浸透圧により、赤血球が溶解し、溶液が赤くなります。遠心分離後、赤い上清を取り除きます。
   1. 赤血球(RBC)溶解バッファーレシピ:8.3 gのNH4Cl、1.0 gのKHCO3、および1.8 mLの5%EDTAを800 mLの蒸留H₂Oに溶解し、0.2 μmフィルターでろ過滅菌し、蒸留H₂Oでqsを1000 mLにし、pHを7.2~7.4に調整します。赤い沈殿物がまだ見える場合は、溶液が透明になるまでこの手順を繰り返します。通常、少量の残存赤血球は後続のアッセイに影響を与えません(ペレット中の赤血球が少ない場合、このステップは省略できます)。
8. 細胞洗浄:約10 mLの予冷RPMI 1640培地で細胞を2回洗浄します。毎回4°Cで500 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
9. 細胞の再懸濁と計数:RPMI 1640 + 1%FBS + 1%PSからなる予冷培地に細胞を再懸濁し、トリパンブルー染色を使用して細胞をカウントし、細胞生存率を評価します。
10. 細胞培養:培養が必要な場合は、1ウェル培養プレートに1×10⁶/mLの密度で細胞を播種し、ウェルあたり1 mLのRPMI 1640-10%FBS-1%PS培地を播種します。2時間のインキュベーション後、培地を交換し、ウェルをRPMI 1640培地で1〜2回洗浄して、非接着細胞を除去します。
    注:接着細胞はマクロファージの単層を形成します。RNA抽出が必要な場合は、細胞ペレットに1 mLのTrizolを加え、複数回ピペットで細胞を破壊し、混合物を1.5 mLの微量遠心チューブに移して即時RNA抽出するか、-80°Cで保存します。 FACS分析の場合は、細胞数をチューブあたり1×10⁶ に調整し、20 μLのFACSバッファーを添加して、FACS染色を続行します。FACSバッファー:DPBS + 2%FBS、フィルターは0.22μmフィルターで滅菌し、4°Cで保存)。

2. ラットまたはヒト赤血球の収集

1. 準備:15 mL遠心分離管と10 mLシリンジをヘパリンで事前にすすぎます。
2. ラットの心臓血の採取:ラットを麻酔して犠牲にした後、ラットの尾の小さな部分をハサミで慎重に切り取り、尾静脈から血液を採取します。
3. 人間の血液の採取:静脈穿刺技術を使用して人間の血液を採取します。
4. 血液サンプルの混合:1 mLのPBSを1 mLのヒト静脈血またはラット血液と混合します。
5. Ficoll密度勾配分離:ヒト末梢血用の15 mL遠心分離管に、密度1.077のFicoll溶液1.5 mLを加えます。ラット血液用の15 mL遠心分離管に、密度1.084のFicoll溶液1.5 mLを加えます。
6. 血液サンプルの層状化: 希釈した血液サンプルを遠心分離管の壁に沿って、対応する密度勾配溶液にゆっくりと層状に重ねます。
7. 遠心分離:18〜20°Cの温度で400 x g で30分間遠心分離します。
8. 血漿層とリンパ球層の除去:上部の血漿層、リンパ球層、およびフィコール溶液層を除去し、下部の赤血球層のみを残します。
9. 赤血球洗浄:赤血球を10 mLのPBSで1回洗浄します。
10. 遠心分離と上清の除去:400 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
11. 細胞の再懸濁と計数:1.5 mLの微量遠心チューブに1 mLのRPMI 1640培地を加え、適量の赤血球ペレットと混合し、細胞計数を行います。

3. in vitro 食作用アッセイ

1. マクロファージの単離と培養:マクロファージを単離し、12ウェル培養プレートに1×10⁶ 細胞/ウェルの密度で播種します。37°Cで5%CO₂ で2時間インキュベートし、細胞を接着させます。
2. 非接着細胞の除去:2時間のインキュベーション後、非接着細胞を慎重に除去し、RPMI 1640培地で穏やかに洗浄します。
3. 培養の継続:培養プレートの底に完全に接着するように、接着したマクロファージを最大2時間培養し続けます。
4. 飢餓処理:2時間後、培地を無血清RPMI 1640と交換し、飢餓条件下で2時間インキュベートして、マクロファージの食作用活性を高めます。
5. ヒト細胞の添加:DeepRedで事前に染色したヒト細胞を培養プレートに加え、37°Cで5%CO₂ で2時間インキュベートして、マクロファージがヒト細胞を食作用できるようにします。
6. 結論と分析: 食作用アッセイの後、顕微鏡下で食作用活性を観察するか、フローサイトメトリー (FACS) を使用して定量化します。

4. フローサイトメトリー

1. 細胞調製:0.05%トリプシン-EDTAで細胞を消化し、10%FBSを含むRPMI 1640培地を使用して消化を停止します。細胞を遠心分離し、上清を廃棄し、細胞をFACSバッファーに再懸濁し、カウントします。2本のチューブで1本×1本10本^の6本 の細胞を用意します。さらに、ヒト赤血球のチューブ1本とラット赤血球のチューブ1本を準備します。
2. 単一染色チューブの調製:マウス抗ラットCD163抗体を1つのサンプルチューブに、マウス抗ヒトCD235a抗体をヒト赤血球チューブに、DeepRedをラット赤血球チューブに追加します。
   1. これらのチューブを光から保護した氷上で30分間インキュベートし、10分ごとに混合します。1 mLのFACSバッファーを加えて、結合していない抗体を洗い流し、遠心分離して上清を廃棄します。細胞を500 μLのFACSバッファーに再懸濁します。
3. サンプル調製:マウス抗ラットCD163、マウス抗ヒトCD235a抗体、およびDeepRedをサンプルチューブに加えます。光から保護した氷上で30分間インキュベートし、10分ごとに混合します。各サンプルチューブに1 mLのFACSバッファーを加えて、結合していない抗体を洗い流し、遠心分離して上清を除去します。細胞を500 μLのFACSバッファーに再懸濁します。
4. 分析: FSC-H と FSC-A のゲーティングにより、細胞接着を除外します。サンプルを分析する前に、シングルステインチューブを使用して適切な電圧と補償設定を調整します(図1)。FlowJo v10.8.1ソフトウェアを使用してデータを分析します。
   注:CD163-FITCおよびPI単一染色コントロールを使用して、補償を設定しました。

結果

フローサイトメトリー解析により、ラットマクロファージのヒト赤血球およびラット赤血球に対する食作用率を推測できます。死細胞は最初にPIを使用して除外されます。CD235a陽性を発現するCD163陽性マクロファージは、ヒト赤血球の食作用を示します。食作用されたhRBCを有するマクロファージの割合は、ヒト赤血球に対するラットマクロファージの食作用率として定義されます。ラット赤血球の食作用の割合も同様に計算された。CD235aと深赤の二重陽性細胞は、ラットとヒトの両方の赤血球を貪食するマクロファージを表します。これら2つのデータポイントを比較することにより、ラットマクロファージによるヒト赤血球の食作用を評価できます(図2)。

ディスカッション

この研究は、異種赤血球と同種赤血球の両方のマクロファージを介した食作用を評価するための堅牢で再現性のある in vitro アッセイを確立しました。この研究では、ヒト赤血球はCD235a-BV421で標識され、ラット赤血球はDeepRed色素で染色されました。マクロファージが標識赤血球を食作用すると、結合抗体(CD235a-BV421)または色素(DeepRed)が一緒に内在化されます。その結果、マクロファージ自体が対応する蛍光を示します。これらの条件下では、食作用マクロファージは二重陽性集団(CD163⁺CD235a⁺ またはCD163⁺DeepRed⁺など)としてFACSによって容易に検出でき、食作用活性の直接的かつ定量的な評価が可能になります。当初、マクロファージを異種赤血球と共培養することにより、食作用速度を直接評価しようとしました。ただし、このアプローチではバッチ間の変動が大きくなり、結果の信頼性と比較可能性が制限される一貫性のない結果が生じました。この問...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.05% トリプシン-EDTA	サーモフィッシャー	25300062
ディープレッドセルトラッカー	サーモフィッシャー	C34565	火薬(15 & mu;g)はDMSOに溶け込んだ(20 & mu;L)
ジメチルスルオキシド(DMSO)	シグマ	D2650
ダルベッコのリン酸塩緩衝塩水(DPBS)	サーモフィッシャー	C10010500BT
フィコル・パケ PLUS	シチバ	17144002
フィコル・パケ プレミアム	シチバ	17544602
マウス抗ヒトCD235a BV421抗体	BDバイオサイエンス	562938
マウス抗ラットCD163 FITC 抗体	バイオ・ラッド	MCA342F
プロテインK	シグマ	P2308
RPMI 1640	サーモフィッシャー	11875093