蛍光発泡スチレン微小球を用いた 生体内 2光子顕微鏡用微小血管塞栓症マウスモデル

サマリー

本プロトコルには、蛍光発泡スチレン微小球を用いた in vivo 二光子顕微鏡イメージングに最適な慢性頭蓋ウィンドウおよび微小血管塞栓症マウスモデルの段階的アプローチを詳細に記述しています。

要約

脳内の微小血管閉塞は比較的一般的ですが、依然として十分に研究されていません。事象発生率、長期的な影響、そして潜在的なクリアリングメカニズムはほとんど不明です。光血栓症や微小塞栓注射など、これらの事象を研究するために用いられている現在のモデルには、それぞれ利点と限界があります。この研究では、マウスにおける動脈内微小球注入 による 脳微血管塞栓の誘導と、慢性的な頭蓋窓の準備を組み合わせた詳細なプロトコルを開発しました。このセットアップにより、2光子顕微鏡を用いた微小血管および微小閉鎖の長期 生体内 画像化が可能となります。マイクロスフィアは外頸動脈(ECA)に挿入されたカテーテルを通じて投与され、永久に結紮されています。重要なのは、総頸動脈(CCA)と内頸動脈(ICA)が手術中および手術後も無傷で保たれていることであり、これにより脳血流への障害を最小限に抑えています。即時 のin vivo 画像化を容易にし、ミクロスフィアのクラスタリングやピペット先端およびカテーテルへの付着を防ぐために、マイクロスフィアはFITCデクトロンと0.1%トゥイーン20の混合物に懸浮しています。この注入技術は、死後生法を用いた 現地 3Dイメージングを用いてミクロ球の分布を決定することが検証されました。本研究は、 生体内 の二光子顕微鏡の例でその有用性をさらに示しています。このアプローチは、微小血管塞栓症の誘導と研究において一貫性かつ堅牢な方法を提供し、高分解能の 生体内 画像診断を用いてその影響やクリアランス動態の調査を可能にします。

概要

大きな脳動脈の塞栓による虚血性脳卒中は急性でしばしば壊滅^{的な出来事}です。塞栓はより遠位の血管にも発生することがあります。その結果、サイレント脳梗塞(SBI)が発症することがあり、名前が示す通り、これらは無症状であり、通常は画像診断中に偶然発見^{されます。}SBIは一般的であり、高^{齢者の解剖}で最も頻繁に観察される脳血管疾患の一つ^です。疫学的研究では、脳卒中の既往がない個人で20%の有病率が示されています。SBIは認知機能障害や認知症に寄与し、全体の死亡率を増加させ、将来の脳卒中のリスク因子となります^6,7,8。梗塞は通常、直径数ミリメートル程度で、直径約100μmの貫通動脈の閉塞と関連しています。これらの貫通体は広範な動脈床と毛細血管床を形成します。下流の微小循環に潜伏する小さな微小血栓は、血管造影⁹では検出されない可能性が高いです。しかし、多くの微小血栓は心房細動、動脈硬化性プラーク、その他の供給源から放出されることがあります(10,11,12,13,14)。マイクロ血栓のほかに、脂肪粒子、細胞集合体、さらにはマイクロプラスチックなど他の微小粒子(MP)も微小血管塞栓を引き起こすことがあります。いくつかの研究では、血液や脳中に毛細血管径の5μm^よりも大きいプラスチックMPが存在することが示^{されています。}

微小血管閉塞は急性脳卒中やSBIに比べて比較的研究が不足しています。事象発生率、長期的な影響、可能なクリアリングメカニズムについてはほとんど知られていません。しかし、脳卒中における機械的血栓切除術の臨床的導入に成功し、微小血管塞栓症が大きな原因動脈の再開化に成功した後、微小血管再灌流を妨げる可能性があります。¹⁷。さらに、微小プラスチックに関する研究も急増しており、微小血管塞^{栓症を通じて}部分的に影響が及んでいる^{可能性があります。}

マウス皮質における微小血管閉塞は、多光子顕微鏡を用いて頭蓋窓を用いて研究できます。脳微小血管閉塞を研究する際に最も一般的に用いられるモデルは、光血栓型および微小球型モデルです。光血栓形成モデルは、感光性染料を用いて、光活性化によって選定された血管(通常は非毛細血管)に塞栓症を誘導します。しかし、このモデルでは線維溶系の活性化により塞栓症が溶解されるため、より長期にわたる塞栓症の研究は可能ではありません^21,22。さらに、光に敏感な染料の活性化により単一重酸素種が生成され、内皮および血液脳関門(BBB)損傷を引き起こします²³。脳塞栓症中の内皮およびBBB機能、ならびに脳循環や脳機能への長期的影響に関する研究には、マイクロスフィアモデルが好まれます。マイクロスフィア注射モデルは、脳循環に注入された微小球を用いて脳微小血管を閉塞します。9,24,25,26,27,28,29,30。このモデルの欠点は、光^{血栓法とは異なり}、塞栓の位置を事前に決定できない点^{にあります。}利点は、明確な直径の微小球を注入できるため、特定の直径^33、34、35の(微小)血管を標的にできることです。

長年にわたり、齧歯類の脳循環にマイクロスフィアを注入するための複数のアプローチが開発されてきました。これらのプロトコルは、総頸動脈(CCA)、内頸動脈(ICA)、外頸動脈(ECA)からなる頸動脈三角にアクセスすることで合意が得られ、動脈内微小球注射を行います。動脈内マイクロスフィア注入の方法は、プロトコルによっていくつかの点で異なります。まず、試験では注射器9,26,27,29,33,34か、カテーテル25,28,30,36のいずれかが使用されました。次に、注入されたマイクロスフィアの数とサイズに大きなばらつきがあります。マイクロスフィアの直径は通常10〜50μmの範囲で、対象容器のサイズによって選択されます。経験則として、微小球が大きいほど注入する数字1は低く、細動脈の数は毛細血管より少ないため^です。

動脈内マイクロスフィア注入を一貫して行うことは依然として困難です。実際には大量のマイクロスフィアが注入されますが、脳循環に到達するのはごく一部に過ぎません。これは特に、in vivo の2光子顕微鏡イメージングで埋座した微小球の影響を研究する際に問題であり、この技術の成功は、準備された頭蓋窓を通してマウス皮質の外層に微小球が存在するかどうかに依存しています。マイクロスフィアに適した蛍光染料の選択は極めて重要であり、マイクロスフィアの強い蛍光や発光スペクトルの重複により、トランスジェニックマウスモデルや血管内染色と組み合わせるのは難しい場合があります。

微小血管閉塞は齧歯類モデルで研究されており、複数の微小球の相乗効果は生前外齧歯類の脳で示^{されており、さらに}そのような粒子の明らかな浸出(アンジオファジー33,35,37,38)も知られています。生体内での研究を可能にするため、頭蓋窓を持つマウスでの多光子顕微鏡法が開発されました。本研究の目的は、マウスへの動脈内マイクロスフィア注射の詳細なプロトコルを開発・報告し、脳組織への影響とその運命の研究を最適化することです。このプロトコルの主な利点は、送達効率の向上であり、微小球の損失を最小限に抑え、頭蓋の窓イメージング領域内の中大脳動脈(MCA)領域に存在する可能性を高めることです。最適化されたマイクロスフィア注入プロトコルは、in vivoの2光子顕微鏡および専用の画像クライオミクロトーム³⁹を用いた死後3Dイメージングを用いて評価されます。

プロトコル

動物を対象としたすべての処置は、実験動物のケアと利用に関するガイドに従って行われました。オランダ動物実験中央委員会は全面的な承認を与えました(AVD11400202316817年)。

注:2か月から1歳のオスとメスのマウスを使用しました。到着後、動物たちは実験的な処置を行う前に7日間の慣れ方をさせました。動物たちは1ケージにつき最大4頭の飼育が行われ、食事と水は 自由に提供され、12時間の明暗サイクルで管理されていました。NG2-DsRedおよびTIE2-GFPマウスを入手し(詳細は 材料表 を参照)、社内で繁殖させました。

1. 頭蓋窓インプラント

1. 麻酔および術前ケア
   1. 頭蓋窓手術開始の1日前に、飲料水に0.06 mg/mLのカルプロフェンを加えます。
   2. マウスの体重を測り、手術の30分前にカルプロフェン5mg/kgとデキサメタゾン2mg/kgを皮下投与します。
   3. 手術部位を準備し、立体定位フレームにフィードバックシステム付きの温熱パッドを置き、滅菌布で覆います。
   4. 滅菌手術器具を二重の滅菌布の上に並べます。
   5. 誘導チャンバーで1L/minの空気混合物(酸素30%、医療用空気70%)と3〜4%イソフルランで麻酔し、その後1.5〜2%イソフルランでマスクを用いて麻酔を維持します。
   6. ネズミを立体視固定フレームに固定し、潤滑剤を使って温熱パッドの温度計プローブを直腸に挿入します。乾燥を防ぐために眼軟膏を塗り、温熱パッドを37°Cに設定してください。
   7. 手術5分前に手術切開ラインにロピバカイン1.5 mg/kgを皮下投与します。
   8. 首から目を少し越えた皮膚を、綿先でベタジンで拭き取ります。
2. ヘッドバーと窓固定のための外科的準備
   1. 滅菌鉗子と外科用ハサミを使い、後頭部の皮膚に最初の切開を行います。ラムダ縫合から正中線に沿って前方に切開部を伸ばし、ブレグマのすぐ前方の前頭縫合線まで伸ばします(図1A)。慎重に皮膚を引き抜き、両側の側頭筋を完全に露出させます。
   2. 出血を最小限に抑えるために、頭蓋骨に約0.1mLの1%リドカインを塗布します。
   3. 骨膜を取り除き、頭部バーを固定する頭蓋骨のすべての部位を外科用ブレードでかき取ります。傷は頭蓋骨の上を垂直にして、ヘッドバーのしっかり接着を確実にします。
   4. 残った血は綿先端で拭き取り、頭蓋骨を圧縮空気で乾燥させます。
3. ヘッドバー固定
   1. 冷たい(4°C)セラミック容器に100μLのモノマーを0.1gのポリマーに加え、歯科用接着剤の混合物を準備します。混合物に触媒1滴を加えると、接着剤の急速な固化を始めます。
   2. 接着剤をヘッドバーの底に塗ります。矢状洞から頭のバーを左外側に少し傾けて頭蓋骨に押し当てます。ヘッドバーの縁に追加の接着剤を塗って、すべての開口部を密閉してください。これによりしっかりとした接着が保証されます。
   3. 100μLのデンタルセメント液と0.1gの粉末を混ぜて歯科用セメントの混合物を作ります。ヘッドバーの全面にセメントを塗布しつつ、ドリル部分の頭蓋骨にセメントが流れないようにします。ヘッドバーの上に追加の歯科用セメント層を加えてウェルを形成し、頭蓋窓に液体を塗布できるようにします(図1B)。
   4. デンタルグルーとセメントを少なくとも10分間乾かしてください。
   5. 頭蓋骨の接着がしっかりしているか確認するために、開頭切開を行う頭蓋骨に優しく圧力をかけます。頭蓋骨が動かず、歯科固着剤と頭蓋骨の間に液体が出ないときは、ヘッドバーは正しく接着されています。
4. 開頭術
   1. マウスをヘッドバーを使って画像ホルダーに取り付けるか、定位フレーム内に置いて頭部をしっかり固定し、開頭手術中に頭部をしっかりと固定します。
   2. 頭蓋骨の開頭切開用ドリルターゲット(直径4mm)を細かいポイントマーカーでマークします。頭蓋骨を通して見えるMCAを特定し、頭蓋の窓が最適な位置に位置し、できるだけMCA全体を覆うようにしてください。掘削ターゲットの正しいサイズと位置を確認するために、カバーガラスをマークエリアの上に持ち、必要に応じて掘削ターゲットのサイズを調整してください。
   3. 頭蓋骨に圧力をかけずに、マーキング部分で円を描くように穴を開け始め、熱の発生を防ぎます(図1C)。30秒ごとに生理食塩水を投与して頭蓋骨を冷やします。冷却中は、ドリルヘッドを水に浸して洗浄し冷やし、その後ペーパータオルで乾かします。圧縮空気を使って骨の粉塵は定期的に取り除きましょう。頭蓋にガラスを当てて、必要に応じてドリルの調整で開頭切開の大きさを確認してください。
   4. 骨が十分に薄くなるまで円を描くように穴を開け続けます。頭蓋骨がほぼ穴が開くと、掘削部分にひび割れが生じます。骨が十分に薄くなっていることを確認するために、薄くなった頭蓋骨を柔らかくするために生理食塩水を加え、ドリル部分内の頭蓋骨の中央を優しく押さえます。頭蓋骨が優しい圧力の下で全方向に均等に下がれば、掘削範囲は十分に薄くなります。この地点に達するまで掘削を続けてください。頭蓋骨を貫通してはいけません。これにより硬膜や脳組織が損傷するリスクがあります。硬膜が損傷したり出血がある場合は、ドリル部位をACSFで浸したまま保ちましょう。
      注意:頭蓋骨を取り除く前に、掘削エリアから骨の粉塵をすべて除去していることを確認してください。硬膜に残った骨の粒子が窓の下で骨の再生を引き起こす可能性があります。
   5. 骨粉はACSFと圧縮空気で徹底的に除去します。頭蓋骨が完全に水没するまで、穴を開けた部分にCSFを塗布します。27ゲージ(0.4mm x 16mm)または30ゲージ(0.3mm x 13mm)の針を使い、薄くなった頭蓋骨を水平方向(~180°)慎重に刺し、硬膜と脳への損傷を防ぎます。骨を優しく上方に押し上げて外れるまで、最小限の力を加えます。骨が簡単に剥がれない場合は、ドリルを続けてください。ピンセットで剥離した頭蓋骨を除去し、脳をaCSFに浸したままにします(図1D)。
   6. 脳をaCSFで洗浄し、その後、無菌で吸収性のある豚ゼラチン止血スポンジをaCSFに浸したものを脳に当て、局所出血を2分間抑えます。スポンジを慎重に取り出し、脳をaCSFに浸したまま保ちます。骨屑や血液が脳に残らないように、aCSFで洗浄を続けてください。出血が続く場合は、脳に新しい無菌で吸収性の止血スポンジを浸したものを脳に置きます。
      注意:骨除去時に軽度の出血はよくあります。ガラスを設置する前に、残留する漏れが止まったか確認してください。残留する漏れは窓の透明度を低下させる可能性があります。
5. カバーガラスの配置
   1. 脳を覆うaCSFを綿の先端で吸収し、薄い層だけを残します。カバーガラスを脳に当て、曲げたマイクロピンセットで頭蓋骨の開口部に優しく押し当てます。カバーガラスは頭蓋骨の高さよりやや下に位置し、ヘッドバーと平行に配置してください。
      注意:ガラスは脳にしっかりと押し付けられ、虫歯の形成を防ぎ、窓の品質を保つ必要があります。カバーガラスをヘッドバーと平行に保つことで、顕微鏡対物レンズに対して直角になるため、画質が向上します。
   2. カバーガラスを頭蓋骨とヘッドバーにエポキシ接着剤で取り付け、側面に塗りつつガラスをしっかりと固定し、ヘッドバーと平行に保ちます。
   3. 脳の露出を防ぐために、カバーガラスの端はすべて接着剤で密封してください。塗布時には、接着剤が窓の下に浸透したり硬膜に接触したりするのを防ぐため、脳に1滴のaCSFを保持してください(図1E)。
   4. 接着剤を5分間固めます。

図1:開頭手術プロトコルの概要。 開頭手術およびヘッドバー装着手術における重要な手順の詳細な例画と概図。(A) 皮膚の除去(ステップ2.2)。(B) ヘッドバーの取り付け(ステップ2.3)。(C) 4mm開頭術の穴開き(ステップ2.4.3)。(D) 頭蓋骨の摘出(ステップ1.4.5)。(E) カバーガラスの設置(ステップ1.4.7)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

6. 術後ケア
   1. カルプロフェンを5 mg/kgを皮下投与します。
   2. 動物を37°Cの回復ケージに30分間移します。その後、手術後最大2日間、0.06 mg/mLのカルプロフェンを飲料水に浸した状態で元のケージに戻します。
   3. 動物が手術前の体重に戻るまで、0.06 mg/mLのカルプロフェンに浸した食事を提供します。
   4. 微小血管塞栓症モデル手術を行う前に、動物が少なくとも7日間回復するまで待ちます。

2. 微小血管塞栓症マウスモデル

1. カテーテルの組み立て
   1. 長さ20cmのマイクロカテーテル(ID 0.23114 OD 0.27432 mm)の先端を透明カテーテル(ID 0.31 OD 0.64 mm)に挿入し、接続部をエポキシ接着剤とテープで封じます。カテーテルの全長が少なくとも160μLを保持できるか確認してください。
   2. 透明カテーテルの反対側に27ゲージのルアーロック針(0.1 mm x 16 mm)を挿入します。端をエポキシ接着剤とテープで封印します。
   3. 1mLのシリンジに生理食塩水を満たし、カテーテル針のルアーロックに接続します。0.7mLの生理食塩水で洗浄し、漏れや気泡が残らないようにしてください。
   4. カテーテルに80μLの生理食塩水を満たし、カテーテル内で到達したレベルを記録します。
2. 麻酔および術前ケア
   1. 微小血管塞栓症手術の前日に、マウスに0.06 mg/mLのカルプロフェンを含む飲料水を与えます。
   2. フィードバックシステム付きのヒーターパッドを滅菌布の下に置き、37°Cに設定します。
   3. すべての滅菌手術器具を二枚目の滅菌布の上に置いてください。
   4. マウスの体重を測り、手術の30分前に5 mg/kgのカルプロフェンを皮下投与します。
   5. 誘導チャンバーで3〜4%のイソフルランを用いて麻酔し、ガス流量1L/分(酸素30%、手術用70%)で麻酔します。
   6. マウスを手術台に移し、1.5〜2%イソフルランを1L/分で投与し、酸素30%と空気70%を含み、顔面マスク で 麻酔を維持します。
   7. 潤滑剤を塗った直腸温度プローブを挿入し、乾燥を防ぐために眼軟膏を塗布します。
   8. 仰向けマウスの首の下に2mLの注射器を置き、手術部位へのアクセスを容易にします。
   9. 前足を優しくテープで手術台に固定します。
   10. 手術部位を剃り、ベタジンを塗布し、その後リドカインを塗ります。
3. 切開
   1. 麻酔の深さをつまみで確認してください。
   2. 下顎の下の気管の上、約0.5cmの中央線切開を外科用ハサミと解離鉗子を使って行います。
   3. 頸筋膜の浅い結合組織を微細縫合固定鉗子で剥離し、下の胸骨舌骨筋を露出させます。
   4. 左右の胸骨舌骨筋を、そっと結合組織を切り裂いて分離します。組織フックで右のオモモヒーイド筋を尾側側に引っ張ります。CCA、ICA、ECAを含む右頸動脈三角がはっきり見えるようにしてください。
4. CCA、ICA、ECA、および後頂蓋動脈(PPA)の外科的準備
   注意:迷走神経を掴んだりつまんだりするのは避けてください。動物の健康に悪影響を及ぼさないように、そっと動かしてください。気管には触れないでください。呼吸器の問題を引き起こす可能性があります。後頭動脈(OA)は、ICAのY字型分岐部とECAの起点の中間で分岐し、上甲状腺動脈(TA)はECAの内側から分岐します。これらの動脈は脆弱であり、極めて慎重に扱う必要があります。
   1. CCA周辺に残った筋膜や脂肪組織を除去してください。
   2. CCAを迷走神経から慎重に分離してください。
   3. CCAの周りに4/0の1.5インチのネジを2本巻き、ゆるく結びます。こりがCCAの血流を妨げないようにしてください。
   4. ICAとPPAから筋膜と脂肪組織を除去してください。PPAとOAを含むすべてのICA側枝を、4/0 1.5の糸で結び目で結んで一時的に結びます。
   5. 筋膜と脂肪組織をECAとTAから除去してください。ECAとTAの周りに4/0の1.5スレッドで2本の緩い結び目を作ってください。Y字型分岐部からできるだけ離れた最も遠位の糸を位置付け、ECAとTAを永久に結紮します。近接結び目は結ばずにいてください。
5. マイクロスフィア溶液調製とカテーテル負荷
   注意:注射直前にFITCデキストラン/マイクロスフィア溶液を準備し、ミクロスフィアのカテーテルへの付着を最小限に抑えてください。
   1. 10μmマイクロスフィア(7.2×10、⁶ マイクロスフィア/mL)を均質化し、個々の粒子の均一な懸濁液を得るために超音波処理を行います。
   2. 25 mg/mL 70 kDaのFITCデクトラン140 μL(0.1% Tween20を含む)を準備し、20 μLの均質化されたマイクロスフィアを加えて、1.44 ×^{10 5} マイクロスフィアを含む160 μLのFITC-Dextran/Tween20/マイクロスフィア混合物を得ます。
   3. カテーテルに接続された注射器を短く引き抜いてエアロックを作ります。
   4. カテーテルの先端を準備されたFITCデキストラン/Tween20/マイクロスフィアの混合物に浸し、注射器をゆっくり引き戻して混合物がカテーテル内に入るまで続けます。
   5. カテーテル内に気泡がないか必ず確認してください。もし存在する場合は、混合物を0.5mL容器に注ぎ、手順2.5.3および2.5.4を繰り返します。
   6. カテーテルを装填したシリンジをシリンジポンプに入れます。ポンプを10 μL/minに設定し、カテーテルの先端に微小なマイクロスフィア混合物の滴が現れるまで運転します。
6. カテーテル挿入とマイクロスフィア注入
   注意:血管系に気泡を注入することは避けてください。これは重篤な副作用や死亡を引き起こす可能性があります。気泡はカテーテルの誤った負荷やチューブ内の漏れが原因で発生することがあります。
   1. ICAに器クリップを取り付け、事前に用意した近接結び目の一つをCCAに巻き付けます(ステップ2.4.3参照)。
   2. マイクロシザーズを使い、結紮線から約0.5mm先端のECAに小さな斜めの切開を行います。切開の大きさはカテーテルの直径より少し小さくしてください。
   3. 血液は滅菌布や組織で吸収し、結紮や血管クリップの外に血液が漏れ続けないようにしてください。
      注意:ECA切開後、血管三角は血液を保持しないようにしてください。残留血液は血栓形成を引き起こし、頸動脈の流れ回復時に大規模な脳虚血性イベントを引き起こしたり、ECAを遮断してマイクロスフィア注射を妨げることがあります。
   4. カテーテル先端にマイクロスフィア混合物の滴を作って、カテーテル先端に空気が残っていないことを確認するために、シリンジポンプを短時間起動します。
   5. ECA切開部を開け、細いマイクロ鉗子でカテーテルを挿入します。挿入時は他の表面に触れないようにし、マイクロスフィア混合物の漏れやカテーテルへの空気の侵入を防ぎましょう。挿入が失敗したりカテーテルの先端が表面に触れた場合は、手順2.6.4を繰り返してから再挑戦してください。
   6. 近位縫合糸をECAの周囲に締めてカテーテルを固定します(ステップ2.4.5参照)。
   7. 血管内に漏れや気泡がないか確認するために、シリンジポンプを10 μL/minで開始してください。どちらかが存在する場合は、カテーテルを外してステップ2.6.4に戻ります。
   8. 漏れや気泡が検出されない場合は、10 μL/minでポンプを続け、カテーテルと血管内の圧力を徐々に上げて動脈の拡大が確認されるまで続けます。動物の動脈圧に合わせて、カテーテルと血管内に十分な圧力を設定してからICAおよびCCAを再開します。CCAおよびICAで血流が回復すると、一部の血液がカテーテルに入ることがありますが、その後再注入されます。微小球混合物のECAへの注入と圧力の蓄積が成功したかを視覚的に確認し、緑色のFITC染料が動脈を満たしているのを観察します。これが見られない場合は、シリンジポンプを停止し、カテーテルを外し、手順2.6.4から2.6.8を繰り返します。
   9. ICAから血管クリップを外し、シリンジポンプの流量を20 μL/minに上げます。PPA分岐部の遠位ICAがFITC染料で満たされているかを確認し、マイクロスフィア注入の成功を確認してください。確認された場合は、ステップ2.6.11に進みます。そうでなければ、ステップ2.6.10に進みます。
   10. シリンジポンプを止めてPPA結紮を緩めてください。PPAの結合をICA-PPA分岐からさらに離れた位置に再配置し、その後接続を締め付けます。ステップ2.6.9に戻る。
   11. CCAを結びつけていた糸を外して、マイクロスフィア混合物がICAに流れるようにします。
   12. マイクロスフィア混合物注入時の逆行流のトラブルシューティング:
       1. 微小球混合物の逆流がCCAに起きた場合は、シリンジポンプの流量を10 μL/minに減らします。
       2. 逆行性出血が続く場合は、マイクロピンセットでECA、ICA、CCAを優しく圧迫し、血栓による流れの詰まりがないか確認してください。
       3. 血管内に気塞栓が存在しないことを目視で確認してください。エア塞栓は血管内の透明な部分として認識できます。
       4. 空気塞栓がある場合は、注射ポンプを停止し、マイクロ鉗子で動脈を優しく圧迫して空気塞栓をECAに移します。CCAを結びつけ、ECAに器クリップを取り付けてください。カテーテルとエア塞栓を抜き、ステップ2.6.4に戻します。
       5. 閉塞が見られないが逆行性流が続く場合は、血管クリップでCCAを閉じ、ステップ2.6.10に戻ります。
          注意:微小球混合物のCCAへの逆行流は起こるべきではありません。なぜなら、ICA再開の不十分さ、空気塞栓症、血栓形成を示し、実験結果に悪影響を及ぼす可能性があるからです。
   13. カテーテル内の混合物が80μLに達したら、シリンジポンプを停止してマイクロスフィア注入を停止します(ステップ3.1.4参照)。合計80μLのFITCデキストラン/Tween20を7.2×10⁴ マイクロスフィアで注入します。
7. 手術の完了
   1. 残りの準備済み結び目でCCAを結び(ステップ2.4.3参照)、容器クリップでICAを閉じます。
   2. ECAからカテーテルを外しつつ、カテーテルを固定する糸は同じ位置に保ちます。
   3. カテーテルを固定していた糸を締めてECAを永久に結紮してください。
   4. 血管クリップとCCA、ICA、PPAの周りのネジ山を外して血流を回復させてください。手術部位を数滴の生理食塩水で湿らせます。
   5. 皮膚を12mmの逆切断3/8曲がった針と、吸収性のない3-0(USP)シルク縫合糸で縫合します。
8. 術後ケア
   1. カルプロフェンを皮下投与します。
   2. 動物を回収ケージ(~33°C)に移し、30〜60分間過ごします。完全に回復したら、動物を元のケージに戻してください。
   3. 最初の2日間は、カルプロフェン0.06 mg/mLで10分間浸して動物に与え、飲料水には0.06 mg/mLのカルプロフェンを補足します。この期間終了後は、カルプロフェンなしで浸した飼料を続け、動物が手術前の体重に戻るまで続けてください。
   4. 最初の2日間は1日に数回、その後は週3回観察します。人道的な最終点に達した場合は安楽死させてください。
      注:人間のエンドポイントは欧州議会の指令2010/63/EUに基づいて定義されています。さらに、円環行動や麻痺などの虚血の兆候が見られた動物は安楽死させてください。微小血管塞栓症モデルは重大な虚血性イベントを引き起こすべきではありません。

図2:微小血管塞栓症手術。 微小血管塞栓症手術における重要なステップの詳細な例画と図面。(A) CCA(2回)、ECA(2回)、TA、OA、PPA結合(ステップ2.4)の調製。(B)(側頭)結紮(^1st)とECAの結紮を行い、その後OAとPPAを閉じ、血管クリップでICAを一時的に閉じて出血せずにECAを切開できるようにします(ステップ2.6.2)。(C) 解離されたECAにカテーテルを挿入し、2つ目の縫合糸で結ばれます(ステップ2.6.7)。(D) CCA周辺の近位縫合糸を開け、血管クリップをICAから外して血流を回復させ、その後マイクロスフィア混合物をICAに注入します(ステップ2.6.10)。CCA = 総頸動脈;ECA = 外頸動脈;TA = 甲状腺動脈;OA = 後頭動脈;PPA = 翼口蓋動脈;ICA=内頸動脈。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

3. 生体内 イメージング

1. 二光子顕微鏡
   1. 動物を顕微鏡の2光子イメージングホルダーに入れ、術後の 生体内 画像撮影を行います。酸素30%と空気70%の混合液で1.2%イソフルランを1L/分の混合液で軽麻酔を維持し、呼吸頻度と深さを監視してください。顕微鏡のセットアップの詳細は 補足表1 を参照してください。
   2. 10倍対物レンズ(10倍/0.30 DRY)と水銀ランプ照明を用いて、頭蓋窓を通して詰まった微小球を見つけます。次に、25倍の水浸水対物レンズ(25倍/0.95水)を用いた二光子イメージングに切り替えます。画像設定については 補足表2 を参照してください。
   3. 関心のあるミクロスフィアの周囲にZスタックを記録します。

4. 死後分析

1. インシチュイメージングの実験的エンドポイント
   1. 実験的終点に達したら、4%イソフルラン>1L/分の酸素30%と医療用空気70%の混合物で子宮頸部脱臼して安楽死させます。
2. インシチュ 脳イメージング
   1. 脳を抽出し、3.0%カルボキシメチルセルロースナトリウム溶剤(シグマ)に0.1%黒インク(VWR)を混ぜて、−20°Cで少なくとも24時間冷凍します。
   2. Juch R.N.S.らが以前に記述したカスタムメイドの小型3D蛍光画像クライオミクロトームシステム(small-3D-FICS)を用いて脳を画像化^します。脳を垂直に16μmのセクションに分割し、13.66×13.66μmの解像度で画像を撮影するよう設定します。画像設定およびシステム仕様については 補足表3 および 補足表4 を参照してください。Articulusソフトウェア⁴¹を使って画像を解析してください。
3. in situ 全身マウスイメージング
   1. 動物の皮、歯、尾を剥がします。
      注意:尾部の取り外しはオプションですが、撮影速度は向上します。
   2. 動物を3.0%カルボキシメチルセルロースナトリウム溶媒(シグマ)に0.1%黒インク(VWR)と混合し、−20°Cで少なくとも24時間冷凍します。
   3. 前 ^述の大型3D蛍光撮影クライオミクロトームシステム(大型3D-FICS)を用いて動物を画像化します。システムを25.9μmの断片を26.09μmの面内分解能で切断する設定をします。画像設定およびシステム仕様については 補足表5 および 補足表6 を参照してください。Articulusソフトウェア⁴¹を使って画像を解析してください。

結果

死後生動(ポストモーテム・イン・シチュ・イメージング)

微小血管塞栓症手術の成功は、微小血管塞栓術から4日後に全身および全身脳の死後画像診断によって確認されました(図3A)。マウスの矢状切面は脳内の微小球の収着を示しています。図3B,Cは、摘出されたマウス脳の例で、微小血管塞栓症手術後1日目に示しています。微小球は主に同側半球、中前大脳動脈の流域に収まっていました。Tween20を混合に加えた際、脳スライス中のマイクロスフィアカウントが有意に増加しました(図3E)。マイクロ塞栓症手術後の回復中の体重モニタリングでは、Tween20を含むマイクロスフィア混合物を注射したマウスは体重減少が少なく、手術後の回復も速かったことがわかります(図3F)。

図3:微小血管塞栓術後のマウス内のマイクロスフィアの分布。 Articulusソフトウェア⁴¹を用いてマウスの10μm微小球の現地局在化。(A) 微小血管塞栓症手術後に大型3D-FICSで撮影したマウスの矢状面例。(B-D)マウス脳の代表的な軸、冠状、矢状面画像を小型3D-FICSで画像化。(E) コントロールおよびTween20条件下で、約ブレグマ±0.5mmの冠状脳切片あたり平均検出されたマイクロスフィア数。バーは平均±標準偏差を表します。個々の測定値は点で示されています。統計比較は非ペアt検定を用いて行われました。p値はグラフに示されています。外れ値は四分位範囲間(IQR)法(両群ともn=1)を用いて特定・除去され、結果として対照群はn=3、Tween20はn=14となりました。(F) 微小血管塞栓症手術後の時間経過による正常化体重の変化(時刻0)。体重は手術時に各動物の基準値に正規化されました。線はグループごとの平均±SDを示します(コントロール、n = 4;Tween20、n = 5)では、Controlは青、Tween20は濃いオレンジで表彰されています。各時点におけるグループ間の統計的有意性は、非ペアの両側t検定を用いて評価した。(* = p < 0.05, ** = p < 0.01)この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

マイクロスフィア注入および 生体内 二光子顕微鏡

マイクロスフィア注入時、5%BSAコーティングされたカテーテルでは、多くのミクロスフィアがカテーテル表面に付着し、流動するミスフィアがしばしば集まっていて、より大きな閉塞を引き起こす可能性があります(補足ビデオ1参照)。さらに、ミクロスフィア混合物に5%BSAを加えて接着やクラスタリングを防ぐことは、注入時の免疫反応の可能性から望ましく^{ありません。}これを回避するために、マイクロスフィア混合物に0.1%のTween20溶液が使用され、カテーテルを通過する微小球の数が目に見えて増加し、イメージングウィンドウ内の微小球数(> 20)が目に見えました(図4および補足動画2参照)。図4A、Bは、微小血管塞栓症手術後0.5時間後の脳皮質の蛍光顕微鏡全体像を示しています。各白い点は、脳の微血管内の毛細血管を遮る微小球を表しています。図4C,Dは2D投影の2光子zスタック画像を示しています。微小球は灌流障害を伴う脳微血管塞栓を引き起こしており、微小球下流に内腔内染料が存在しないことが示唆されています(図4Eおよび補足動画3)。さらに、これらの塞栓はFITCデクトラン染料の漏出によるBBBの破壊を引き起こします(図4F,G)。

これらの結果は、カテーテルに付着した微小球数の少なく、微小球のクラスタリングが最小限で、マイクロスフィア-トゥイーン混合液を注入した際に観察された結果と一致しています。しかし、カテーテル内の最後の20μLのミクスフィア混合物には多数の微小球が集まっており、大規模な梗塞の発生を防ぐために注射すべきではありません(補 足ビデオ4参照)。

図4:2光子を用いた生体内顕微鏡観察による埋まった微小球。 マウス皮質に詰まった微小球のin vivo蛍光および二光子画像の例。(A) ロッジの微小球の頭蓋窓からの蛍光透視。(B)選択したROIの蛍光画像。(C,D)脳微小循環内の閉じ込められた微小球の二光子顕微鏡画像で、詳細な画像化のための選択的なROIを用いています。Zスタック画像は、Zスタックに沿ったピクセル強度の標準偏差を計算することで2Dで表現されます。(E-G)代表的な生体内2光子顕微鏡画像で、3つの脳微小血管塞栓を示す。赤い矢印はFITC-デクトランの漏出部分を示しており、BBBの乱れと染料漏れを示しています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

補足表1: 二光子顕微鏡システムの仕様。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表2: FITCデキストランおよび微小球イメージングのための二光子顕微鏡設定。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表3: 青色マイクロスフィアを用いたマウス脳イメージングのための小型3D蛍光画像クライオミクトームシステム設定。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表4: 青色マイクロスフィアを用いたマウス脳イメージングのための小型3D蛍光画像クライオミクロトームシステムの仕様。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表5: 赤色マイクロスフィアを用いた全マウスイメージングのための大型3D蛍光画像クライオミクロトームシステム設定。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表6: 赤色マイクロスフィアを用いた全マウスイメージングのための大型3D蛍光画像クライオマイクロトームシステム仕様。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足動画1: 5%BSAコーティングカテーテルで、注射時に25 mg/mLのFITC-デクトレンマイクロスフィア混合物中にミクロスフィアがカテーテル壁に付着し、微小球がクラスタリング。 このビデオをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足動画2: 0.1%のTween20被覆カテーテルで、カテーテル壁にマイクロスフィアの付着がある程度ありつつ、25 mg/mLのFITC-デクトレンで0.1% Tween20混合液を注入中にマイクロスフィアのクラスタリングなし。 このビデオをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足動画3: 微小球による微小血管閉塞の3D分割。 このビデオをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足映像4: 25 mg/mlのFITC-デクトレンと0.1%のTween20混合物で高マイクロスフィア濃度のマイクロスフィア注入の最終量。 このビデオをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル1: ピペットチップのマイクロスフィア遵守確認。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル2: 同側半球と対側半球を比較し、マイクロ塞栓症手術後1日、7日、28日におけるCD45カバレッジの免疫組織化学的評価。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

微小血管塞栓症をモデル化するために、マウスの脳循環に微小球を注入するプロトコルが記述され、 in vivo の2光子顕微鏡を用いた微小塞栓症の研究が可能となりました。この方法は脳内のマイクロスフィアの捕捉を最適化し、同側皮質の最初の500μm内に複数のマイクロスフィアを閉じ込めることで、効果的な二光子イメージングを可能にしました。

脳の皮質領域における高いマイクロスフィア数は、生体内での二光子イメージングにおいて非常に重要です。マイクロスフィア混合物の調製時には、ピペットの先端に5%のBSAまたは0.1%のTween20をコーティングすることで、マイクロスフィアの損失を最小限に抑え、ミクロスフィアの接着を減少させました(補足ファイル1参照)。接着されたマイクロスフィアの正確な数は定量化できませんでしたが、平均強度測定によりコーティングの効果が示されました。さらに、Tween20はカテーテル内の微小球の集まりを防ぎ、カテーテルを流れる単一の微小球の数を視覚的に増加させる効果があるようですが、これは定量化されていません。これにより、大きな血管閉塞のリスクや、微小血管塞栓のモデル化を目的とした大きな虚血・低酸素領域の形成リスクが低減されます。さらに、マウスはTween20の低濃度を含むマイクロスフィア混合物を注射すると、減量が少なく、手術前の体重までより早く回復しました。Tween20は一般的に使用される分散剤45,46,47であるため、本研究で使用された低濃度はBBBの完全性に毒性や悪影響を引き起こすとは期待されていません。さらに、我々のデータはBBBの漏れがマイクロスフィアの通過後(または通過後)にのみ発生し、体系的に発生せず、全白血球被覆率の有意な増加をもたらさないことを示しています(補足ファイル2参照)。これにより、0.1%のTween20の使用を支持しています。全体として、Tween20の追加は微小球の凝集を減らし、脳内循環への微小球の供給増加に寄与し、脳スライスでの微小球カウントによって確認され、二光子顕微鏡で十分に観察可能な微小球が可能になりました。Tween20の使用により脳内のマイクロスフィア数は増加しますが、マイクロスフィア注入のばらつきは依然として存在します。この変動にはいくつかの要因が寄与している可能性があります。まず、カテーテルや血管内で血栓が形成されると、微小球が血栓に付着することがあります。次に、気泡の存在がスムーズな投与を妨げる可能性があります。最後に、CCAやICAの血流が不完全に回復すると血行動態が変化し、血管壁への微小球の付着を促進したり、内腔内に集まる可能性があります。残念ながら、これらの偏差は注射時に検出できません。

ポリスチレン微小球は水よりも密度が高く、微小球混合物がカテーテルに注入されると分布が不均一になります。ほとんどの微小球はカテーテル壁付近に沈降し、そこでは流体の摩擦によって中心の流れが速い流れに比べて動きが遅くなります。これにより、カテーテルの最終20μL内に微小球が蓄積します。この濃縮部分の注射は、大きな塞栓や虚血性イベントを引き起こす可能性があるため避けるべきです。これを防ぐために、マイクロスフィアの混合体は意図した注入量の2倍で準備されるべきです。

微小血管塞栓症手術は、かなりの訓練と正確さを要求します。最も技術的に難しい工程の一つは、PPA、OA、ICAの側枝に縫合糸を設置し、マイクロスフィア混合物をウィリスおよびMCA領域に正確に届けることです。この工程は、迷走神経がCCAの近くに近く、血管の直径が小さく手術スペースが限られているため、神経損傷や血管損傷を避けて縫合を設置するのが難しいため、複雑です。

血管クリップは、一時的に縫合糸でPPAを結紮する代替手段として検討されることがありますが、追加のリスクを伴います。クリップが意図せず外れ、容器が再び開くことがあります。さらに、既存のICAクリップの隣に2つ目のクリップをPPAで使用すると、スペースの制限によりICAクリップの剥離の可能性が高まります。もしこれが起こると、重大な出血を引き起こし、即時の介入がなければ実験の早期終了につながる可能性があります。したがって、容器クリップによるPPAの閉鎖は推奨されません。

現在のプロトコルでは、マイクロスフィア注射にはシリンジ³³ではなくカテーテルを使用しています。この方法は注入速度と体積の制御が向上し、顕微鏡やMRIスキャナーなどの画像装置内でのマイクロスフィア注入をより遠隔地で行うことも可能にします。

CCAではなくECAを入口に選ぶことで、注射中もCCAが完全に開いたまま、手術中により生理的な脳灌流を維持するのに役立ちます。さらに、CCAではなくECAで微小球を注入することには他の利点^{があります 48}: i) 再灌流時の総操作時間の短縮;ii) 注射時および手術終了後の出血リスクの減少;iii) CCA入口法では、針を抜いた後にCCA内に不安定な狭窄と血栓が^{形成されます。}これにより血流が乱れ、脳に到達するマイクロ血栓症の形成リスクも高まります。さらに、CCA経由で入るとCCAが永久に閉じる大きなリスクがあり、手術後の生存期間中に脳再灌流が最適でない状態になり、マウスにおけるウィリス円の大きな変動によって悪化する恐れがあります^50,51

完全に最適化されているものの、このプロトコルにはいくつかの制限があります。まず、マイクロスフィアがカテーテル壁に沿ってよりゆっくりと移動し、注入時に均等に分布しないという観察は、予想よりもICAに送られるマイクロスフィアの数が少ないことを示唆しています。Tween-20を使って接着を減らす方法を用いても、一部のマイクロスフィアはピペットの先端、エッペンドルフ管、カテーテルにくっつくことがあります。したがって、実際に注入されるマイクロスフィアの数は、計算されたマウスあたりの7.2×10⁴粒子よりも少ないと考えられます。それでも、十分な微小球が脳の循環に到達し、二光子顕微鏡 による イメージングが可能です。注入プロトコルと混合物組成は10μmポリスチレン微小球に最適化されています。使用する材料(チップ、チューブ、カテーテル)や微小球のサイズが変更された場合は、溶液および注入手順の両方を適切に再評価する必要があります。第二に、MCAの腔内閉塞 による 大血管閉塞の最良の方法を調べる研究では、ECAの永久結紮 による 血管系の進入が咀嚼筋および嚥下筋の虚血を引き起こすことが示されています⁵²。これによりマウスの食事量が減少し、過度の体重減少、運動機能の障害、神経学的欠損の増加につながる可能性があります。しかし、この記述は他の⁴⁸人によって否定されています。本研究では、手術後に体重が減少すると予想されるものの、数日以内に術前体重に急速に回復し、永久的なECA結紮後もマウスは回復し、正常に食事や水分を摂ることが示されました。動物の体重は監視されましたが、これは動物の健康状態の間接的な指標に過ぎず、局所的な咀嚼や運動障害などの機能障害を完全に排除するものではありません。機能回復に関する直接的な評価は行われておらず、これが本研究の限界となっています。別の研究ではCCAまたはECA による 血管系の進入を比較し、CCA 経由 の進入が脳循環の再灌流障害を引き起こすことを示し、ECAの進入法^{が推奨されること}が示されました。第三に、気泡や血栓、漏れを発生させず、CCAやICAの流れを妨げずにカテーテルを正しく確実に挿入するには、かなりの練習が必要です。最後に、ローズベンガル注射²²を用いた光血栓症のような他の微小閉塞法とは異なり、微小球が最終的に循環中にどこに定着するかを予測することはできません。

本研究では、陰性(偽)または陽性(光血栓症)対照群を意図的に含まない。これらは主要な目的に追加価値を提供しないためである。このモデルの成功は、特に頭蓋窓領域に埋め込まれた多数の微小球によって定義されており、高分解能 の生体内 顕微鏡観察を可能にすることにあります。偽の手法は定義上、標的領域に微小球が見つからず、生 体内 画像診断のエンドポイントとの関連性のある比較を提供できません。同様に、光血栓症モデルの導入は根本的に異なる病態生理学的メカニズムに対処することになり、本研究の範囲外であり、この研究は方法論の比較ではなく微小血管塞栓症モデルの特徴付けに焦点を当てています。塞栓症およびそれがBBBや局所神経組織に与える潜在的影響に関するより広範な組織学的解析は行われませんでした。なぜなら、本研究は組織レベルの検証よりも in vivo の3D可視化を優先するよう設計されていたからです。

頭蓋窓準備および微小血管塞栓症モデルの詳細な手術プロトコルは、微小血管塞栓症に関連する微小血管変化および同側半球全体での無症状脳梗塞の発生について、信頼性が高く再現可能な調査を支援します。マイクロスフィア混合物の最適化された調製と注入は、この実験手法の一貫性と妥当性をさらに高めています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
27ゲージ針(0.1x16mm)	照も	-	27ゲージ針(ステップ2.1.2)
Articulusソフトウェア	-	-	3D解析ソフトウェア(ステップ4.2.2および4.3.3)
ベタジン 30 ml(100 mg/ml)	マイラン	8712207037612	ベタジン/ヨウ素(ステップ1.1.8および2.2.10.)
C&B単量体	サン・メディカル	7111	瞬間接着剤の成分(ステップ1.3.1)
炭素鋼外科用ブレード(番号15)	スワン・モートン	205	頭蓋骨を引っかくための刃(ステップ1.2.4)
カルプロフェン(50 mg/ml)	ゾーティス	-	鎮痛薬(ステップ1.1、1.6、2.2、2.8)
触媒	サン・メディカル	7110	瞬間接着剤の成分(ステップ1.3.1)
カテーテル(内径0.31、外径0.64mm)	フロイデンベルク	228-0661	透明カテーテル(ステップ2.1.1.)
コストムはティッシュフックを作った	-	-	ティッシュフック(ステップ2.3.4)
コットンチップ	-	-	コットンチップ(ステップ1.1.8、1.2.4 &1.5.1.)
カバーガラス	ワーナー・インストゥルメンツ	64-0724	頭蓋式ウィンドウカバーガラス(ステップ1.4.2)
カスタムメイドのマウスヘッドバー	-	-	イメージングホルダー用のヘッドバー(ステップ1.3.2)
カスタムメイドのマウスイメージングホルダー	-	-	イメージングマウスホルダー(ステップ1.4.1および3.1.1.)
カスタムメイドの立体定位フレーム	-	-	立体定位フレーム(ステップ1.1.7)
歯科カメント液	クルツァー	64707937	デンタルセメントの構成要素(ステップ1.3.3)
デンタルセメメントパウダー	クルツァー	64707945	デンタルセメントの構成要素(ステップ1.3.3)
歯科用ドリル	セエシン	L-206	ドリル(ステップ1.4.3)
デキサメタゾン(4 mg/ml)	セントラファーム	-	術前薬剤(ステップ1.1.4)
鉗子の剥離	ブラウン・アスクラップ	BD023R	鉗子(ステップ1.2.2および2.3.2.)
ドリルバリビット PK/100,5(0.5mm)	ファインサイエンス	19007-05	ドリルビット(ステップ1.4.3)
デュラティア(3.5g)	アルコン	-	眼軟膏(ステップ1.1.8 &2.2.7.)
エポキシ接着剤(1g)	パテックス	9H PSMG3X	エポキシ接着剤(ステップ1.5.2および2.1.1.)
細かいマイクロ鉗子 ストレート	精密科学ツール	デュモン #5	微細鉗子(ステップ2.6.6)
FITC-デクトロン(70 KDa)	シグマ・オルドリッチ	FD70S	FITC-デクトラン解法(ステップ2.5.2)
イソフルラン(1000 mg/g)	カリズー研究所	118938	麻酔(ステップ1.1.6および2.2.5.)
大型3D蛍光イメージング クライオミクロトーム	特注品	-	large-3D-FICS(ステップ4.3.3)
リドカイン(100 mg/ml)	アスペン	-	局所麻酔(ステップ1.2.3および2.2.10)
マイクロシザーズ ヴァンナス 3-3/8インチ	ブラウン・アスクラップ	OC498R	マイクロシザーズ(ステップ2.6.2)
丸柄のマイクロ縫合鉗子結び	ブラウン・アスクラップ	FD280R	マイクロフォセプス(ステップ2.3.3)
丸柄を曲げたマイクロ縫合ピンセット	ブラウン・アスクラップ	FD281R	微小前叉状の曲げ(ステップ1.5.1 &2.3.3.)
微小血管クリップ	ブラウン・アスクラップ	FD562R	容器クリップ(ステップ2.6.1)
マイクロカテーテル(内径0.23114mm、外径0.27432mm)	マイクロルーメン		マイクロカテーテル(ステップ2.1.1.)
マウス用ヒーターパッドと直腸プローブ	ストールティング	53800R	ヒートパッド(ステップ1.1.2 &2.2.2.)
NG2-Dsレッドマウス	ジャクソン研究所、バーハーバー、アメリカ、在庫番号008241
ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート	シグマ・オルドリッチ	9005-64-5	Tween20(ステップ2.5.2.)
ポリスチレン フルオロスフィアブルー(365/415)	インビトロジェン	F8829	青色マイクロスフィア(ステップ2.5.1)
ポリスチレンフルオスフィアレッド(580/605)	インビトロジェン	F8834	赤色微小球(ステップ2.5.1)
リカバリーケージ	-	-	リカバリーケージ(ステップ1.6.2 &2.8.2.)
逆方向に3/8曲がった針(12mm)と縫合	ブラウン	0762067	縫合(ステップ2.7.5)
ロピバカ&ウウムル;Ne(2 mg/ml)	-	-	薬 (ステップ1.1.5)
小型3D蛍光イメージング・クライオミクロトーム	特注品		スモール3Dフィックス(ステップ4.2.2)
スポンゴスタン	エティコン	MS0005	スポンゴスタン(ステップ1.4.6)
外科用顕微鏡	ユーロメックス・マイクロスコープメントB.V.	ニュージーランド1903-B	手術用顕微鏡(ステップ1.2)2.1.1.)
外科用ハサミ	ブラウン・アスクラップ	BC303R	外科用はさみ(ステップ1.2.2 &2.3.2.)
シリンジポンプ(1mlシリンジ用)	ハーバード装置	70-2208	1mlシリンジポンプ(ステップ2.5.6)
スレッド、100m、および4/0 1.5 & nbsp;	ブラウン	F1134035	4/0.15スレッド(ステップ2.4.3)
TIE2-GFPマウス	ジャクソン研究所、バーハーバー、アメリカ、在庫番号003658
ウルトラピュアダスター	ソーラブ	CA6-EU	圧縮空気(ステップ1.2.5)
ユニバーサルポリマークリア	サン・メディカル	T058E	瞬間接着剤の成分(ステップ1.3.1)