軸索損傷モデル用マイクロ流体チップの構築とマルチオミクス解析の実現

サマリー

このプロトコルは、軸索損傷後のニューロン代謝ダイナミクスをモデル化するマイクロ流体システムを記述し、内因性代謝リモデリングのイメージング、マルチオミクス分析、およびメカニズム研究を可能にします。

要約

ニューロンは分極して樹状突起と軸索を形成し、細胞間コミュニケーションを可能にします。軸索損傷はこれらの接続を破壊し、損傷信号を体細胞に伝達し、多くの場合、神経細胞の変性を引き起こします。したがって、軸索恒常性を維持することは、局所的な軸索再生を促進し、神経変性から保護するために不可欠です。このプロセスは、エネルギーと生合成前駆体を供給する細胞代謝に依存しており、代謝バランスを調節し副産物を排除するメカニズムによって維持されます。しかし、ニューロンの代謝は体細胞と軸索の間で区画化されており、星状細胞由来の代謝活性(星状細胞-ニューロン乳酸シャトルなど)などの周囲の微小環境によってin vivoでさらに影響を受けます。これらの要因は、ニューロンの固有の代謝メカニズムの調査を複雑にします。これらの課題に対処するために、ここでは、生理学的解糖フラックスやミトコンドリア呼吸など、in vivoで観察された主要な代謝特性を維持する、初代皮質ニューロンをin vitroで培養するためのマイクロ流体プラットフォームを開発しました。このシステムは、軸索損傷後のニューロンの内因性代謝リモデリングを調査するための簡略化されたモデルを提供します。従来のマイクロ流体チップは、in vitro 軸索損傷モデルをサポートし、生細胞イメージング、免疫蛍光染色、および低酸素治療と互換性があります。数百万の細胞が関与する大規模なトランスクリプトームおよびメタボローム分析に対応するために、最適化された操作プロトコルを備えたハイスループットマイクロ流体チップをさらに設計および製造しました。この装置は、マイクロチャネルで接続された体細胞室と軸索室を交互に配置され、軸索コンパートメントからの液体の真空吸引によって軸索損傷が誘発されます。このプラットフォームにより、代謝産物と酵素のダイナミクスを迅速に評価し、マルチオミクス研究の精度と再現性が向上します。

概要

ニューロンは、発達中の分極を介して、軸索と樹状突起という特殊な機能を持つ2つの異なるタイプの突起を確立します^1,2。神経再生とは、神経損傷³ 後の軸索再成長のプロセスを指し、中枢神経系 (CNS) 修復に重点を置いた研究が行われています。末梢神経系とは異なり、CNSは^{再生能力が}限られており^4,5,6、^脊髄損傷または外傷性脳損傷の患者に持続的な機能障害または永続的な障害をもたらすことがよくあります^7,8。したがって、CNS 修復を強化する戦略を開発し、軸索再生の根底にあるメカニズムを解明することが重要です。

マイクロ流体デバイスは、統合された、費用対効果が高く、ハイスループットの in vitro 培養システムとして機能し、近年の細胞およびニューロン研究において顕著な利点を示しました ^9,10。従来の方法と比較して、マイクロ流体技術は、流体せん断応力、濃度勾配、および空間構造の正確な調節を可能にし、それによって本物の生理学的および病理学的微小環境を厳密にシミュレートして、細胞の成長、遊走、分化、および相互作用を促進します11,12,13,14。マイクロ流体工学に基づく in vitro 軸索損傷モデルは、空間分極を通じてニューロン細胞体とプロセスの区画化された培養を可能にし、ニューロンの固有の再生能力と損傷後の代謝適応を調査するための不可欠なツールを提供します^{15,1 6,17,18}。これは、ニューロンが損傷にどのように反応し、代謝プロセスを調節し¹⁹、軸索再生を促進するかを知る重要な窓を提供します²⁰。しかし、軸索損傷や代謝研究のための既存のマイクロ流体プラットフォームは、神経細胞収量の低さ、代謝測定の精度の低下、標準化された操作手順の欠如などの課題に依然として直面しています。

これらの制限に対応して、この研究は、軸索損傷の標準化されたハイスループット誘導を可能にし、区画化されたマルチオミクス分析に十分な細胞材料を提供する新しい大規模マイクロ流体プラットフォームを開発しました。この統合設計は、神経損傷研究における重要なアンメットニーズに直接立ち向かいます。具体的には、私たちが設計したマイクロ流体チップは、マイクロ溝で接続された体細胞チャンバーと軸索チャンバーを交互に配置し、制御された真空吸引によって軸索切断が達成されるのを特徴としています。このアプローチは、軸索再生の根底にある代謝メカニズムの調査など、再現性のあるハイスループット軸索損傷モデルと正確な代謝プロファイリングを必要とする研究に最適です。従来の方法と比較して、この技術はスループットが高く、代謝精度が高く、標準化された損傷モデルを確立する機能を提供します。たとえば、以前の研究では、軸索再生におけるミトコンドリア輸送の重要性が実証されていますが^{20、21、22、23、私たちの}プラットフォームは、損傷後の軸索再生におけるグルコース代謝の役割をさらに明らかにしています。このプロトコルは、視覚的に検証可能で運用的に標準化された大規模な軸索切開および代謝分析のための技術システムを確立します。

プロトコル

すべての実験は北京航空航天大学倫理委員会のガイドラインに従って実施され、委員会によって承認されました (承認コード: BM20210060)。 図1 は、実験のタイムラインの概要を示しています。

1. 従来型・大規模マイクロ流体装置の設計

1. AutoCADを使用してマイクロ流体デバイスを設計し、2次元(2D)回路図と3次元(3D)構造モデルを作成します。
2. これらの設計を使用して、SU-8ネガフォトリソグラフィを使用してシリコンウェーハ上にマスターモールドを製造します。
3. ポリジメチルシロキサン (PDMS) を鋳造してマスター金型を複製し、高精度で機能的なマイクロ流体チップが得られます。
4. 各マイクロチャネルを高さ5μmに設計し、体細胞を遮断しながら軸索のみが通過できるようにします。
5. マイクロチャネルを幅10μmにして、軸索容量を増やします。
6. チャンバーを高さ120μm、幅220μmに設計し、ニューロン体細胞に十分なスペースを提供します。
7. このマイクロ流体プラットフォームを使用して、流体の流れとニューロンの配置を制御することにより、 in vivo 軸索損傷をシミュレートします。
8. 高精度な細胞操作のためのデバイスを使用してメタボロームおよびトランスクリプトームサンプルを調製し、ハイスループット処理を可能にしてサンプルの精度と生物学的妥当性を向上させます。

2. 従来型および大型マイクロ流体デバイスの作製

1. PDMSベースと硬化剤を10:1(w / w)の比率で計量し、遠心分離管に入れます。
2. PDMS混合物の入った遠心分離管を遠心撹拌ミキサーに入れます。2000 × g で4分間遠心分離して混合し、次に再び2000 × g で4分間遠心分離して脱気します。
3. 脱気したPDMSを13〜15gをマイクロ流体金型に注ぎ、金型の底が完全に覆われていることを確認します。
4. 金型を真空デシケーターに入れます。真空ポンプを使用して5〜10分間空気を排出し、PDMSから気泡を完全に除去します。
5. ゴム球を使用してPDMSの表面を軽くたたき、残っている表面の気泡を壊します。
6. 型を対流式オーブンに入れ、80°Cで100分間焼き、PDMSを硬化させます。
7. PDMSが完全に硬化したら、メスの先端をPDMSの端の下にそっとスライドさせ、慎重に持ち上げて型から分離します。
8. 直径2.0〜2.5 mmの生検パンチを使用して、培地の注入と細胞ローディング用の穴をPDMSに開けます。
9. PDMSの表面の不純物を粘着テープで取り除き、清潔なガラス皿に入れ、アルミホイルで包んで保管します。
10. (オプション)PDMS表面を酸素プラズマ(30 W、20秒)で処理し、それを別の表面に押し付けて不可逆的な結合を実現します。
11. 実験の前に、マイクロ流体デバイスを121°Cおよび101 kPaで5分間オートクレーブして、無菌性を確保します。

3. 皮質ニューロンの調製

1. 生後スプレイグ・ドーリー(SD)ラット3匹(生後12時間以内)を氷上に5分間置き、麻酔し、その後急速に首を切る。
2. 大脳皮質の運動野を解剖し、組織を予冷した解剖バッファー(例えば、カルシウムとマグネシウムを含まない2 mLのHBSS)に入れます。
   注:事前に冷却された溶液を使用して、氷上ですべての組織解剖手順を実行します。
3. 滅菌ハサミを使用して組織を約^{1 mmの} 3個にみじん切りにし、15 mLの遠心分離管に移します。
4. 5分間放置してから、上清を慎重に吸引して残留血液と緩衝液を除去します。
5. 37°Cに加熱したカルシウムとマグネシウムを含む5mLのHBSSに予熱したパパイン溶液(1 mg / mL)を加えます。
6. 37°C、5%CO₂ インキュベーターで40分間インキュベートし、10分ごとにチューブを3回静かに反転させます。
7. 消化後、200 μLピペットを使用して懸濁液を100回穏やかに粉砕します。
   注:細胞ストレスを防ぐために、気泡の導入を避けてください。
8. 300 × g で 3 分間遠心分離し、上清を廃棄します。
9. 1 mg/mLのプロテアーゼ阻害剤を含む終了溶液(例えば、カルシウムとマグネシウムを含む5 mLのHBSSに600 μLのパパイン解離システムキット阻害剤バイアル)を加えて細胞を再懸濁します。
10. 細胞懸濁液を40μmのセルストレーナーでろ過し、濾液を新しい遠心分離管に回収します。
11. 濾液を200× g で10分間遠心分離し、上清を廃棄します。
12. ペレットを2%B27および1%GlutaMAXを含む500 μLの完全ニューロン培養培地に再懸濁します。
13. 細胞を数え(約300万/ラット)、密度を1×10⁶ 細胞/mLに調整して、その後使用します。

4. コーティング

注:カバーガラスまたは培養皿をポリ-D-リジン(PDL)溶液で処理して、ニューロンの接着を改善し、ニューロンの成長に最適な環境を作り出します。

1. カバーガラスのコーティング
   1. 従来のマイクロ流体デバイス(Φ25 mm、厚さ0.17 mm)用のカバーガラスを35 mmの培養皿に入れ、2 mLの0.1 mg/mL PDL溶液を加えます。
   2. 37°Cで6時間または一晩インキュベートします。
   3. インキュベーション後、PDL溶液を慎重に回収し、再利用または適切に廃棄します。
   4. 2 mLの滅菌超純水を皿に加え、時計回りに50回回転させ、続いて反時計回りに50回回転させます(複数の皿の場合は、大きな皿で同時に回転させます)。
   5. 滅菌ピペットチップに接続された真空ポンプを使用して水を吸引し、廃棄物を液体廃棄物容器に収集します。
   6. 洗浄手順(手順4.1.4〜4.1.5)を合計3回繰り返します。
   7. 使用前に、カバーガラスをバイオセーフティキャビネット内で自然乾燥させてください。
2. 培養皿用コーティング
   1. 培養皿またはウェルプレートに適量の0.1 mg/mLのPDL溶液を加えます(例えば、従来のマイクロ流体の場合は35 mmの皿に2 mL、大規模なマイクロ流体の場合は10 cmの皿に5 mLを加えます)。
      注意: 汚染を防ぐために、バイオセーフティキャビネットが無菌の気流で適切に動作していることを確認してください。
   2. 溶液が底を完全に覆っていることを確認し、37°Cで6時間または一晩インキュベートします。
   3. PDL溶液を回収した後、ステップ4.1.4で説明したように、培養皿を適量の滅菌超純水で3回洗浄する。
   4. 残留した超純水を取り除き、後で使用するために層流フードで培養皿を自然乾燥させます。

5. 神経細胞培地の調製

1. ルーチンニューロン培養用の完全な培地を調製します。
   1. 使い捨ての50mLシリンジからプランジャーを取り外します。ゴムヘッドを上に向けてシリンジをバイオセーフティキャビネット内のクリーンベンチに置きます。
   2. 500 μLのペニシリンストレプトマイシン(PS)、1 mLのB27、125 μLのGlutaMAX、および500 μLのウシ胎児血清(FBS)をシリンジに順番に加えます。相互汚染を避けるために、各コンポーネントのピペットチップを変更してください。
      メモ: 一貫性を保つために、各コンポーネントを指定した順序で追加します。
   3. 新しい滅菌50mL遠心分離管を取ります。「Neurobasal-A(NBA)+2%B27+0.25%GlutaMAX+1%FBS+1%PS」と表示します。
      注: 胚性ニューロンでない場合は NBA を使用します。胚性ニューロンには神経基底(NB)を使用します。
   4. 0.22 μmのシリンジフィルターをシリンジの端に取り付けます。
      注意: 漏れを防ぐために、フィルターがシリンジにしっかりと接続されていることを確認してください。
   5. NBAを使用して、添加剤の量を含めて最大50 mLの液体をシリンジに充填します。プランジャーを再度取り付けます。
   6. プランジャーを約2 mL/sでゆっくりと押して、液体を標識された遠心分離管にろ過します。
   7. 遠心分離管のキャップを締めます。チューブを3〜5回反転させて培地を混合します。
2. [^U-13C₆]-グルコースを含む完全培地(代謝フラックス分析用):損傷したニューロンにおけるグルコース代謝の代謝フラックス分析には、無糖NBAを使用して[^U-13C₆]-グルコースを含む完全培地を調製します。
   1. 無ブドウ糖NBAをベース溶液として使用し、[^U-13C₆]-グルコースを最終濃度25 mMまで添加してからろ過します([^U-13C₆]-グルコースが固体の場合は、事前に計算して計量します)。セクション5.1で説明されているように、他の成分の追加、ろ過および混合のステップについても同じ順序に従います。

6. 細胞計数

1. 血球計算盤を75%エタノールでよく拭きます。続行する前に、すべての表面が完全に乾いていることを確認してください。
2. 90 μLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)バッファーを1.5 mLの滅菌遠心分離管に加えます。
3. 採取した神経細胞懸濁液を上下に3〜5回ピペッティングして穏やかに再懸濁し、完全に混合します。
4. 10 μLのピペットを使用して、10 μLの混合細胞懸濁液を90 μLのPBS(1:10希釈)を含む遠心分離管に移します。
5. 200 μL ピペットを使用して溶液を 10 回穏やかに混合し、気泡が形成されないようにします。
6. ピペットチップを新しい10 μLチップと交換します。10 μLの混合物を抽出し、血球計算盤のサンプルチャンバーに加えます。
7. 血球計算盤を顕微鏡ステージに置き、20倍対物レンズを使用して焦点を合わせます。中央の 4 × 4 グリッドを見つけ、標準的な血球計算盤のルールに従って 16 マスすべての細胞をカウントします。
8. 16 個の正方形すべてから合計セル数を記録します。次の式を使用して細胞濃度を計算します:(総数×10)×10⁴ 細胞/ mL。
   注意: 常に適切な個人用保護具を備えたバイオセーフティキャビネットで作業してください。

7. 従来型または大規模マイクロ流体デバイスにおける皮質ニューロンの in vitro 培養

1. プロトコルA(従来のマイクロ流体デバイス)。
   1. 35 mm培養皿のガラス表面が完全に乾いていることを確認します。
   2. 滅菌の細い先端鉗子を使用して、オートクレーブ滅菌したマイクロ流体チップをガラス表面の中央に置き、マイクロチャネルを下に向けて配置します。
   3. 200 μLのピペットチップを使用してチップをガラス表面にそっと押し付け、完全に接着します。
   4. 油性マーカーを使用して左側のチャンバーにドット(·)をマークし、体細胞コンパートメントを指定します。
   5. 10 μLピペットを使用して、10 μLのニューロン懸濁液(1,000万細胞/ mL)を吸引します。
   6. マークされたソーマコンパートメントの上のローディングポートにサスペンションをゆっくりと分配します。
   7. 左チャンバーの下部リザーバーへの適切な流体の流れを確認します。
   8. 培養皿を加湿インキュベーター(37°C、5%CO₂)に20分間移します。
   9. 培養皿をインキュベーターから取り出します。
   10. 20×位相差顕微鏡を使用して、マイクロチャネルを介して体細胞コンパートメントから軸索コンパートメントへの培地灌流を確認します。
   11. 150 μLのニューロン基底培地を軸索コンパートメント(右側のチャンバー)の上部ポートに追加し、下部リザーバーへの重力駆動の流れを可能にします。
   12. 同様に、15 μLの完全ニューロン培地を体細胞コンパートメント(左チャンバー)の上部ポートに加えます。
       注:この段階では、ニューロンは目に見えて付着し、ほとんどの細胞破片は下部ウェルに洗い流されます。培養中は培地を交換しないでください。手順5.1.3で説明されているように、完全なニューロン培地を1回添加して使用します。
   13. 150 mmの培養皿に20 mLの超純水を注ぎ、湿度チャンバーを作成します。35 mmの培養皿を大きな皿の中に置きます。
   14. 培養システム全体をインキュベーターに移し、必要な期間(例:7日間)維持します。
       注:すべての細胞培養手順は、バイオセーフティキャビネット内の無菌条件下で実行してください。適切な個人用保護具(白衣と手袋)を着用してください。手順の前後に作業面を除染します。
2. プロトコルB(大規模マイクロ流体チップ)。
   注:従来の仕様の標準プロトコルに従い、2つの変更が加えられました。
   1. デバイスの配置には10cmのペトリ皿を使用します。
   2. 各方法には異なる軸索損傷プロトコルが必要なため、実験のニーズに基づいてフルチャネルまたはインターバルチャネルシーディングのいずれかを選択します。
   3. 播種が完了したら、ニューロンの成長を維持するために、10 cmのペトリ皿に5 mLの完全ニューロン培養培地を加えます。
   4. 150 mmの大きな皿に20 mLの超純水を加えて湿度チャンバーを作成します。そして、10cmの皿を大きな皿の中に入れます。
   5. 手順 7.1.14 と同じです。

8. 従来のマイクロ流体デバイスにおける in vitro 軸索損傷モデルの確立

1. マイクロ流体デバイスの左側を体細胞コンパートメント(「・」マークで示されているように)としてマークし、右側を軸索末端コンパートメントとしてマークします。
2. 皮質ニューロンを体細胞コンパートメントに播種します。
3. 7日目(DIV7)までin vitroで ニューロンを培養し、軸索がマイクロチャネルを通って軸索終末コンパートメントまで伸びるようにします。
4. DIV7 では、軸索末端コンパートメントで軸索損傷手順を実行して、 in vitro 軸索損傷モデルを確立します。
5. 適量のNBA培地を取り、後で使用するために新しい15 mL遠心分離管に移します。
6. 指定された期間、マイクロ流体デバイス内で皮質ニューロンを培養します。次に、デバイスをクリーンベンチに移します。
7. 糸くずの出ない紙を使用して、35 mmの培養皿の底を乾かします。200 μLピペットを使用して、マイクロ流体デバイスの2つの右側の穴から培地を吸引します。
8. 真空ポンプチューブを無菌のフィルターフリーの200 μLピペットチップに接続し、真空ポンプの電源を入れ(吸引速度60 L / min)、軸索末端チャンバーの下部穴とチャンバーの間の接続点にチップを向けて、古い媒体を吸引します(この時点で、軸索は負圧のために壊れます)。
9. 200 μLのピペットチップを交換し、150 μLのNBAを抽出し、右側のチャンバーの下部の穴からゆっくりと加えます。
   注意: 液体の流れが遅すぎて気泡が形成される場合は、先端から液体をすばやく排出してチャンバーをすばやく満たします。
10. 液体添加のために2つの右側の穴を交互に使用します:NBAを追加するたびに、すぐに真空ポンプを使用して、もう一方の穴から液体を吸引し、軸索を切断します。この操作を4回繰り返し、最後の吸引の後、新鮮な完全なニューロン培地と交換します。
11. 細胞体側の穴から古い培地を吸引し、薬物を含む新鮮な完全ニューロン培地を追加します(必要な場合)。
12. マイクロ流体装置を培養皿と一緒に150 mmの培養皿に入れ、指定された時間(例:24時間)培養を続けます。
    注:軸索損傷手術には、ニューロン完全培地が切断効果に影響を与える気泡を生成するため、NBA培地が必要です。

9.大規模なマイクロ流体デバイス軸索損傷

1. 方法1:手動軸索損傷。
   1. マイクロ流体デバイスのすべてのチャンバーにニューロンを播種します。
   2. デバイスを5%CO₂ を含む加湿インキュベーターで37°Cで3日間インキュベートし、マイクロ流体デバイス全体を取り外します。
      注:マイクロチャネルに成長した軸索の機械的ストレスまたは引き裂きを避けるために、DIV7ではなくDIV3でマイクロ流体デバイスを取り外します。これは、実験計画に損傷のない対照群が含まれている場合に特に重要です。
   3. DIV7で、マイクロ流体デバイスを含む培養皿をインキュベーターから取り出し、滅菌ステージに置きます。
   4. 20倍の倍率の顕微鏡を準備し、作業領域を75%エタノールで滅菌します。
   5. 10 μLの滅菌フィルター付きピペットチップを持ち、顕微鏡の誘導下で元のマイクロチャネル内の軸索束を識別します。
   6. ピペットチップを使用して、各軸索束に沿って縦方向のスクラッチを実行します。
   7. 引っ掻いた後の軸索の破損を顕微鏡でリアルタイムに観察します。
      注:生きたニューロンを取り扱うときは、ニトリル手袋を着用し、UV滅菌された実験室環境で作業してください
2. 方法 2: 真空支援軸索損傷。
   1. 大判マイクロ流体デバイスに交互に皮質ニューロンを播種します。
   2. 真空ポンプの電源を入れ、60 L/minに設定します。
   3. 滅菌ピペットチップを使用して、真空ポンプチューブの端を軸索チャンバーポートに接続します。
   4. 従来のマイクロ流体プロトコルを介して真空圧力を加えることにより、軸索の切断を完了します。
   5. (オプション)損傷した軸索を特異的に収集するには、軸索切開後の定義された時点で、真空ポンプ(吸引速度60 L / min)を使用して細胞体コンパートメントの内容物を急速に吸引して細胞体を除去し、それによって軸索のみをマイクロチャネル内に残します。

10. 従来型または大規模マイクロ流体デバイスの低酸素治療

1. マイクロ流体デバイスに初代ニューロンを播種し、常酸素条件下(37°C、5%CO₂)でDIV7まで培養します。
2. マイクロ流体デバイスを低酸素インキュベーターチャンバーに入れ、1%O₂、5%CO₂、およびバランスのとれたN₂からなる混合ガスを供給します。
3. 回転計を使用してガス流量を制御し、25 L/min に設定します。
4. チャンバーを5分間洗い流して空気を置換します。
5. 低酸素チャンバーの入口をクランプしながら、出口減圧弁を閉じます。
6. 低酸素チャンバーの出口チューブをクランプし、最後にガスボンベバルブをしっかりと閉じます。
7. マイクロ流体デバイスを低酸素チャンバー内で3°Cで1時間インキュベートします。

11. オミクス解析のための大規模マイクロ流体デバイスを用いたin vitro 培養ニューロンのサンプル調製

1. トランスクリプトミクス用サンプル。
   1. 軸索損傷が完了してから6時間後に、損傷した軸索を備えたマイクロ流体デバイスを層流フードに移します。
   2. 古い培地を廃棄した後、神経細胞を滅菌PBSで2〜3回洗浄します。
   3. 標準的なRNA抽出キットを使用して、製造元の指示に従ってRNAを単離および精製します。
   4. RNAシーケンシングを実行します。取得したシーケンシングデータに対してフォローアップのバイオインフォマティクス分析を実施します。
2. 代謝フラックス分析用サンプル。
   注:大規模なマイクロ流体デバイスを使用して損傷後のニューロンのグルコース代謝フラックスの変化を監視するために、[^U-13C₆]-グルコーストレース代謝フラックス分析を採用しました²⁴。LC-MS分析用のサンプルを調製するためのプロトコルは次のとおりです。
   1. 実験にはP0 SDラットの子犬を使用します。皮質ニューロンを解剖し、短期(DIV5-DIV7)または長期(DIV15-DIV30)のin vitro で培養します。
   2. 若いニューロン(DIV5-DIV7)と成熟したニューロン(DIV15-DIV30)の両方について、損傷グループと損傷していない対照グループを確立します。
   3. 培地を25 mM [^U-13C₆]-グルコース(グルコースなしのNeurobasal-A、1%FBS、2%B27、25 mM [^U-13C₆]-グルコース)を含む培地に交換し、37°Cで4時間インキュベートします。
      注:培地交換中の浸透圧またはpH変化によって引き起こされるニューロンストレスおよびアポトーシスを回避するために、播種時に25 mM [^U-13C₆]-グルコースを含む培地で培養された追加のニューロンを調製し、この培地を交換に使用します。
   4. 予熱したHBSS(カルシウムとマグネシウムを含む)5 mLで2回穏やかにすすぎた後、サンプルを液体窒素で急速凍結し、-80°Cで保存します。
      注:液体窒素を取り扱うときは、ニトリル手袋と白衣を着用してください。

12. 従来型および大規模マイクロ流体デバイスに基づく神経細胞免疫蛍光染色

注:マイクロ流体デバイスを使用してニューロンをin vitro で培養する場合、生細胞固定のためのこれらのデバイスの分解中に発生する可能性のあるマイクロチャネル内のニューロン軸索への潜在的な損傷を考慮する必要があります。

1. マイクロ廃棄物真空ポンプを使用して、マイクロ流体デバイスの4つのウェルから培地を除去します。
   注:免疫蛍光染色プロセス全体を通して、液体を2つのチャンバーに保持します。吸引パラメータは、神経細胞体や軸索の損傷や吸引を避けるために、高すぎないようにしてください(2.5 L / minが最適です)。
2. マイクロ流体デバイスの2つの上部ウェルのそれぞれに100 μLの1x PBSを追加します(PBSは自然に下部ウェルに流れます)。
3. 真空ポンプの端にあるフィルターレスチップを交換し、下部ウェルからPBSを吸引し、このプロセスを3回繰り返します。最後の反復では、4つのウェルからすべてのPBSを吸引します。
4. 150 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を2つの上部ウェルのそれぞれに加え、室温で10〜15分間固定します。
   注:ニューロンの構造的完全性を維持するために、生細胞固定中のデバイスの分解は避けてください。このアプローチは、ニューロン体細胞と軸索の位置をより明確に区別するのに役立ちます。
5. 1x PBSで3回洗浄し、5%ヤギ血清、0.3 Mグリシン、2%ウシ血清アルブミン(BSA)、PBS、および0.1%(または0.5%)Triton X-100を含むブロッキングバッファーでニューロンを1時間インキュベートします。
6. 一次抗体(βIII-チューブリン、マウス、1:2000など)をブロッキングバッファーで希釈し、左上のウェルに100 μL、右上のウェルに50 μLを加え、ニューロンと4°Cで一晩インキュベートします。
7. 一次抗体を吸引した後、ステップ12.2〜12.3で説明するように、1x PBSで3回洗浄します。次に、ブロッキングバッファーで調製した二次抗体を、ステップ12.6で説明するようにマイクロ流体デバイスの上部ウェルに加え、暗所で30分間インキュベートします(必要に応じてアルミホイルで覆います)。
8. 1x PBSで3回洗浄した後、超純水で1回すすいでください。湾曲したピンセットを慎重に使用して、マイクロ流体セットアップの右上からデバイスをつかみ、取り外します。
9. 1 mLのPBSを培養皿に加え、大きなカバーガラスを皿から分離します。
10. ピペットを使用して15 μLの封入剤を抽出し、カバーガラスの指定された位置にあるカバーガラスに落とします。
11. セル側を封入剤の上にそっと下げ、カバーガラスを置き、余分な液体を取り除きます。
12. 封入剤を室温で完全に乾燥させます。
13. 封入剤が室温で乾燥したら、回転ディスク共焦点顕微鏡を使用してイメージングを行います。
14. 20倍の対物レンズを選択し、露光時間をフレームあたり100〜200ミリ秒に設定し、緑色蛍光タンパク質(GFP)の場合は488 nm、赤色蛍光タンパク質(RFP)の場合は561 nmの励起でレーザー出力を最大値の5〜10%に設定します。

13. 従来のマイクロ流体デバイスにおける生細胞イメージング

1. DIV7までマイクロ流体デバイスで皮質ニューロンを培養します。
2. 製造元の指示に従って生細胞色素(ミトコンドリア膜電位のプローブなど)を調製します。
3. 予熱(37°C)ニューロン維持培地で色素を希釈します。
4. 染料溶液をマイクロ流体デバイスの体細胞コンパートメントにロードします。
5. 37°C、5%CO₂ インキュベーターで30分間インキュベートします。
6. カルシウムとマグネシウムを含む予熱(37°C)HBSS 3 mLでコンパートメントを3回優しく洗浄します。
7. フェノールレッドフリーの生細胞イメージング溶液をマイクロ流体チップに加えます。
8. (オプション)長時間のイメージングには、GlutaMAX(0.25%)とB27(2%)を含めます。
9. マイクロ流体チップを顕微鏡ステージに置き、左側に体細胞チャンバー、右側に軸索末端チャンバーを配置します。
10. 対物レンズに浸漬油を一滴加え、油がチップの下のカバーガラスに接触するようにします。
11. イメージングには、露出150ミリ秒、最大レーザー出力10〜15%の40倍対物レンズを使用します。
    注:これらのパラメータは、色素の光安定性に基づいて調整してください。

14. データ分析

1. ImageJソフトウェアを使用して顕微鏡画像を解析します。バイオアナライザーでRNAの品質を評価します。適切なプラットフォームを使用してRNA-seqを実行し、分析します。
2. メタボロミクス研究では、MRMPROBSプログラム(バージョン2.60)を使用して生の質量分析データを抽出し、同位体の詳細やピーク面積など、同定された代謝物に関する情報を収集します。
3. すべての統計分析にGraphPad Prism(バージョン8.4.3)を使用します。SEM±平均としてデータを提示します。グループ比較には対応のない両側t検定またはマンホイットニー検定を使用し、グループ内の複数の時点間の比較には二元配置分散分析を適用します(有意性:ns、有意ではない、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001)。

結果

皮質ニューロンの代謝調節機構を研究するための包括的な研究プラットフォームを確立するために、まず皮質ニューロンを従来のマイクロ流体デバイスで培養し、マイクロチャネルに沿った軸索の成長を正確に制御しました(図2A)。適切な設計により、マイクロチャネルは高さが低く(5 μm)、幅が広く(10 μm)構築され、各チャネルが細胞体に入ることなくより多くの軸索をホストできるようにしました。βIII-チューブリンの免疫蛍光染色により、マイクロチャネルを介して軸索末端チャンバーへの軸索成長が確認されました(図2B)。軸索損傷が神経細胞の生存に影響を与えるかどうかをさらに判断するために、軸索損傷の前後の神経密度を定量的に分析しました。その結果、軸索損傷後の神経密度に有意差はなく、軸索損傷が顕著な神経死に至らなかったことが示されました(図2C)。マルチオミクス分析のサンプルサイズ要件(通常、サンプルあたり約3×10...

ディスカッション

軸索の損傷と再生を研究するための高度な in vitro モデルの確立は、ニューロンの修復に関与する分子および代謝メカニズムを明らかにするために不可欠です^16,19。この研究では、マイクロ流体デバイス、大規模なニューロン培養、および正確な軸索損傷プロトコルを統合し、損傷した皮質ニューロンの堅牢なマルチオミクス分析を可能にする標準化されたワークフローを提示します。

このアプローチの成功は、いくつかの重要な手順に大きく依存しています。マイクロ流体チップの調製では、PDMSの硬化時間(80°Cで100〜120分)と滅菌時間(5〜10分)を正確に制御して、チップの過硬化とその後の滑りや漏れの問題を防ぐために重要です²⁵。さらに、軸索切開中の真空ポンプの正確なパラメータ設定が不可欠です:過度の吸引はニューロン体細胞を損傷する可能性があり、吸引が...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ニューロベースアル-A培地	ギブコ	10888022	培地
Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス	インビトロゲン	A-21042	免疫蛍光
分析天びん	上海順宇恒平科学機器有限公司	FA1004	試薬/サンプルの正確な計量
B27 (50倍)	ギブコ	17504044	培地
BCAプロテインアッセイ	ボスター	AR1189	タンパク質濃度
バイオアナライザー	アジレント	https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
ウシ血清アルブミン	ジェンビュー	FA016	免疫蛍光
遠心撹拌機ミキサー	考える	ARE-310	PDMSと脱気の混合
CLARIOstarPlus-ACU分析装置	BMGラボテック	クラリオスタープラス	タンパク質濃度
CO2インキュベーター	サーモフィッシャーサイエンティフィック(アッシュビル)LLC	3111	37°Cでの細胞培養インキュベーション;C、5%CO?
耐腐食性ダイヤフラム真空ポンプ	上海地衣 Bangxi Instrument Technology Co., Ltd.	LC-85DLCの	廃液を吸引し、軸索切開術に吸引を提供する
D-グルコース (U-13C6、99%)	ケンブリッジ同位体研究所	CLM-1396	代謝フラックス
DNase I	ロシュ	11284932001	神経細胞培養
Dr.TOM2プラットフォーム	BGIゲノミクス		RNA-seq の実行と分析。
電気熱風乾燥オーブン	BIOM Huahong Bonn / Huaying Bosi	DHG-9070A	PDMSの硬化
電子天びん	上海華潮工業有限公司	HC313	材料の定期的な計量
蛍光マウント水性封入剤	シグマ・アルドリッチ	F4680	免疫蛍光
グルタMAX	ギブコ	35050061	培地
グリシン	ソーラービオ	G8200	免疫蛍光
HBSSの	ギブコ	14025092	神経細胞培養
HBSS、カルシウムなし、マグネシウムなし	ギブコ	14175095	神経細胞培養
高圧蒸気滅菌器	STIK Instrument (Shanghai) Co., Ltd.	HMJ-54A	実験装置および培地の滅菌
低酸素チャンバー	STEMCELLテクノロジー	27310	低酸素治療
イメージJ	NIHの		顕微鏡画像の分析に使用
ライカ顕微鏡	ライカマイクロシステムズCMS GmbH	DMIL LEDフルオ	ライブおよび蛍光観察
ライブセルイメージングソリューション	インビトロゲン	A14291DJ	ライブセルイメージング
医療用低温収納ボックス(-80°C;C)	青島ハイアール生物医学有限公司	DW-86L388J	-80°Cでの長期サンプル保存。C
ミニ卓上真空ポンプ	海門麒麟ベル機器製造有限公司	GL-805	小規模真空アプリケーション
MitoTracker オレンジ CMTMRos	インビトロゲン	M7510	ミトコンドリア膜電位染色
MRMPROBSプログラム		バージョン 2.60	生の質量分析データを抽出するには
神経基礎培地	ギブコ	21103049	培地
グルコースを含まないニューロベースA。	ギブコ	A2477501	培地
パパイン	ワージントン	LS003127	神経細胞培養
パラホルムアルデヒド	シグマ・アルドリッチ	P6148	細胞固定
PDMSの	ダウコーニング	DC184	デバイス製造
PDSキット阻害バイアル	ワージントン	LK003182	神経細胞培養
ペニシリンストレプトマイシン	ギブコ	15140122	培地
リン酸緩衝生理食塩水	バイオシャープ	BL302A型	物質を希釈し、細胞容器を洗浄します
プラズマクリーナー	ハリックプラズマ	ODC-32G-2	アクティベーション
ポリ-D-リジン	シグマ・アルドリッチ	P6407	神経細胞培養
プリズム	グラフパッド	バージョン 8.4.3	統計分析
冷蔵遠心分離機	Eppendorf AG (ドイツ)	5430R型	制御された温度でのサンプル分離
RNArep Pure Cell/Bacterial Total RNA Extraction Kit	天根	DP430	トランスクリプトミクス
回転計	ドワイヤー	RMA-23-SSV	低酸素流量を制御
実体顕微鏡	オリンパス株式会社	SZ2-ILST	サンプルの観察と解剖
スチュアートオービタルシェーカー	キリンベル	TS-200型	調整可能な速度での細胞培養/溶液の混合
トリトンX-100	シグマ・アルドリッチ	100倍	免疫蛍光
アルバックロータリーベーン真空ポンプ	アルバック(寧波)有限公司	GLD-N202	ろ過/乾燥のための真空を作り出す
&ベータ;III-チューブリン	プロメガ	G7121	免疫蛍光