マウス動脈の止血のための簡単かつ効果的な手順

サマリー

本研究はマウスの動脈で止血を達成する効果的な方法の開発を目指しています。

要約

マウスの動脈穿刺やカニュレーション時には、針抜き後の止血が困難なため、動脈の永久結紮が必要になることが多いです。これにより供給された組織領域に永久的な虚血性損傷が生じます。このような局所的な虚血は二次合併症を引き起こすことが多く、動物モデルでの実験結果を損なうことがあります。本法は、術後に穿刺部位を封じつつ正常な血流を維持し、術後の虚血を防ぐことを目的としています。この方法は、実験動物から脂肪組織の断片を採取し、標準的な技術で動脈穿刺を行い、穿刺部位を脂肪パッドで包んで止血を促し、血流を維持するというものです。本研究では、マウスに対して両側総頸動脈穿刺を行い、その後脂肪巻き技術を用いた止血を行いました。レーザースペックル造影画像法(LSCI)では、偽手術群と手術群の間で脳血流変化に差はなく、手術群の術前・術後脳血流測定でも有意な変化は認められませんでした。手術後7日、14日、28日の組織学的評価により、(1) 脳構造の保存(H&E染色)、(2) 変性変化なしの神経形態が完全な(ニッスル染色)、(3) 脳切片に病理学的変異がないことが明らかになりました。この動脈止血技術は、脂肪組織の柔軟な特性と生理的凝固機構を活用しています。この処置は、(1) 穿刺部位に自己脂肪を巻きつけ、(2) 動脈の人工床に最適に接触するように縫合糸で固定すること、(3) 出血した血液が脂肪と動脈の境界に浸透し、そこで凝固を経ることを含みます。この三重作用機構は、安定した止血を実現しつつ、動脈の通存性を維持し、術後の虚血合併症を予防します。この手法は、著しい手続き的簡易性、臨床的有効性、優れた翻訳可能性を示しています。

概要

動物モデルにおいて、動脈損傷の生成は、脳虚血再灌流モデル、頸動脈(CCA)または大動脈(AO)動脈硬化モデル、脊髄虚血モデルなど、さまざまな病理学的状態をモデル化するために広く利用されている実験的手法です。

マウス脳虚血再灌流(MCAO)モデルを例に挙げると、現在の標準的なモデリングアプローチ^1,2,3は以下の通りです:外頸動脈(ECA)を隔離し、その遠位端を結紮し、近位ECAを動脈クリップで挟みつつステイ縫合糸を挿入し、これらの点の間に穴を開け、CCAを逆行的にフィラメント挿入します。 血管とフィラメントをステイ縫合で固定し、穿刺部位と遠位結紮の間のECAを切断し、動脈クリップを解放し、フィラメントを内頸動脈(ICA)に迂回させて中大脳動脈を閉塞し、フィラメント抜却時に近位ECAを結紮します。

この処置は再灌流を達成しますが、共通とICA間の血流を回復させるだけで、ECAは永久に切断されます。このECA切断は同側顔面領域に虚血性損傷を引き起こし、これは手術を複雑にするだけでなく、実験動物に交絡外傷をもたらし、研究結果に影響を与える可能性があります。さらに懸念されるのは、一部の実験プロトコル^4,5では、研究者が直接CCA穿刺を行い、MCAOを確立するために縫合糸を挿入し、直ちに除去し、貫通部位の両端で永久結紮して止血を行うことです。しかし、この方法は血管圧を直接増加させ、心の後負荷を高め、^心不全を引き起こす可能性があります。

例として、マウスCCAまたはAOの内皮損傷モデルと高脂肪食を用いて動脈硬化を確立し、従来の方法7,8,9,10では、CCA、腹部大動脈(AA)、または大腿動脈(CFA)に動脈穿刺を行い、バルーンカテーテルを挿入して内皮剥離を誘発し、穿刺部位の両端を永久的に結紮して止血を達成することを含みます。この標準的なアプローチにはいくつかの重大な制約があります。義務的な結紮は閉塞部位の遠位に局所的な虚血を生じさせます。さらに悪影響を及ぼすのは、結合部位で脂質の蓄積が起こることです。妥協モデルの妥当性は局所血行動態に影響を与えることで変化し、これは標的病変への薬物送達を妨げ、薬理学的評価結果を歪めます。

マウス脊髄虚血モデルでは、動脈穿刺(CCA、AA、またはCFAアクセスによる )と、バルーンカテーテルを挿入して標的部位に虚血を誘発する手術を含み^ます。バルーン抜歯後、従来の止血は穿刺部位を両側から永久結紮することで実現されます。

前述の3つのモデルすべてにおいて、穿刺後の止血は貫通部位の両側結紮によって一様に達成されます。出血抑制には効果的ですが、この方法は局所的な虚血を誘発し、二次的な合併症を引き起こし、最終的にモデルの妥当性を損なう結果となります。したがって、止血時の血管通存性の維持は生理学的および実験的に極めて重要です。したがって、本記事ではマウス実験のための革新的でシンプルかつ効果的な動脈止血法を紹介します。この処置では、まず動脈血管クリップで穿刺部位の両端を挟み、その後、動脈を3mm×3mm×1mmの脂肪パッドで包帯して穿刺部を覆います。脂肪パッドは動脈の周囲に結紮糸で固定されます。動脈クリップは徐々に緩められ、出血に応じて結紮の締まり方を調整し、完全な止血が達成されます。この方法は血流を回復し、正常な血行動態を維持し、永久的な血管結紮による周囲組織の虚血損傷を防ぎます。特にマウスの状態の長期的なモデリング後観察や薬理学的介入の評価に有利であり、前臨床試験の実験的厳密性を大幅に高めます。

プロトコル

すべての実験手順は、実験動物のケアおよび利用に関するガイドライン(プロトコル承認番号)を厳格に遵守して実施されました。SNLL25040501;動物使用許可証番号瀋陽農大機関畜産管理・利用委員会(IACUC)によって設立されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 実験的調製

1. 動物の詳細と文書化:ARRIVEガイドラインに従い、すべての動物研究データを記録してください(動物研究:生体内実験の報告)。6〜8週齢の雄のBalb/Cマウスを使用し、体重22g±4g。12時間の明暗サイクルのもと±242°C、相対湿度55%±5%を維持します。
2. 動物の調理
   1. イソフルラン・ヴェポライザーでマウスを麻酔します(機関で承認されたプロトコルに従い)。4%イソフルランで麻酔を誘導し、その後2%イソフルランで維持します。
   2. 麻酔後、頸部と頭蓋部を脱毛し、露出した皮膚をポビドンヨウ素で消毒し、その後75%エタノールで残留物を除去します。
   3. その後のすべての実験手順のために、マウスを37°Cの温熱パッドに置いてください。
3. マウスのベースライン脳血流の測定
   1. マウスをうつ伏せの姿勢に置きます。頭皮の中央に切開して頭頂骨を露出させます。慎重に頭蓋骨表面から上層の筋膜層を解剖し除去します。
   2. LSCIシステムを調整して、露出したマウスの頭頂骨を10倍倍でスキャンし、脳血流のベースラインを記録します。
4. 脂肪パッドを採取し、動脈穿刺を行います
   1. マウスを仰向けに位置を変えます。頸椎の中央に切開をしてください。後で使用するために3mm×3mm×1mm皮下脂肪組織移植片を採取してください。
   2. 下顎下、胸骨舌骨筋、胸鎖乳突筋の鈍的解離を行います。両方のCCAを暴露しましょう。
   3. CCAを解放してICAとECAを暴露しよう。
   4. 血管クランプ1をCCAの遠位端に当て、近位端に血管クランプ2を当てます。
   5. 23Gの針で2つのクランプの間のCCAを刺します。
5. ファットパッドの貼り付け
   1. 針を抜いた後、CCAを穿刺部位で脂肪パッドの切断面(セローザ以外の側)で包みます。
   2. 脂肪で包帯された部分の下に4-0縫合糸を置きます。次に脂肪面に一回優しく結び、脂肪パッドと血管壁の接触が確実にできるよう圧力をかけます。最後に、結紮を徐々に調整し、止血のための圧力バランスを保ちます。
   3. 湿った綿棒で遠端CCAを持ち上げます。血管クランプ1を外し、綿棒をゆっくりと取り出して、穿刺部位への血流を徐々に流します。
   4. 血流の確認;活動性出血が認められた場合は、血管クランプ1で遠位CCAを再照射します。
   5. 1分待ってから、血管クランプ1をゆっくりと外します。出血が発生した場合は、脂肪パッドの位置を変えるか、結紮の単一投動部分を少し締めて圧力を上げます。これらの調整を続け、完全な止血が得られるまで続けます。
   6. 湿らせた綿棒で近位CCAを上げます。血管クランプ2を外し、綿棒を徐々に取り出して、穿刺部位への血流をコントロールできるようにします。
   7. 出血がある場合は、血管クランプで遠位CCAを再照射します。
   8. 縫合糸の単一巻きを少し締めて圧力を上げます。1分待ってから近位CCAを上げ、血管クランプ2を外します。湿らせた綿棒をゆっくりと刺し穴に向かって転がします。
   9. 出血が続く場合は、完全な止血に達するまで前述の2つの手順を繰り返します。
   10. 縫合をもう一度加えて、最初の結び目の上に二重結び目を作ることで、脂肪パッドをよりよく血管壁に固定し、血管内および外部のバランスの取れた圧力によって止血を達成します。
   11. 脂肪パッドの両側の総頸動脈が充填され、血管径が一定であることを確認し、これは血流回復と止血の成功と考えてください。
   12. 同じ手順を繰り返して、対側総頸動脈に穿刺止血を行います。
   13. 偽マウスでは、動脈穿刺や脂肪パッド包帯を行わずに両側総頸動脈を露出させ、他の手術は手術群と同一のものにします。
   14. 頸部手術切開部を縫合し、消毒液を塗布してください。
6. 術後脳血流評価の実施
   1. マウスの両側CCA穿刺止血が完了した後、露出した頭頂骨をスキャンして10倍拡大画像を取得するためにLSCIシステムを調整します。次に脳の血流変化を記録します。
   2. 頭皮の切開部を縫合し、消毒液を塗布し、マウスが37°Cの温熱パッドで回復した後、再び飼育ケージに戻して継続的なケアを行います。
7. 術後のモニタリングおよび組織採取の実施
   1. 術後期間中のマウスの生存状況、運動活動、出血の兆候を毎日監視・記録してください。
   2. 術後7日目、14日目、28日目に、マウスを二酸化炭素で安楽死させ(機関で承認されたプロトコルに従い)、脳組織を4%のパラホルムアルデヒドで固定します。

2. 病理学的検査

1. 24時間の固定後、脳組織をエタノール勾配で脱水し、キシレンで透明化し、パラフィンに埋め込んで切片を行います。
2. 海馬切片にH&E染色を行い、顕微鏡で脳組織の形態を観察します。
3. 海馬切片にニッスル染色を行い、顕微鏡で神経構造を調べます。

結果

術前および術後のレーザースペックル造影画像データおよび相対灌流測定の分析では、偽手術群および手術群の相対的な灌流測定では有意な変化は見られず、この動脈止血技術が脳血流を損なうことなく総頸動脈穿刺部位を成功裏に封じたことが示されました(図1)。

手術群のマウスは術後28日間継続的にモニタリングされ、死亡率は認められませんでした。彼らの運動活動は偽グループや自身の術前基準レベルと比較して差はなく、頸部や下顎下部では出血も検出されませんでした。これらの発見は、この方法が動脈止血に対して有効であることを裏付けています。

偽グループおよび手術群の両方から採取された脳組織のH&E染色は、皮質、海馬、視床に組織構造が保存された明確な組織学的構造を示し、有意な病理学的変化は認められませんでした。ニューロンは細胞密度の減少なしに形態が完全な状態でした。ニッスル染色は、よく組織された神経細胞の整列、正常な細胞構造、そして...

ディスカッション

MCAOモデルでは、ECAをよりよく保存することで、ECA結紮および切断に伴う顔面虚血損傷を防ぎ、臨床病理の再現につながります。従来のCCA穿刺 による フィラメント挿入は技術的には簡潔ですが、穿刺部位の両側結紮が必要であり、脳灌流はウィリス円側副血流に依存し、真の脳卒中病態の最適ではない表現となります。本研究で紹介された脂肪パッド止血技術は、縫合糸除去時に同時に血管修復と血流回復を可能にし、虚血合併症なしに脳と顔面の同時灌流を保証します。このアプローチにより、代償的な循環機構を必要とせずに術後即時の再灌流が可能となります。その結果、最適化されたMCAOモデルは人間の脳卒中メカニズムをより正確に模倣し、臨床的に関連性の高いデータを生成し、結紮誘発性虚血性併存疾患のない長期生存研究を支援します。

血管内皮損傷やバルーン誘発性虚血再灌流を伴う動物モデルでは、この方法はカニュレーション後に動脈穿刺部位を効果的に封じ、血流を維持しつつ脂質沈着を防ぎます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4-0 糸縫い針付き	上海浦東金環医療用品有限公司
バルブ/Cマウス	北京華福康バイオテクノロジー有限公司		6フィート8インチ、男性
DHGシリーズ 加熱・乾燥オーブン	上海益衡科技有限公司	DHG-9123A
ヘマトキシリンと嗜酸(H&E) 高精細染色キット	サービスバイオ	G1076-500ML
イソフルラン	深圳瑞沃德生命科技有限公司	R510-22
レーザースペックルアナライザー	深圳瑞沃德生命科技有限公司	RFLSI ZW
ニッスル染料溶液	サービスバイオ	G1036-100ML
組織埋め込み機械	ライカ	ヒストコア・アーカディアH
スライドスキャンイメージングシステム	深圳盛強科技有限公司	SQS-40R
小動物麻酔装置	深圳瑞沃德生命科技有限公司	R500
組織脱水機	ライカ	ヒストコアパール
超純水システム	熱力学	50132370
超薄半自動ミクロトーム	ライカ	HistoCore マルチカット