方法論記事

標準顕微鏡とビデオ分析を使用したゼブラフィッシュ胚の機能的心臓イメージング: 環境および生物医学研究への応用

DOI：

10.3791/68941

⸱

2025年10月10日

 ,  ,  ,  , 
1Medical Faculty, Department of Pathophysiology, University of Belgrade, 2Faculty of Electronic Engineering, University of Nis

この記事について

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サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の心臓形態と機能を評価するための低コストの光学顕微鏡法を説明しており、高度なイメージングシステムを必要とせずに発生性心毒性の再現性評価を可能にします。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ゼブラフィッシュ(ダニオレリオ)は、ヒトとの遺伝的類似性、発生初期の光学的透明性、 および生体内 イメージングへの適合性により、心血管研究における脊椎動物モデルとして広く使用されています。この原稿は、明視野光学顕微鏡を使用して、受精後96時間(hpf)のゼブラフィッシュ胚の心臓形態と機能を評価するための標準化されたアクセス可能なプロトコルを提示しています。この方法には、胚採取、形態学的スクリーニング、アガロースでの固定化、鼓動する心臓のビデオ記録、心室寸法、一回拍出量、心拍数、駆出率、心拍出量などの心臓パラメータの画像ベースの分析が含まれます。計算は、オープンソース ソフトウェア (ImageJ、Zembryo Analyzer など) を使用した心室の幾何学的近似に基づいています。このプロトコルにより、広く利用可能な機器を使用して心臓のパフォーマンスを定量的に評価できるため、リソースが限られており、ハイスループットのスクリーニングを行う検査室に適しています。本研究では、96hpfのゼブラフィッシュ幼虫を光学顕微鏡で心臓の鼓動を記録して分析しました。測定された主要な心臓パラメータには、毎分拍動数によって決定される一回拍出量と心拍数の計算に使用された心室寸法が含まれていました。これらから、駆出率と心拍出量を導き出し、全体的な心臓のパフォーマンスを評価しました。健康な胚からの代表的な結果は、一貫した心室収縮と堅牢な機能指標を示しましたが、カドミウムに曝露された胚は心臓形態の障害と心拍出量の有意な減少を示しました。全体として、この方法は発生性心毒性を検出するために重要であり、ゼブラフィッシュの初期発生中の in vivo で 心機能を評価するための再現性のある非侵襲的アプローチを提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ゼブラフィッシュ(ダニオレリオ)は、ヒトとの遺伝的相同性、体外受精、胚の光学的透明性、および急速な発育により、心血管研究において著名な脊椎動物モデル生物として浮上しています1,2。これらの特徴は、費用対効果と拡張性と相まって、ゼブラフィッシュを初期の心臓形態形成、先天性心疾患、および発生性心毒性の研究に特に適しています3。それらの関連性は、脊椎動物種全体で心臓の発達を調節する遺伝子とシグナル伝達経路の高度な保存によってさらに強化されます4。特に、ゼブラフィッシュモデルは、正常状態と病理学的状態の両方の下での心臓の形成、リモデリング、および機能の遺伝的および生理学的基盤の理解に大きく貢献しています5,6。

構造的には、ゼブラフィッシュの心臓は単一の心房と単一の心室で構成されており、直線的に接続されており、哺乳類の4室心臓に典型的な中隔がありません。それにもかかわらず、ゼブラフィッシュの心臓は、心内膜層と心筋層の存在、心臓伝導系、リズミカルな収縮活動、神経ホルモン因子による調節など、人間の心臓生理学の重要な側面を要約しています7,8。重要なことに、ゼブラフィッシュの心臓は、心臓管の右向きのループとそれに続く心腔の拡張と描写など、ヒト胚発生におけるものに似た重要な形態形成イベントを示します9。さらに、ゼブラフィッシュの心臓は、活動電位の伝播、収縮性の調節、カルシウムサイクルダイナミクスなど、高等脊椎動物に見られる電気生理学的および血行力学的特性の多くを維持しています7。

これらの類似性を考慮すると、ゼブラフィッシュは毒物学において極めて重要なモデルとして浮上しており、特に化学物質への曝露が心臓の発達と機能にどのような影響を与えるかを評価するためのモデルとして浮上しています10。ただし、この分野における大きな制限の 1 つは、技術的に要求の厳しいイメージング技術への依存であることです。共焦点顕微鏡やライトシート顕微鏡、蛍光心臓マーカーを発現するトランスジェニック株などの従来の高解像度方法は、強力ではありますが、コストがかかり、かなりの技術インフラが必要です11。これらの制約により、特にリソースが限られている環境やハイスループットスクリーニングを必要とするアプリケーションでは、ゼブラフィッシュベースの心臓表現型解析のより広範な実装が制限されます12。

したがって、広く利用可能な機器を使用して心機能の信頼できる評価を可能にする方法論的アプローチの必要性が高まっています。既存の文献には、明視野または光学顕微鏡ベースのイメージングと手動または半自動測定の組み合わせを含む、そのような簡略化された方法の例が含まれています13,14。ただし、これらの手法は常に標準化されているわけではなく、プロトコル、タイミング、画像解析パラメータの点で研究グループによって異なることがよくあります。このばらつきは再現性を妨げ、研究間の比較価値を制限し、特に胚毒性学、薬理学、生態毒性学などの分野では、定量的な心血管エンドポイントが発生安全性の指標としてますます使用されています15。

これに関連して、ゼブラフィッシュは、 in vivoで発生性心毒性をスクリーニングするための貴重なモデルを提供します。規制当局や科学コンソーシアムは、特に構造奇形や致死性に先行する可能性のある心機能の微妙な変化を検出する能力を考慮すると、この分野におけるゼブラフィッシュの関連性をますます認識しています14。透明な胚により、鼓動する心臓を直接視覚化できるため、侵襲的な処置を必要とせずに、心臓のパフォーマンスを時間分解でライブで評価できます。さらに、ゼブラフィッシュの心臓解剖学的構造の単純さは、基本的なイメージング技術を使用して、チャンバーの寸法やストロークパラメータを含む心房および心室の動態の定量化を容易にします15。

この記事で説明されている方法の包括的な目標は、標準的な光学顕微鏡を使用してゼブラフィッシュ胚の心臓機能を評価するためのアクセスしやすく再現性のあるアプローチを提供することです。この技術は、単純なビデオ取得と事後画像分析に焦点を当てることで、高解像度イメージングと定性的観察スコアリングの間の方法論的ギャップを埋めることを目的としています。このプロトコルは、多様な実験室環境とリソースレベルに適応でき、特に心機能評価に焦点を当てた毒物学的、薬理学的、または遺伝学的研究に適用できます。

このプロトコルは、実用的な利点に加えて、一般的に使用される手法を単一の再現可能なパイプラインに組み合わせた統合された段階的なワークフローを提供することで、この分野に貢献します。同様のアプローチは文献に存在しますが、視覚的なドキュメントとのこのレベルの統合を提供するものはほとんどなく、より広範な採用と標準化をサポートする可能性があります。

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プロトコル

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ゼブラフィッシュの胚を含むすべての手順は、地元の倫理委員会によって承認された施設の動物のケアと使用ガイドラインに従って実施されました。ゼブラフィッシュの飼育と胚の操作は、科学的目的で使用される動物の保護に関する欧州指令2010/63 / EUに準拠して行われました。この研究で使用された試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. ゼブラフィッシュのメンテナンスと胚採取

  1. 成虫ゼブラフィッシュ(ダニオレリオ)を循環水槽システムで28°C±1°Cで14時間の光/10時間の暗サイクル下に維持します。
  2. ゼブラフィッシュに適した高タンパクの市販のフレークまたは粒状飼料で魚を1日3回与えます。
  3. 午後遅くに、ゼブラフィッシュの成体を透明なメッシュを備えた繁殖水槽に移し、水槽の底から魚を分離します。男性と女性の比率を2:3にし、取り外し可能な仕切りで一晩区切ってください。
  4. 翌朝、仕切りを取り外し、50〜100mLの冷たい水槽水を加えて産卵を引き起こします。
  5. 受精後(30〜60分以内)、胚の捕食を防ぐために、繁殖水槽から成魚を取り除きます。
  6. プラスチック製のパスツールピペットを使用して胚を収集し、E3胚培地で満たされた滅菌ペトリ皿に移します。
    注:E3胚培地は、ゼブラフィッシュの細胞外液のイオン組成を模倣する緩衝塩溶液です。約800 mLの超純蒸留水に580 mgのNaCl、27 mgのKCl、97 mgのCaCl2・2H2O、および163 mgのMgCl2・6H2Oを溶解してE3培地を調製します。1 N NaOHまたはHClを使用してpHを7.2に調整します。pHが調整され安定したら、蒸留水で総容量を1,000mLにします。溶液を0.22μmのメンブレンフィルターでろ過して滅菌します。真菌の増殖を防ぐために、1リットルあたり100μLの1%メチレンブルーを加えます。調製したE3培地を4°Cで保存し、使用前に室温まで温めます。
  7. 制御された明暗サイクル(14時間/ 10時間)のインキュベーターで胚を28.5°Cでインキュベートします。
    注:低酸素症や発達障害を引き起こす可能性のある過密状態を避けるために、ペトリ皿あたりの胚の数を制限します(たとえば、100 mm皿あたり50個)。
  8. 最適な発育条件を維持するために、E3培地を毎日交換してください。

2.形態学的に正常な胚の選択

  1. 受精後約6時間(hpf;受精からの経過時間)に、受精胚を新鮮なE3培地を含む清潔なペトリ皿に移します。
  2. 実体顕微鏡で40倍の倍率で胚を調べます。
  3. 以下を含む発達異常の兆候を示す胚は廃棄します。
    1. 凝固胚: 不透明または白色の外観、粒状の質感、および区別可能な内部構造の欠如によって識別されます。凝固は生存不能の兆候であり、通常、受精後最初の数時間以内に発生します。
    2. 発育の遅れ:予想される形態学的段階に進行していない胚(例:エピボリーの欠如または不規則な細胞配置)は除外され、生存率の障害を示唆しています。
    3. 卵黄嚢の異常: 発育の欠陥や浸透圧の不均衡を示す可能性のある卵黄嚢の破裂、不規則、または非対称を探します。
    4. 外部奇形:体軸がねじれている、細胞塊分布が不規則、または絨毛膜の異常な形状を持つ胚を除外します。
    5. 絨毛膜の完全性が悪い: 絨毛膜が虚脱、しわが寄った、または破裂した胚は、機械的ストレスまたは浸透圧ストレスを受ける可能性があるため、使用しないでください。
  4. (1)透明で対称的な体型、(2)滑らかな細胞層形成を伴う均一なエピボリー進行、(3)はっきりと見える胚盤葉と無傷の球状絨毛膜。
    注:6 hpfでは、形態学的に正常なゼブラフィッシュ胚はドーム型で、卵黄の上部を包み込む明確に定義された胚盤葉があります。細胞質は均一に分布しており、粒状の斑点がなく、断片化や凝集の兆候がないようにする必要があります。

3. 光学顕微鏡を用いた心臓画像診断

  1. 96 hpfで、E3培地を充填した35 mmのガラス底ペトリ皿に胚を個別にマウントします。
  2. E3培地で1.2%の低融点アガロースを調製し、37〜38°Cに予熱します。 ヒートブロックまたはウォーターバスを使用して温度を維持します。
  3. 各胚をアガロースに埋め込み、アガロースが固まる前に細い鉗子を使用して横方向にそっと方向付けます。
    注: 心房と心室の両方が同じ焦点面にあり、心臓がはっきりと見え、横方向を向いていることを確認してください。
  4. デジタルカメラを備えた倒立光学顕微鏡を使用して、ゼブラフィッシュ胚の心臓領域に特に焦点を当てた30秒の高解像度ビデオを記録します。40×または100×倍率でビデオをキャプチャして、心臓の構造と心拍を鮮明に視覚化します。
    1. 非圧縮または最小圧縮形式 (AVI や MOV など) で 30 フレーム/秒 (fps) のフレーム レートでビデオを録画して、画質を維持し、心臓の運動ダイナミクスを正確に分析できるようにします。このセットアップにより、心拍数、収縮リズム、チャンバー形態などの機能パラメータを詳細に評価できます。

4. 心機能の画像解析と測定

  1. ImageJでの手動測定
    1. ビデオをインポートします。ファイル > インポート > AVI を使用して ImageJ でビデオを開きます。必要に応じて、画像>スタック>画像をスタックに変換して、ビデオを画像スタックに変換します。
    2. 測定スケールを校正します。[ 分析]>[スケールの設定]を使用し、既知のフィールド直径(たとえば、10×対物レンズの場合は4 mm)を入力し、[グローバル]オプションを有効にして、すべての測定値にスケールを適用します。
    3. 関心領域 (ROI) を定義します。ROIツール(線、多角形、長方形)を使用して、収縮末期および拡張末期の心室軸の長軸と短心室軸をマークします(図1)。 Analyze > Tools > ROI Managerを使用してROIを管理します。
  2. 機能パラメータを計算するための直径と面積の測定(補足ファイル1)
    1. 式1を使用して、心室表面積を(楕円近似を使用)決定します。
      VA = ((D_L - D_S)/2) × π (1)
      ここで、DL = 長径、DS = 短径。
    2. 楕円体容積式を使用して ED および ES での心室容積を推定します (式 2)
      VV = (1/6) × π × D_L × D_S² (2)
    3. 式3と式4を使用して、フラクショナル面積変化(FAC)とフラクショナル短縮(FS)を計算します。
      FAC (%) = ((VAD - VAS) / VAD) × 100 (3)
      FS (%) = ((D_L - D_S) / D_L) × 100 (4)
      ここで、VAD = ED の心室面積。VAS = ES での心室面積。DDL = EDでの長軸。DSS = ES での短軸。
    4. 式 5 を使用して一回拍出量 (SV) を決定します。
      SV = VVD - VVS (5)
    5. 式6を使用して射出率(EF)を計算します。
      EF (%) = (SV / VVD) × 100 (6)
  3. ZembryoAnalyzerでの自動分析
    1. キャプチャしたビデオを起動してロードします。 ZembryoAnalyzer (https://github.com/darkopuflovic/ZembryoAnalyser で入手可能) を開き、[ファイル] > [ ビデオを開く ] を使用して目的のビデオをインポートします。
    2. 心臓領域の自動検出を実行します。[ ハートの検出 ] ボタンをクリックすると、ソフトウェアがビデオ フレーム全体の明るさの変動に基づいて関心領域 (ROI) を自動的に特定できるようになります。必要に応じて、長方形、楕円、または多角形ツールを使用して ROI を手動で調整します。
    3. 自動心拍数推定を実行します。検出されたROI内の明るさの変化をソフトウェアに分析させます。心拍数は、強度の周期的なピークを特定することによって計算されます。このアルゴリズムはしきい値フィルタリングを適用してノイズと誤検知を除去し、正確なビート検出を保証します。
    4. 結果をエクスポートします。心拍数データと対応する強度プロットは、 PDF>エクスポートまたはExcel>エクスポート を使用してエクスポートします。オプションで、ダウンストリームの統計処理のために生データを CSV または JSON 形式で保存します。
  4. 式7を使用して心拍出量(CO)を計算します。
    CO = SV × HR (7)

5. 毒物を用いた心毒性試験におけるプロトコルの適用性の評価

  1. 塩化カドミウムを秤量し、E3培地に直接溶解して最終濃度3 mg/Lにして作業溶液を調製します。
  2. 受精後24時間(hpf)にカドミウム溶液を含むペトリ皿に胚を移します。
  3. 胚をカドミウム溶液中で28°C±1°Cで96 hpfまで14時間の光/10時間の暗サイクルでインキュベートします。
  4. カドミウム溶液を毎日交換して、一貫した曝露を維持してください。
  5. 96 hpf で、前述のように、その後の心機能パラメーターの測定と分析のために、胚の高解像度心臓ビデオを記録します。
    注:このカドミウム曝露プロトコルを使用して、以前の研究16で説明したように、ゼブラフィッシュ胚の発生性心毒性をシミュレートします。

6. データ管理とレプリケート

  1. すべての測定値を構造化されたスプレッドシートに記録します。胚ID、治療グループ、および計算されたすべてのパラメーターを含めます。
  2. 統計的信頼性のために、グループごとに少なくとも20〜30個の胚が分析されるようにします。
    注:心臓領域のビデオ記録は、形態計測または機能測定の精度を損なうことなく、後で保存および分析できます。内部比較では、即時解析と遅延解析の結果は、主要な心臓パラメータ全体で一貫しており、遅延ビデオベースの評価の再現性を裏付けています。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルにより、心室サイズ、収縮性、一回拍出量、駆出率などの構造的および機能的パラメーターを含む、受精後 96 時間 (hpf) でのゼブラフィッシュの心臓発達の定量分析が可能になります。

図2 は、拡張末期(ED)および収縮末期(ES)におけるゼブラフィッシュ心室の代表的な明視野画像と、平均心室面積(VA)および体積(VV)測定値(n = 30胚)を示す対応する棒グラフを示しています。心室は楕円形に見え、リズミカルな収縮を示し、心機能の定量化を可能にする ED と ES の間に明確な寸法差があります。ED では、平均 VA と VV はそれぞれ 0.017 mm² ± 0.002 mm² と 0.0005 mm² ± 0.0001 mm³ でした。ES では、VA と VV は 0.012 mm²±0.002 mm²、および 0.0003 mm³ に減少し、正常な発達条件下での効果的な心室収縮を反映しています。

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルの重要なステップの1つは、受精後6時間(hpf)で形態学的に正常な胚を正確に識別し、選択することです。凝固、発達遅延、または構造異常の兆候を示す胚は、心血管測定の一貫性と解釈可能性を著しく損なう可能性があります。生存不能または奇形の胚を早期に切除することで、心臓の発達と機能を評価するための信頼できるベースラインが確保されます。イメージング中の胚の適切な向き、心臓がはっきりと見える横方向の位置を確保することは、再現性と解釈可能な結果を達成するためにも同様に重要です。

このプロトコルは、心周期の高コントラスト、高フレームレートのイメージングに依存し、その後、Zembryo Analyzer16などの無料で入手できるソフトウェアを使用した画像ベースの形態計測分析が続きます。このプラットフォームは、心室寸法、収縮性指数、一回拍出量、駆出率、心拍出量などの機能的心臓パラメータの堅牢かつ非侵襲的な定量化を可能にしますが、拡張末期と収縮末期の画像取得の正確な同期が必要...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、2025 年の研究活動の実施と資金提供のために、ベオグラード大学医学部との機関資金提供契約を通じて、セルビア共和国科学技術開発イノベーション省から資金提供を受けました。2025 年の機関資金の契約登録番号は 451-03-137/2025-03/200110 です。承認されたサブプロジェクトから生じるすべての出版物の謝辞にこの番号を含めるようお願いします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22 & micro;m膜フィルターミリポールSLGP033RS0.22 & micro;m膜フィルター
1 N HCl溶液シグマ・オルドリッチ320331pH調整のための塩酸溶液
1 N NaOH溶液シグマ・オルドリッチ72068pH調整のための水酸化ナトリウム溶液
成魚ゼブラフィッシュ(Danio rerio)地元の繁殖施設該当なしモデル生物
メッシュ付きの繁殖水槽//産卵のための成虫の分離
CaCl?·2H?Oシグマ・オルドリッチC5670塩化カルシウム二水和物、試薬級
塩化カドミウムシグマ・オルドリッチ202908曝露時には3 mg/Lで使用される毒性物質
商業用ゼブラフィッシュ飼料ミニグラン、ヌトリペット、ゴルニ・ミラノヴァツ/ゼブラフィッシュに適した高タンパクフレークまたは粒状飼料
デジタルカメラ(顕微鏡)浜松フォトニクスORCA-Flash4.0 V330fpsのビデオ撮影用カメラ
ヒートブロックエッペンドルフ5382000010温度制御加熱装置
ImageJソフトウェアNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/オープンソース画像処理ソフトウェア
逆光顕微鏡ニコンTi2-Eデジタルカメラ付き顕微鏡、40倍;そして100×目的
KClシグマ・オルドリッチP3911塩化カリウム、試薬グレード
低融点アガロース(1.2%)サーモフィッシャー・サイエンティフィック16520050胚の埋め込みのために
メチレンブルー(1%)シグマ・オルドリッチM9140E3培地への抗真菌剤添加
MgCl?·6H?Oシグマ・オルドリッチM9272塩化マグネシウム六水和物、試薬グレード
NaClシグマ・オルドリッチS9888塩化ナトリウム、試薬グレード
滅菌ペトリ皿(100mm)コーニング430167胚培養用のプラスチックペトリ皿
無菌ペトリ皿(35mm)マテック・コーポレーションP35G-1.5-14-C胚の取り付け用ガラス底ペトリ皿
超純度蒸留水ミリポールミリQリファレンス溶液調製のための水
ZembryoAnalyzerソフトウェアGitHub (Darko Puflovic)https://github.com/darkopuflovic/ZembryoAnalyser心機能解析ソフトウェア

参考文献

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Formal Correction: Erratum: Functional Cardiac Imaging in Zebrafish Embryos Using Standard Microscopy and Video Analysis: Applications in Environmental and Biomedical Research
Posted by JoVE Editors on 2/09/2026. Citeable Link.

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Zebrafish Cardiac ImagingCardiac Function AnalysisBrightfield MicroscopyVideo AnalysisVentricular DimensionsStroke VolumeHeart RateEjection FractionCardiac OutputEmbryonic Cardiotoxicity

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