クローン病様回腸炎および線維症のSHIP欠損マウスモデルにおける治療的介入の評価

Wei Jen Ma; Kwestan Safari; Bing Cai; Chloé Bender Thorsen; Yvonne Pang; Susan C. Menzies; Sara Ehling; Laura M. Sly

doi:10.3791/68928

方法論記事

クローン病様回腸炎および線維症のSHIP欠損マウスモデルにおける治療的介入の評価

DOI：

10.3791/68928

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2025年10月14日

Wei Jen Ma^*¹ , Kwestan Safari^*¹ , Bing Cai¹ , Chloé Bender Thorsen¹ , Yvonne Pang¹ , Susan C. Menzies¹ , Sara Ehling¹ , Laura M. Sly¹

¹Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, University of British Columbia and BC Children's Hospital Research Institute

^* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、クローン病(CD)様回腸炎症および線維症のSrc相同性2ドメイン含有5'-イノシトールホスファターゼ(SHIP)欠損マウスモデルを使用して、CDの新規治療法を試験する方法を示します。

要約

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クローン病 (CD) は、消化管のあらゆる部分に影響を与える可能性のある分節性経壁性炎症を特徴とする慢性の再発性炎症状態です。CD の特徴は腸のバリア機能の障害であり、腸線維症は一般的な合併症です。SHIP欠損(SHIP-/-)マウスは、腸バリア機能障害、回腸炎症、および線維性病理を自発的に発症し、CD様回腸炎の主な特徴を要約しています。SHIP-/- マウスは、CD における抗炎症療法および抗線維化療法をテストするための貴重なモデルとして機能します。

ここでは、効果的な治療法の例としてデキサメタゾンを使用して、このモデルにおける治療介入を評価する方法について説明します。FITC-デキストランによって測定された腸透過性の in vivo 評価、肉眼的病理学的検査、詳細な組織学的分析など、疾患と治療反応を特徴付けるための段階的なプロトコルを提供します。組織学的評価には、炎症に対するヘマトキシリンとエオシン (H&E) 染色、線維症に対するマッソントリクロ染色、杯細胞過形成と肥大に対するアルシアンブルー/ヨヨウ酸シッフ (PAS) 染色が含まれます。さらに、回腸組織のサイトカインと炎症マーカーを定量化して、炎症状態を評価します。これらの方法を組み合わせることで、CD 様回腸炎の SHIP-/- マウスモデルにおける治療効果を評価するための包括的なフレームワークが提供されます。このプロトコルは、腸の炎症、粘膜治癒、および腸線維症を研究する研究者に広く適用できます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

炎症性腸疾患 (IBD) の 2 つの主なタイプは、クローン病 (CD) と潰瘍性大腸炎 (UC) であり、どちらも再発寛解または進行性の経過をたどる可能性のある慢性胃腸 (GI) 炎症を特徴とします¹。IBDは歴史的に西洋化諸国の病気と考えられてきましたが、南米、アジア、アフリカの発展途上国ではその発生率が急速に増加^{しています2。}同時に、北米、ヨーロッパ、オーストラリアでは有病率が上昇し続けており、1990 年から 2019 年の間に発生率と有病率の両方がほぼ 50% 増加したと報告されており、IBD の世界的な健康負担の増大を浮き彫りにしています ^2,3。多大な研究努力にもかかわらず、IBD の根本的な原因は不明のままです。現在の証拠は、遺伝的感受性、免疫系の機能不全、およびマイクロ^{バイオーム}の変化を含む環境トリガーとの間の複雑な相互作用を示唆しています^4,5。

CD と UC には重要な違いがあります。UC では、炎症は結腸に限定され、粘膜層 ^6,7 に限定された継続的な関与を特徴とします。対照的に、CD は、消化管のあらゆる部分、最も一般的には回腸末端 ^6,7 に影響を与える可能性のある不連続で経壁的な炎症を特徴とします。CD の特徴的な合併症は腸線維症であり、これは狭窄や腸閉塞の形成に寄与します⁸。線維症は、コラーゲンなどの細胞外マトリックス成分の過剰な沈着、および腸の筋肉層の肥厚によって定義されます^9,10。CD 患者の約 30% が、診断から 10 年以内に狭窄性疾患を発症します¹¹。現在、線維症を直接標的とする治療法はありませんが、この合併症を研究するために適切な前臨床モデルを使用して対処できる満たされていない臨床ニーズです ^9,12。

IBD の病因をよりよく理解し、新しい治療法の開発を促進するために、多数のマウスモデルが確立されています¹²。多数の大腸炎モデルが存在しますが、回腸炎症とCD関連線維症を再現しているのはごくわずかです¹²。これらの中には、本明細書に記載されたSrc相同性2ドメイン含有5'-イノシトールホスファターゼ欠損症(SHIP-/-)、ならびにSAMP1/YitFcマウスおよびTnf^Δareマウスがある。これらのモデルは、それぞれが異なる細胞および分子メカニズムによって駆動されるため、ヒトCDの複雑さを総合的に反映しています。SAMP1/YitFcマウスの疾患は、上皮バリア機能と免疫調節に影響を与える多遺伝子素因に起因しますが^13,14、Tnf^ΔAREマウスはTNF mRNAにAUに富む要素の欠失を運び、mRNAの安定性とTNF過剰産生の増加につながります^15,16。これらのモデルには価値がありますが、制限があります。SAMP1 / YitFcモデルは育種効率が低いため、研究に十分なコホートサイズを生成することが課題となります¹⁷。さらに、Tnf^ΔAREモデルは、顕著な線維性病理を発症するのに最大24週間を必要とするため、介入研究を行うのに費用がかかり、困難になります¹⁶。

SHIP は、ホスファチジルイノシトール-3-キナーゼ (PI3K) シグナル伝達経路の負の調節因子であり、主に造血細胞で発現します。これは、ホスファチジルイノシトール3,4,5-トリスリン酸から5'リン酸基を除去することによって機能し、それによって下流のPI3Kシグナル伝達を減衰させます¹⁸。SHIP-/-マウスは、前臨床研究にいくつかの利点を提供します。これらのマウスは比較的繁殖が容易で、^8歳19週という早い時期に線維症の兆候を示します。このモデルにおける線維化リモデリングの加速は、調節不全の PI3K 経路による炎症反応の高まりによって引き起こされる可能性が高く、免疫細胞の過剰活性化とその後の急速な組織リモデリングにつながります。最も重要なことは、私たちとKerrのグループは、SHIP-/-マウスがヒトCDによく似た特徴を持つ回腸炎を発症することを独自に示したことです^19,20。このモデルの関連性を裏付けるために、CD 患者のサブセットは、回腸生検と PBMC の両方で SHIP 活性を低下させています²¹。さらに、SHIP 活性が低い人は、より重篤な疾患経過を経験する傾向があり、多くの場合、複数回の手術が必要になります²²。

SHIP-/- マウスは、生後 4 週齢で回腸遠位部に局在する自発的で不連続な腸の炎症を発症し始め、²⁰ 歳の 6 週までにすべてのマウスに炎症が存在します。生後8週齢までに、マウスは、外筋層の肥厚と粘膜下および筋肉層間の広範なコラーゲンの蓄積を特徴とする線維性病理を確立しました¹⁹。このモデルにおける炎症は、マクロファージ由来のインターロイキン-1β(IL-1β)²¹によって引き起こされます。クロドロネート含有リポソームを使用したマクロファージの枯渇と、IL-1受容体アンタゴニスト(アナキンラ)によるIL-1シグナル伝達の薬理学的遮断の両方が、SHIP-/-マウスの腸の炎症を改善しました²¹。回腸炎に加えて、SHIP-/-マウスは肺の炎症を示し、局所的な腸送達のために設計された治療法のオフターゲット効果を評価するために使用しました²³。他の人は、Z-IETD-FMKによるカスパーゼ-8阻害がSHIP-/-マウスの回腸と肺の両方の炎症を有意に減少させることを報告しています²⁴、全身の炎症制御を評価するための追加機能として肺の病理学をさらに裏付けています。

この方法論論文では、デキサメタゾン²³による治療の成功に関する最近発表された研究を再検討し、薬理学的試験でマウスモデルを使用するための追加の考慮事項とともに、主要な技術手順の詳細な説明を提供します。具体的には、腸透過性、肉眼的病理学、組織病理学、炎症誘発性メディエーターおよびエフェクターの評価など、IBDモデルにおける薬効を評価するための標準パラメータに焦点を当て、これらのデータを統合して全体的な治療効果に関する結論を出す方法について説明します。

プロトコル

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動物を対象とした研究は、施設動物管理および使用委員会によって承認された倫理プロトコルに準拠し、国家研究評議会の動物管理に関するガイドラインに従って実施する必要があります。このプロトコルのすべての動物手順は、カナダ動物ケア評議会の倫理ガイドラインに従い、ブリティッシュコロンビア大学動物ケア委員会(プロトコルA21-0212)によって承認されました。

注:SHIP-/-マウスの腸の病理に対する薬物の治療効果を評価するために、比較のための健康な対照としてSHIP+/+を含めます。治療的介入については、病気がモデルで完全に確立された生後6週齢で治療を開始します。ここで、SHIP+/+およびSHIP-/-マウスの両方に、0.5%β-シクロデキストリン(ビヒクル)またはビヒクル単独で3mg / kgのデキサメタゾンを10μL / gの容量で2週間毎日経口強制経口投与されました。

1. 上皮バリア透過性を測定するためのFITC-デキストランアッセイ

アッセイの4時間前にマウスを高速で投与します。
4 kDaのFITC-デキストランを滅菌1x PBSに溶解し、最終濃度は80 mg/mLにします。
マウスあたり150 μLに十分な量を準備し、標準曲線用に50 μLを追加で準備します。
注:手順全体を通して、FITC-デキストラン溶液と血漿サンプルの光への曝露を最小限に抑えます。
各マウスを穏やかに拘束(首筋)し、経口強制経口経口 を介して 150 μLのFITC-デキストラン溶液を投与します。
注:最初の強制経口を投与した直後にタイマーを開始します。後続の各マウスの間で10〜15分待って、安楽死と下流の手順が時差で実行されるのに十分な時間を確保し、タイミングの違いによるばらつきを最小限に抑えます。
マウスを食物なしで4時間維持します。
5% イソフルラン (1.5 L 酸素/分で送達される吸入麻酔薬) を使用してマウスを安楽死させ、続いて標準的な施設手順に従って二酸化炭素を投与します。25 G 針と 1 mL 注射器で心臓穿刺 によって 血液を採取します。
抗凝固剤として、採取した血液100 μLごとに10 μLの酸-クエン酸-デキストロース溶液を直ちに加えます。反転でよく混ぜます。
1500 x g で4°Cで10分間遠心分離し、血漿(上清)を標識した1.7 mL微量遠心チューブに慎重に移します。分析までサンプルを氷の上に置き、光から保護してください。
各血漿サンプルを1x PBSで1:2および1:10に希釈します。
各希釈液100 μLを不透明な96ウェルプレートに2回ずつ加えます。
1x PBSを使用して元の80 mg/mLのFITC-デキストランストックを1:2で連続希釈し、3000、1500、750、375、187.5、93.8、46.9、23.4、および0 ng/mLの濃度を達成します。各濃度100 μLを96ウェルプレートに2回ずつ加えます。
マイクロプレートリーダーを使用して、485 nmの励起と535 nmの発光で蛍光を測定します。

2.肉眼的病理評価

FITC-デキストランアッセイのための採血後、小腸全体を慎重に切除します。
付着した脂肪や結合組織をそっと取り除きます。
注: 病部は壊れやすく、裂けやすいため、組織の取り扱いには注意してください。
最適なコントラストを得るために、白紙の白い紙の上に腸を平らに置きます。病気の肉眼的な兆候がないか組織を目視で検査します。炎症は通常、SHIP-/-マウスの小腸の遠位10 cmに局在します。
注:評価する主な肉眼的特徴には、色の変化が含まれ、隣接する正常に見える組織と比較して目に見える発赤または充血を示す領域があります。さらに、穏やかな触診で患部が腫れたり、浮腫したり、硬くなったりする可能性があるため、組織の肥厚がないか調べてください。目に見える出血性斑点、暗赤色の変色、または付着した血液として現れる可能性のある血液の存在を探します。
腸を定規の隣に合わせてスケールを合わせ、写真を撮って肉眼的な病理学的所見を記録します。

3.組織学的評価

シリンジを使用して 1x PBS で内腔を優しく洗い流し、腸内容物を取り除きます。絨毛や陰窩の構造が歪む可能性があるため、組織に力を加えすぎないでください。
肉眼的病状を最も代表する回腸遠位部の約1cmを特定して採取します。表示されている影響を受ける領域がある場合は、含めます。比較(SHIP+/+対SHIP-/-)の場合は、一致する解剖学的位置から組織が収集されていることを確認してください。
注:治療効果の初期評価のために、回腸をスイスロールとして準備することをお勧めします。この方法は、疾患をグローバルに視覚化し、サンプリングバイアスを低減します。
組織を組織学カセットに平らに置き、折り畳まれないようにスポンジの間に置きます。
ヘマトキシリン&エオシン(H&E)およびマッソンのトリクロム染色では、組織を10%中性緩衝ホルマリンに4°Cで一晩固定し、少なくとも10〜20倍の組織体積(カセットあたり約5 mL)を使用し、すべてのカセットが完全に水没するようにします。カセットを70%エタノールに移して保管し、処理まで完全に水没させたままにします。
注:3.7%ホルムアルデヒドを含む固定剤である10%ホルマリンは、強力な呼吸器刺激物であり、皮膚感作性物質であり、ヒト発がん物質として分類されます。吸入、摂取、または皮膚接触は急性毒性を引き起こす可能性があり、慢性曝露はがんのリスクを高める可能性があります。ホルマリンを含むすべての手順は、白衣、耐薬品性手袋、目の保護具などの適切な個人用保護具 (PPE) を着用しながら、認定された化学ヒュームフード内で実行する必要があります。廃棄物は「ホルマリン廃棄物」と明確にラベル付けされた容器に収集し、施設の有害廃棄物プロトコルに従って適切に処理します。ホルマリンで汚染されたすべての材料(ピペットチップ、ティッシュ、手袋など)は、化学的に有害な廃棄物として処理され、地域の環境衛生と安全(EHS)手順に従って廃棄する必要があります。
アルシアンブルー/PAS染色の場合、組織をカルノイ溶液(60%エタノール、30%クロロホルム、および10%氷酢酸)に4°Cで一晩固定し、カセットあたり約5 mLまたは組織体積の10〜20倍を使用します。カセットを100%エタノールに移し、処理まで保管します。
注:カルノイの溶液は、60%のエタノール、30%のクロロホルム、および10%の氷酢酸で構成されています。この混合物は揮発性が高く、可燃性があり、有毒です。Carnoyの溶液はヒュームフードでのみ取り扱い、熱源や発火源から離れた密閉容器に保管してください。Carnoy の廃棄物は、混合有機溶剤用の指定された容器に収集し、施設の有害廃棄物ガイドラインに従って廃棄する必要があります。カルノイの溶液で汚染されたすべての材料は、化学的に有害な廃棄物として処理する必要があります。
パラフィンに組織を埋め込み、染色のために5μmの切片を切断します。
表 1 の基準に従って、H&E 染色回腸切片を 16 段階評価でスコアリングします。最終的な組織学的損傷スコアは、実験条件を知らされていない 2 人のレビューアのスコアを平均することによって決定されます。
表2の基準に基づいて6段階評価を使用して、マッソンのトリクロ染色断面を評価します。最終的な線維症スコアは、実験条件を知らされていない 2 人の独立したレビュー担当者によって割り当てられたスコアの中央値として計算されます。

4. サイトカイン評価

組織学サンプルの解剖と除去に続いて、回腸の遠位 10 cm の残りの部分を収集します。
ティッシュを吸い取って乾かし、体重を記録します。液体窒素で急速凍結し、将来の処理のために-80°Cで保存します。
処理の準備ができたら、組織を取り出し、常に氷の上に保管してください。
組織サンプルの重量を量ります。プロテアーゼ阻害剤を1x PBS(アプロチニンとロイペプチン、それぞれ10 μg/mL)に添加することにより、すべてのサンプルに十分な均質化バッファーを調製します。組織1mgあたり10 μLのバッファーを使用します(たとえば、100 mgの組織には1 mLのバッファーが必要です)。
注:均質化バッファーは、プロテアーゼ阻害剤が有効であることを保証するために、均質化の日に新鮮に調製する必要があります。
卓上ホモジナイザーを使用して、氷冷ホモジナイザーで全層回腸組織を均質化します。ホモジネートが均一で、目に見える組織断片がないことを確認してください。相互汚染を防ぐために、サンプル間でホモジナイザーチップをPBSで完全にすすぎます。
組織ホモジネートを10,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
凍結融解サイクルを避けるために清澄化した上清を分注し、将来の分析のために-80°Cで保存します。
メーカーの指示に従って、清澄化した上清に対して酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を実行し、目的のサイトカインを定量します。
注:450 nmでの光学密度は、Skanlt RE 7.0.2ソフトウェアを搭載したVarioskan LUXマイクロプレートリーダーを使用して測定され、補正用の基準波長は570 nmでした。データ分析にはMicrosoft Excelを使用し、標準曲線の線形範囲内の吸光度値を補間してサイトカイン濃度を決定しました。

結果

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6週齢のSHIP+/+およびSHIP-/-マウスを、0.5%β-シクロデキストリン(ビヒクルコントロール、n = 6/遺伝子型)または3 mg/kgのデキサメタゾン(n = 6/遺伝子型)を毎日2週間経口強制投与しました。治療のタイミングと期間はモデルに依存し、疾患の発症と進行速度、および介入が予防的か治療的かを考慮する必要があります。実験では、同数のオスとメスのマウスを使用する必要があります。SHIP-/-マウスの疾患の自然史における性差は特定されていないが、異なる治療プロトコルは性特異的な反応を示す可能性がある。このモデルでは、生後4〜6週からの予防的治療を使用して炎症や線維症の発症を防ぐことができますが、生後6〜8週、8〜10週、または6〜10週齢から行われる治療レジメンを使用して、確立された疾患の治療効果を評価することができます。最適な投与とタイミングは、文献と滴定研究によって導かれる必要があります。私たちは以前に、このデキサメタゾンの投与計画は、回腸の炎症が発症した後に投与した場合に効果的であることを示しました。

収穫日の推奨タイムラインを 図1Aに示します。デキサメタゾンは、肉眼的検査に基づいて、SHIP+/+マウスに腸の病理を誘発しませんでした。SHIP-/-マウスは、炎症を示す発赤と肥厚の目に見える領域を示しました。これらの肉眼的病理学的特徴は、デキサメタゾンで治療されたSHIP-/-マウスには存在しませんでした(図1B)。腸のバリア機能を評価するために、経口強制経口投与後に FITC-デキストランの血漿濃度を測定しました。統計的に有意ではありませんが、SHIP-/-マウスはSHIP+/+対照と比較して血漿FITC-デキストラン濃度が上昇しており、腸透過性の増加を示唆しています。デキサメタゾン治療は、SHIP-/-マウスにおけるFITC-デキストラン濃度をSHIP+/+マウスで観察された濃度と同様の濃度に低下させた(図1C)。

SHIP-/-マウスの腸断面の組織学的検査により、免疫細胞浸潤、絨毛陰窩構造の破壊、杯細胞過形成/肥大、筋層の肥厚などの特徴的な病理学的特徴が明らかになりました(図2A)。これらの特性は、SHIP + / +マウスと比較して有意に高い組織学的損傷スコアに反映されました(p = 0.0005、 図2B)。デキサメタゾンで治療されたSHIP+/+マウスでは組織学的損傷は観察されませんでした。肉眼的病理学およびバリア機能に見られる改善と一致して、デキサメタゾンはSHIP-/-マウスの組織病理学を減少させましたが、その効果は統計的に有意ではありませんでした(p = 0.0981、 図2A および 図2B)。マッソンのトリクロ染色により、SHIP-/-腸組織に実質的なコラーゲン沈着が明らかになり、SHIP+/+対照と比較して有意に高い線維症スコアが伴いました(図2C)。デキサメタゾンはSHIP-/-マウスの線維化特徴を効果的に弱め、線維症スコアをSHIP+/+対照のスコアに匹敵する値まで低下させました(図2C)。さらに、アルシアンブルー/PAS染色により、SHIP-/-マウスの杯細胞過形成/肥大が確認され、デキサメタゾンによる治療により減少しました(図2D)。

炎症性サイトカイン濃度を評価するために、全層回腸組織ホモジネートに対してELISAを実施しました(図3A)。IL-1β濃度は、SHIP+/+対照と比較してSHIP-/-マウスで有意に高かった(p = 0.0468)、これは、このモデルにおけるIL-1β発現と疾患の重症度を相関させる以前の調査結果と一致しています。デキサメタゾン治療は、SHIP-/-マウスのIL-1β濃度を有意に低下させました(p = 0.0023)。以前の報告と一致して、IL-6またはTNF濃度は4つの実験グループ間で差はありませんでした。また、炎症の追加の生化学的マーカーとして、全層回腸ホモジネート中の好中球関連タンパク質ミエロペルオキシダーゼ(MPO)およびリポカリン-2(LCN-2)の濃度も測定しました(図3B)。MPOとLCN-2の両方の濃度は、SHIP+/+対照と比較してSHIP-/-マウスで有意に高かった(それぞれp = 0.0031およびp = 0.0002)が、LCN-2の増加は主に6匹のマウスのうち2匹で測定された高濃度によって引き起こされた。デキサメタゾンによる治療では、MPO が減少し、LCN-2 が適度に減少しましたが、差は有意ではありませんでした。これらのデータは、MPOがSHIP-/-マウスにおける炎症の有用なマーカーであるのに対し、LCN-2濃度はそれほど一貫性または信頼性がないことを示唆しています。

SHIP-/-マウスモデルにおける炎症と線維化の特徴の関係を調べるために、全層回腸組織からの組織学的損傷スコア、線維症スコア、およびIL-1β濃度を使用してスピアマン相関分析を実施しました(図4)。IL-1β濃度は組織学的損傷スコア(r = 0.6813)と正の相関があり、炎症の増加が組織損傷の増加と関連していることを示しています(図4A)。IL-1β濃度と線維症スコア(r = 0.4117)の間にも中程度の相関関係が観察され、炎症性サイトカイン産生と線維化リモデリングとの関連性が示唆されました(図4B)。さらに、組織学的損傷スコアは線維症スコア(r = 0.6241)と有意に相関しており、SHIP-/-マウスでは構造的損傷と線維化が並行して進行することを示唆しています(図4C)。

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図1:デキサメタゾンは、SHIP-/-マウスの肉眼的腸の病状と透過性を低下させます。 SHIP+/+およびSHIP-/-マウスを、ビヒクルコントロール(VC)として0.5%β-シクロデキストリンまたはデキサメタゾン(Dex;3 mg / kg)のいずれかで毎日経口強制投与しました。(A) 推奨される実験スケジュール。(B)盲腸および回腸遠位部の肉眼的形態を評価し、代表的な画像を示します(グループあたりn = 4〜6マウス)。アスタリスクは、肉眼的検査で観察された斑状の発赤と肥厚の領域を示します。画像は全体的な病理の代表的な例として機能することを意図しており、定量分析を目的としたものではありません。(C)腸管透過性を評価するために、マウスを4時間絶食し、80 mg / mLのFITC-デキストランで強制経口投与しました。さらに 4 時間の絶食後、心臓穿刺 によって 血液を採取し、血漿 FITC-デキストラン濃度を測定しました。データは平均±SDとして表示されます。灰色のバーは、強制経口投与の4時間後に健康なC57BL / 6マウスで通常観察される血漿FITC-デキストラン濃度の範囲を表します²⁵。統計的有意性は、Kruskal-Wallis 検定とそれに続く Dunn の多重比較検定を使用して決定されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:デキサメタゾンは、SHIP-/-マウスの回腸遠位部における組織学的損傷スコア、コラーゲン、筋肉の厚さ、杯細胞の過形成および肥大を減少させます。 SHIP+/+およびSHIP-/-マウスを、ビヒクルコントロール(VC)として0.5%β-シクロデキストリンまたはデキサメタゾン(Dex;3 mg / kg)のいずれかで毎日経口強制投与しました。(A)マウスのH&E染色回腸断面を10倍倍で撮影した。スケールバー= 200μm。(B)IQR中央値として表されるSHIP + / +およびSHIP-/-マウスの組織学的損傷スコア±。(C)固定回腸断面は、線維症のためにマッソンの三色で染色されました。コラーゲンは青く染まっています。画像は10倍の倍率で撮影されました。スケールバー = 200 μm。SHIP+/+およびSHIP-/-マウスの線維症スコアは、IQRの中央値として表±。(D)固定回腸断面をアルシアンブルー/ PASで染色しました。画像は10×倍率で撮影されました。スケールバー = 200 μm。すべてのセクションは、グループごとにn = 6匹のマウスを代表しています(SHIP + / + DexおよびSHIP-/- Dex、n = 5を除く)。組織学的損傷スコアの統計的有意性は、クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダンの多重比較検定を使用して決定されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:デキサメタゾンは、SHIP-/-マウスの全層回腸ホモジネート中のIL-1β濃度を低下させます。 SHIP+/+およびSHIP-/-マウスを、ビヒクルコントロール(VC)として0.5%β-シクロデキストリンまたはデキサメタゾン(Dex;3 mg / kg)のいずれかで毎日経口強制投与しました。(A) IL-1β、TNF、および IL-6 濃度は、全層回腸ホモジネートで測定されました。(B)ミエロペルオキシダーゼ(MPO)およびリポカリン-2(LCN-2)濃度を全層回腸組織ホモジネートで測定しました。データは平均± SD として表示されます。統計分析は、Kruskal-Wallis 検定とそれに続く Dunn の多重比較検定を使用して実施されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:IL-1β濃度は、SHIP-/-マウスの組織学的損傷および線維症と正の相関があり、線維症は組織学的損傷スコアと相関しています。 SHIP-/-マウスの全層回腸組織における組織学的損傷スコア、線維症スコア、およびIL-1β濃度の関係を評価するために、スピアマン相関分析を実施しました。(A)組織学的損傷スコアとIL-1β濃度(r = 0.6813)、(B)線維症スコアとIL-1β濃度(r = 0.4117)、および(C)組織学的損傷スコアと線維症スコア(r = 0.6241)の間に有意な正の相関が観察されました。各データポイントは、個々のマウスを表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

損傷コンポーネント	スコア
クリプトアーキテクチャの喪失	0 = なし
	1 = <25%の損失
	2 = 25-50%の損失
	3 = 50-75%の損失
	4 = >75%の損失
免疫細胞浸潤	0 = なし
	1 = 固有層の時折の免疫細胞
	2 = 固有層の免疫細胞の増加
	3 = 固有層のコンフルエント免疫細胞と粘膜の破壊
	4 = セクション全体の免疫細胞浸潤
杯細胞過形成および肥大	0 = なし
	1 = ゴブレットセルの数とサイズが<50%増加
	2 = ゴブレットセルの数とサイズが>50%増加
潰瘍	0 = なし
	1 = 中間潰瘍
	2 = 実質的な潰瘍
浮腫	0 = なし
	1 = セクションの <50%
	2 = セクションの>50%
筋肉の肥厚	0 = なし
	1 = 中間増粘
	2 = 大幅な肥厚

表1:組織学的損傷スコア。H&Eで染色したSHIP+/+およびSHIP-/-マウスの回腸断面の組織学的損傷は、構造の喪失(0-4)、免疫細胞浸潤(0-4)、杯細胞過形成および肥大(0-2)、潰瘍(0-2)、浮腫(0-2)、および筋肉肥厚(0-2)など、SHIP-/-マウスモデルを特徴付ける回腸炎の主要な特徴に基づいて採点されます。

線維症成分	スコア
過剰なコラーゲン	0 = 通常のアーキテクチャ。過剰なコラーゲンなし
	1 = コラーゲンの軽度の増加。粘膜下または漿膜下に限定される
	2 = 粘膜下層および固有筋層部分への中程度のコラーゲン拡張、乱雑な束
	3 = 粘膜下層と筋層を含む、正常な構造に取って代わる広範で緻密なコラーゲン (経壁)
粘膜下層の線維筋過形成/筋肉化/筋肉閉塞	0 = なし、正常な筋肉粘膜下層の含有量
	1 = 筋肉量の軽度の増加
	2 = 粘膜下層に大量の筋肉があり、形態に影響を与えるが、正常な構造
	3=筋肉が粘膜下腔全体を消し去った

表2:線維症スコアリング。 マッソン三色で染色されたSHIP+/+およびSHIP-/-マウスの回腸断面の線維症は、過剰なコラーゲン沈着(0-3)および粘膜下層の線維筋過形成または筋肉の閉塞(0-3)など、SHIP-/-モデルで観察された腸線維症の主要な特徴に基づいてスコアリングされました。コラーゲンは程度と構造の破壊について評価され、筋肉の変化は筋肉の浸潤の程度と粘膜下構造の歪みに基づいて評価されます。

ディスカッション

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このプロトコルは、線維性病理を伴うCD様腸の炎症のマウスモデルであるSHIP-/-マウスにおける回腸炎および腸線維症を評価するための手順を概説します。SHIP-/-マウスモデルは、腸の炎症の他のマウスモデルでは一般的に見られないCDの特徴、特に回腸局在、斑状および経壁性炎症、および線維性病理を要約しています^19,26。繁殖の容易さと病気の発現までの短い時間と相まって、SHIP-/-モデルは、^CD19のトランスレーショナルリサーチのための強力なツールとして有利に位置付けられています。

この研究では、FITC-デキストランアッセイと組織学的スコアリングの統計的有意性は、これらのデータセットが一元配置分散分析に必要な正規性の仮定を満たさず、組織学的スコアが不連続なノンパラメトリック変数を表すため、クラスカル・ウォリス検定を使用して評価されました。私たちの分析では、デキサメタゾン治療群とビヒクル治療群の間で統計的に有意な差は得られませんでしたが、明確な傾向が観察されました。デキサメタゾンは、SHIP-/-マウスの腸透過性と組織病理学を低下させ、これらの効果はサンプルサイズが大きいほど有意に達した可能性があります。

このプロトコルを実行する際には、いくつかの技術的な課題が発生する可能性があります。組織の取り扱いに関しては、SHIP-/-回腸は裂けやすいため、解剖中に穏やかな操作が必要です。これは、肉眼的イメージング用に組織を準備する場合に特に重要です。組織固定も組織学的分析の重要な要素です。ホルマリン固定組織は、H&Eとマッソンのトリクロム染色の両方に適していますが、アルシアンブルー/PAS染色とは互換性がありません。対照的に、カルノイ固定組織はH&Eおよびアルシアンブルー/ PAS染色には適していますが、マッソンのトリクロムには適していません。カルノイの固定は、濃いびまん性の濃い青色の染色につながり、コラーゲンと筋肉層の視覚化を不明瞭にします。サイトカイン分析では、サイトカインは分解に非常に敏感であるため、氷上でサンプルを処理することが不可欠です。処理後すぐに、清澄化された組織ホモジネートを分注することが重要です。凍結融解サイクルを繰り返すと、サイトカインの完全性が大幅に損なわれ、遺伝子型および/または治療群間の潜在的な違いが損なわれる可能性があります。最後に、正確な定量を確実にするために、各サンプルを複数回希釈して、測定値がアッセイの標準曲線の線形範囲内にあることを確認し、複雑な組織マトリックスからの潜在的な干渉を最小限に抑えることをお勧めします。これらの技術的考慮事項に対処することは、再現性と解釈可能な結果を生成するために不可欠ですが、SHIP-/-マウスに固有の生物学的多様性も慎重に管理する必要があります。

SHIP-/-マウスには、再現性を確保し、交絡変数を最小限に抑えるために考慮し、慎重に制御する必要があるいくつかの重要な側面があります。腸内細菌叢は、マウス IBD モデルにおける疾患の発症と治療反応に大きな影響を与えます^27,28。私たちの以前の研究では、SHIP-/- マウスの腸の炎症は微生物叢に依存しており、抗生物質で改善できることが示されています²⁹。したがって、同腹仔の対照は、マイクロバイオームによる変動を減らすために使用する必要があり、治療グループはケージ起源³⁰のバランスをとる必要があります。また、慎重な性別のマッチングも必須です。SHIP-/-マウスでは浸透度や疾患の重症度の性差は観察されていませんが、SAMP1/YitFcなどの他の回腸炎モデルは、女性で発症が早く、疾患の重症度が増加しています^14,31。性ホルモンは微生物組成も調節できるため³²、治療研究における潜在的な交絡因子を最小限に抑えるためには、性別のマッチングが重要です。さらに、評価されている個々の治療法は、雄マウスと雌マウスで有効性に差がある可能性があります。現在の調査結果では、疾患やデキサメタゾンに対する治療反応における性差は明らかにされていませんが、すべての治療研究で性マッチングを実施する必要があります。

上記のマイクロバイオームと性別の考慮事項に加えて、腸の炎症がない場合のビヒクルと治療薬の効果を評価するために、治療研究にSHIP+/+マウスを含めることが重要です。これにより、薬物もその送達方法も健康な腸の病状を引き起こしたり、寄与したりしないことが保証され、それによって治療効果と安全性の解釈が向上します。

^19,26 歳⁴、8、および 12 週齢のマウスでは炎症と線維症の両方に有意差があるため、治療介入のタイミングも不可欠であり、実験目標に従って変更する必要があります。SHIP-/- マウスは生後 4 週齢で腸の炎症を発症し、すべてのマウスは生後 6 週齢までに炎症を呈し、線維化病理のマーカーは早ければ生後 6 週齢で測定でき、生後 8 週齢までに十分に確立されます^19,26。したがって、回腸炎症を標的とする治療は生後6週齢から開始する必要があります。抗線維化介入は、6週間で予防的に開始するか、8〜10週間の間に治療的に開始することができます。ただし、病気の発症や重症度は微生物環境によって異なる場合があり、施設によって異なります。研究者は、治療プロトコルを実施する前に、まずコロニー内の疾患動態を決定する必要があります。さらに、SHIP-/-マウスは、4〜5週間までに最大17%の体重減少を示し、8〜10週間までにさらに5%減少する可能性があります³³。大幅な体重減少を示す動物は、疾患の重篤な症状を反映しており、腸の病理に関連する治療結果を損なう可能性があるため、研究から除外する必要があります。

SHIP-/- モデルで疾患の進行を分析する際の重要な考慮事項は、適切な炎症マーカーの選択です。SHIP-/-マウスに関する豊富な経験に基づいて、サイトカインプロファイリングは通常、疾患の進行中にアップレギュレートされることが知られているIL-1βなどの特定のメディエーターに焦点を当てています。ただし、炎症反応の初期特性評価や新しい治療戦略を評価する場合は、マルチプレックスサイトカイン分析が推奨されます。この偏りのないアプローチにより、炎症環境のより広範なプロファイリングが可能になり、疾患の病因や治療反応に関連する予期しない標的が明らかになる可能性があります。

SHIP-/-マウスモデルは、再現性と効率性を可能にする実用的な利点を提供します。SHIP-/-マウスは、外因性トリガーを必要とせずに、自発的で一貫した回腸炎症および線維症を発症します。これにより、腸の炎症を誘発する際の試薬調製や標準化されていない投与プロトコルに関連するばらつきが排除されます。病気の発症は急速で、炎症は生後4〜6週齢で明らかになり、線維化は生後8週齢までに明らかになるため、モデルは時間とコストの両方の効率が高くなります。さらに、SHIP-/-マウスは繁殖と維持が容易で、ジェノタイピングは簡単で、特別な繁殖戦略は必要ありません。これにより、コロニー管理が簡素化され、技術的な作業負荷が軽減され、意図しない遺伝的多様性が導入されるリスクが低下します19,21,26。疾患は、FITC-デキストランアッセイ、H&E およびマッソンのトリクロム染色、ELISA など、ほとんどの研究環境で広く利用可能な技術を使用して確実に評価できます。これらの組み合わせた機能は、効率的な試験デザインをサポートし、財政的および技術的障壁を低減し、ラボ間で一貫したデータ生成を促進します。

SHIP-/- モデルには独自の利点がありますが、このモデルには制限もあります。すべての前臨床モデルと同様に、遺伝的、免疫的、および環境的要因の影響を受けるヒト IBD の複雑で多因子的な性質を完全に再現することはできません³⁴。DSS および TNBS モデルは、そのシンプルさと費用対効果により、依然として広く人気があります。遺伝子組み換えと組み合わせると、これらの化学モデルは、バリア機能に対する遺伝子特異的寄与を理解するための効果的なツールとして役立ちます³⁵。ただし、それらの主な有用性は、急性上皮損傷のモデル化にあります。それらは、CDを特徴付ける慢性免疫介在性病理と、直接的な臨床的関連性を欠く化学薬品によって誘発される上皮損傷のメカニズムを捉えるには不十分です³⁶。1 つのモデルのみに依存すると、治療の可能性の評価が不完全および/または誤解を招く可能性があるため、治療効果を保証するために複数のモデルを使用することをお勧めします。

開示事項

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著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

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この研究は、BC小児病院研究所の動物ケア施設と、カナダグリコミクスネットワーク(GlycoNet、センターオブエクセレンスネットワーク)およびカナダ保健研究所(MOP-133607からLS)を通じてカナダ自然科学工学研究評議会からの資金提供によって支援されています。KS と WM は、TRIANGLE (TRaIning a New generation of researchers in Gastroenterology and LivEr program) 博士課程奨学金の受給者です。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前	会社	カタログ番号	コメント
1.7mLスナップキャップマイクロチューブ	ディアムド	SPE155-N
1xDPBS(塩化カルシウム、塩化マグネシウムなし)	ギブコ	参考文献 14190-144
25G x ”針	BD	参照305122	心臓穿刺のために
26G x ”針	BD	参考文献 305110	腸のほたみ出し
酢酸	シグマ・オルドリッチ	A6283	組織学
酸性クエン酸デキトロールス溶液(38mMクエン酸、107mMクエン酸ナトリウム、136mMデキトロール)	ミリポール・シグマ	C3821
動物用給餌針、非滅菌、再利用可能、タイプ304SS	ミリポーア・シグマ	CAD7900	ガヴェッジストレートサイズ:24G, Lxdiam。1イン。x 1.25 mm、ボール
アプロチニン	ケイマン・ケミカル	9087-70-1	均質バッファー
BD Luer-Lok 注射器滅菌、使い捨て、5 mL	BD	参考309646	腸のほたみ出し
BD OptEIAマウスIL-6 ELISAセット	BDバイオサイエンス	555240
BD OptEIAマウス TNF ELISAセットII	BDバイオサイエンス	558534
BD®ルアースリップチップ注射器滅菌、単発使用、1mL	BD	参考309659
生検フォームパッドスクエアサイズ、30.2 x 25.4 x 2 mm H。	Simport Scientific	参考文献 M476-1	組織学
緩衝フォーマルドフレッシュ(低臭10%ホルマリン)	フィッシャー・ケミカル	SF93-4	組織学
透明なフラットボトム免疫非滅菌96ウェルプレート	サーモ・サイエンティフィック	439454
エッペンドルフ5415R冷蔵遠心分離機	マーシャル・サイエンティフィック	EP-5415R
無水エチルアルコール	グリーンフィールド・グローバル	P016EAAN	組織学
フィッシャーブランドTRU-FLOWティッシュカセット	フィッシャー・サイエンティフィック	15-200-403	組織学
FITCデキストラン、3-5kDa(1g)	ミリポール・シグマ	FD4-1G CAS番号:60842-46-8
ロイププチン	ミリポール・シグマ	103476-89-7	均質バッファー
マウスIL-1ベータ/IL-1F2デュオセットELISA	R&Dシステムズ	DY401
マルチスクリーン96ウェルプレート、ソリッドボトム	ミリポール・シグマ	MSSWNFX40	白くて無菌でない、未処理
オムニパークロロホルム	ミリポール・シグマ	3150	組織学
ポリトロンPT-MR2100ホモジナイザー	キネマティカAG	632081
Varioskan Lux マルチモードマイクロプレートリーダー	サーモ・サイエンティフィック	VL0L00D0