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方法論記事

インビボ ゼブラフィッシュ幼生における視床下部ペプチ作動性ニューロンの全細胞パッチクランプ記録

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DOI：

10.3791/68943

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2025年8月22日

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Shanghai University, 2Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この記事では、無傷の幼虫ゼブラフィッシュにおける全細胞パッチクランプ電気生理学を使用して、視床下部ペプチ作動性ニューロンの電気的活動を in vivo で記録するためのプロトコルを紹介します。

要約

視床下部は、睡眠と覚醒、食欲、エネルギー恒常性、不安、うつ病、社会的相互作用など、生理学と行動のさまざまな側面を調節する古代の脳領域です。視床下部の特定のニューロン集団は、神経伝達物質と神経ペプチドの放出 を介して 効果を発揮します。全細胞パッチクランプ記録は、シナプス伝達と脳機能におけるこれらの因子の役割を研究するために不可欠なアプローチです。しかし、無傷の哺乳類は脳の奥深くに位置しているため、電気生理学的記録のために視床下部ニューロンにアクセスすることは困難です。その結果、視床下部ニューロンの固有の特性と生理学的機能についての理解は限られています。幼虫のゼブラフィッシュは、透明で小さいがよく保存された脊椎動物の脳により、視床下部ニューロンを研究するための有用な代替モデルです。ここでは、無傷の幼虫ゼブラフィッシュにおける視床下部ニューロンの in vivo 全細胞パッチクランプ記録のためのプロトコルを提示します。この技術を使用すると、視床下部のペプチダー作動性ニューロンから記録し、感覚刺激に対するこれらのニューロンの応答を調べ、下流のニューロンへの影響を調査できます。したがって、この実験手法は、無傷の動物における視床下部神経ペプチ作動性ニューロンの生理学的機能を研究するための有用なアプローチを提供します。

概要

ゼブラフィッシュ (Danio rerio) は、人気のある脊椎動物モデルとして神経科学研究で広く使用されており、いくつかの利点があります1.遺伝子と脳の構造の補完は哺乳類で高度に保存されており、豊富な行動レパートリーを持っているため、睡眠、不安、うつ病、社会的相互作用などの行動の根底にある遺伝的および神経細胞のメカニズムを研究するのに役立ちます2,3,4,5,6 .サイズが小さく、メンテナンスコストが低いため、神経精神疾患の治療を目的とした遺伝子または薬剤のハイスループットスクリーニングに最適です7,8。最後に、幼虫ゼブラフィッシュの光学的透明性と高度なライトシート顕微鏡技術、および複数の蛍光レポーターの利用可能性を組み合わせることで、ゼブラフィッシュは、脳全体にわたって細胞分解能でニューロンおよびアストログリアの活動を監視するのに特に適しています9,10,11。

腹側間脳の奥深くに位置するゼブラフィッシュ視床下部は、解剖学的および分子的に哺乳類の視床下部と保存されていますが、2〜3桁小さいため、視床下部機能を研究するためのより簡単なシステムを提供します12。視床下部ニューロンは、視床、脳幹、下垂体、終脳などの複数の脳領域と広範なシナプス接続を形成し、それを通じて生理学的恒常性、神経内分泌シグナル伝達、および自律神経行動を調節します13,14。このような行動および生理学の調節は、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)15に結合することによって作用する短鎖アミノ酸である神経ペプチドに大きく依存している。シナプスでの速効性アミノ酸神経伝達物質の放出とは対照的に、神経ペプチドは体積伝達を介してより長い距離にわたって拡散し、シナプス伝達とニューロンの興奮性に対するゆっくりとした調節効果を媒介する可能性があります16。

ゼブラフィッシュでの最近の研究では、全脳カルシウムイメージング、単一細胞RNAシーケンシング、ハイスループット行動解析、ニューロン回路マッピングなどの学際的なアプローチを通じて、視床下部神経ペプチドの多様な機能が明らかになりました4,12,17,18。これらの新たな技術は、細胞の多様性を大規模に特徴付け、分子メカニズムを回路レベルの神経ペプチド機能と橋渡しし、特定の行動の根底にある神経回路をマッピングする能力を変革しました19,20。しかし、これらのアプローチは、神経ペプチド機能の根底にある急速な生理学的ダイナミクスと正確なシナプスメカニズムを解決する能力に限界があります。

NeherとSakmannによって開発されたパッチクランプ技術は、その比類のない時間分解能と生物物理学的精度により、神経生理学を研究するためのゴールドスタンダードであり続けており、膜電位変動、シナプス電流、およびイオンチャネルダイナミクスの直接測定を可能にします21,22。この技術は、神経ペプチ作動性細胞の研究に特に非常に貴重であり、その特徴的な破裂パターンと神経調節の影響により、行動と恒常性におけるそれらの役割を完全に理解するために直接の電気生理学的測定が必要です15,16,23。

ここでは、これらのニューロンの深い解剖学的位置によってもたらされる技術的な課題にもかかわらず、幼虫ゼブラフィッシュ視床下部ペプチ作動性ニューロンの信頼性の高い全細胞パッチクランプ記録を可能にする最適化されたプロトコルを開発しました。この方法論は、これらの細胞の電気的活動への直接アクセスを提供し、視覚的および聴覚的刺激に対する細胞の応答の詳細な調査を可能にします(図1)。パッチクランプ電気生理学と光遺伝学を統合することにより、視床下部回路と下流ニューロンの間の機能的接続を正確に特徴付けることができ(図2 および 図3)、生理学的恒常性と行動制御における神経ペプチドの研究が容易になります。このアプローチは、神経科学研究における重大なギャップを埋め、視床下部ニューロン機能を生物物理学的、細胞的、回路レベルで同時に機械的に探索することを可能にします。

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プロトコル

すべての実験は、上海大学の施設ケアおよび使用委員会 (IACUC) (動物プロトコル YS 2025-169) およびカリフォルニア工科大学の IACUC (動物プロトコル 1836) によって承認されました。受精後5〜7日(dpf)のゼブラフィッシュにワムシを与え、実験に使用しました。発達のこの段階では、性別は決定されません。真珠層[mitfa(w2 / w2)]背景24 の成虫ゼブラフィッシュを繁殖に使用しました。

1.ソリューションとレシピ

  1. 5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、および0.33 mM MgSO4を含むE3培地を調製します。NaOHで溶液をpH 7.2に調整します。1ヶ月以内に使用するために常温で保管してください。
  2. 134 mM NaCl、2.9 mM KCl、2.1 mM CaCl2、1.2 mM MgCl2、10 mM HEPES、および10 mMグルコースを含む細胞外溶液を調製します。細胞外溶液の浸透圧は~290 mOsmol L-1です。NaOHで溶液をpH 7.8に調整します。1ヶ月以内に使用するために4°Cで保存してください。
  3. 100 mM K-グルコン酸、10 mM KCl、2 mM CaCl2、2 mM Mg-ATP、0.3 mM Na-GFP、10 mM HEPES、および10 mM EGTAを含む細胞内溶液を調製します。細胞内溶液の浸透圧は~280 mOsmol L-1です。溶液をKOHでpH 7.4に調整します。内部溶液100 μLをマイクロフュージチューブに分注し、-20°Cで保存して1年以内に使用します。
    注:Mg-ATPとNa-GTPの添加は、長期にわたる安定した記録に推奨されます。細胞内溶液は、シール形成を損なったり、ピペットの目詰まりにつながる可能性のある微粒子や微生物汚染物質を除去する0.22 μmの膜でろ過する必要があります。
  4. α-ブンガロトキシン:1 mgのα-ブンガロトキシンを1 mLのE3培地に溶解し、最終濃度は1 mg / mLにします。溶液20 μLをマイクロフュージチューブに分注し、-20°Cで保存して1年以内に使用します。
  5. 低融点アガロース:0.75 gのアガロースをガラス瓶内の50 mLのE3培地に最終濃度1.5%まで溶解します。アガロースが溶けて溶液が透明で均一に見えるまで、混合物を電子レンジで加熱します。溶かしたアガロースを42〜45°Cの水浴に維持し、1か月以内に使用します。

2.ゼブラフィッシュの準備と解剖

  1. 所望の導入遺伝子を含む単一のオスとメスの成魚、例えば Tg(hcrt:RFP) 魚25を交尾タンクに入れ、透明な仕切りで一晩分離します。2日目の朝、仕切りを外して魚の繁殖を可能にします。水槽の底で受精胚を採取し、午後の早い時間までに成魚を自宅の水槽に戻します。
  2. 0.0005%メチレンブルーを含むE3培地を含む直径9 cmのペトリ皿で胚を育てます。胚を28.5°Cのインキュベーターに14:10時間の明暗サイクルで入れます。E3 ソリューションを毎日交換します。
    注:E3培地中のメチレンブルーは、受精後3日(dpf)まで真菌の増殖を防ぐために使用されますが、メチレンブルーは発生の後期段階で細胞代謝とミトコンドリア機能に影響を与える可能性があるため、3dpfでE3培地のみに置き換えられます26。
  3. 落射蛍光実体顕微鏡で幼魚を、約3dpfから始まる最大倍率(~115倍)でスクリーニングします。選別を容易にするために、個々の魚を水滴(体のサイズよりも大きい)に入れます。3 dpf を超える魚の場合、0.01% トリカインを含む 3 mL の E3 培地を使用して魚を麻酔し、自発的な自発運動活動を抑制します。視床下部に明るい蛍光色素発現を持つ幼虫を収集します。
    注: トリカインを取り扱うときは、ニトリル手袋、安全メガネ、白衣を着用してください。過剰なトリカインは、動物のプロトコルに従って化学廃棄物として処分する必要があります。
  4. スクリーニング後、すぐにE3培地を使用してトリカインを洗い流し、これらの幼虫をインキュベーターに戻します。実験当日まで、ワムシを含む~5 mLの給餌液をペトリ皿に5 dpfから加えます。E3溶液を交換し、毎日ワムシを魚に与えます。
  5. 5〜7 dpfで、健康に見え、活発な移動を示す幼魚を集めます。ガラスピペットを使用して、それらを小さなシャーレ(直径3.5 cm)に移します。
  6. 魚の周りの水を取り除き、20 μLの1 mg / mLのα-ブンガロトキシンを魚に~30秒間加えます。次に、~3 mLのE3培地をペトリ皿に加えて薬剤を洗い流します。
    注: αブンガロトキシンを取り扱うときは、ニトリル手袋、安全メガネ、白衣を着用してください。過剰なαブンガロトキシンは、動物のプロトコルに従って化学廃棄物として処分する必要があります。
  7. シャーレをアルミホイルで覆い、魚を暗所に保ち、徐々に麻痺させます。
    注:α-ブンガロトキシンは、神経筋接合部に特異的に作用し、神経系に影響を与えることなく魚を麻痺させるアセチルコリン受容体遮断薬です。魚は麻痺後も環境刺激を感知でき、脳機能は正常です 9,27。
  8. 実体顕微鏡を使用して~15分後に麻痺の有無を確認し、正常な心拍と脳と体の強力な血液循環を示す麻痺した魚を選択します。
  9. 魚を、中央に直径10 mmの穴があり、穴を覆うために底に20 x 20 mmのガラスカバーガラスが接着された35 mmのペトリ皿であるカスタムメイドの記録チャンバーに移します。水を取り除き、~200 μLの1.5%低融点アガロースを加えます。
  10. 鉗子を使用して魚の背側をアガロースに上にして配置します(Dumont#5)。アガロースが完全に固まったら、細胞外溶液を加えてアガロースを覆います。アガロースが完全に固まるまで5〜10分かかります。
  11. マイクロナイフを使用して、魚の頭の上のアガロースを切り取ります。次に、次のステップでピペットが脳に進むために、~1 μmの先端開口部を備えたガラスマイクロピペットを使用して、視神経蓋と小脳の間の脳室の上の皮膚に小さな切開を行います。
  12. 割れたガラスピペットを使用して、解剖穴の周りの組織の破片や血栓を取り除きます。

3 全セルパッチクランプ記録

  1. 実験当日にホウケイ酸毛細管を使用して、チップ開口部が~1 μm、抵抗が~20 MΩの記録マイクロピペットを準備します。引っ張ったマイクロピペットは容器に保管し、汚染を防ぐためにその日に使用してください。
  2. コンピューター、CCDカメラ、モニター、アンプ、デジタイザー、マイクロマニピュレーター、および関連ソフトウェアの電源を入れます。ソフトウェアを開く前に、アンプとデジタイザの電源を入れる必要があります。
  3. 魚を電気生理学的リグに慎重に移動させ、そこでパッチクランプ実験を行います。
  4. 魚の健康と細胞生存率を維持するために、蠕動ポンプを使用して毎分~2 mLの酸素化細胞外溶液を魚に灌流します。
  5. X-Yトランスレーター(カスタムメイド)を使用して記録チャンバーを移動し、正立顕微鏡下で4倍対物レンズの視野に魚を中央に配置します。
  6. 60倍の対物レンズに切り替え、トランスレーターを動かして、ターゲットの視床下部を視覚化します。900 nmの赤外光でNomarski微分干渉コントラスト(DIC)を調整して、細胞を最適に視覚化します。
  7. 蛍光励起光源(水銀球など)をオンにして、視床下部の蛍光ニューロンを視覚化します。明るい蛍光を示し、細胞境界が明確な健康なニューロンを見つけ、多くの場合、細胞の健康状態が良好であることを示し、高品質の電気生理学的記録を促進します。
  8. 微細なマイクロローダーチップを使用して、記録マイクロピペットに細胞内溶液をゆっくりと埋め戻します。
  9. 電極をヘッドに取り付けますtage アンプの空気漏れを防ぐためにノブを締めます。ホルダーに接続されたチューブを介してマイクロピペットの内側にわずかな正圧(~150-200 mBar)を加え、空気溶液界面の汚染物質が電極先端に入るのを防ぎます。
  10. マイクロマニピュレーターを 高速 モードで使用してマイクロピペットを浴液に下げ、マイクロピペットチップを4倍対物レンズの下の解剖穴の上に配置します。
  11. マイクロマニピュレーターを 低速 モードに切り替え、対物レンズを60倍に変更します。ガラスピペットの先端を解剖穴を通して、2つの視蓋半球の間の心室に沿ってゆっくりと進めます。
  12. PICと蛍光の両方を使用して観察したターゲット蛍光細胞に向かってピペットチップを直交させます。ピペットチップが細胞膜に触れると、小さなくぼみが形成されます。
    注:視床下部などの深部組織を視覚化するために、900 nmのIR-DICを、IR-DIC用に微調整された偏光子およびアナライザーフィルターとともに使用します。
  13. チップがセルに接触すると陽圧が素早く解放され、セルがピペットとシールを形成することができます。同時に、ホルダーに接続されたチューブ を介して 短い負圧を加えます。
    注:ソフトウェアの抵抗値はすぐに1GΩ>まで増加し、高抵抗シールが形成されていることを示します。蛍光視床下部細胞が正常に記録されると、記録マイクロピペットの先端内に蛍光細胞膜があるはずです。
  14. セルを-60mVでクランプし、ベースラインとアクセス抵抗が安定するまで1〜2分間待ちます。短い電気パルスまたは口で穏やかな吸引を加えて、マイクロピペットチップの下の細胞膜を破裂させます。
  15. 電気生理学的ソフトウェア構成で容量性電流と直列抵抗を補償します。直列抵抗が100MΩより大きく、記録で20%>変動する場合は、データを破棄します。
  16. 電圧モードで1秒-10mVの電圧パルスを印加して、実験の前後に固有の膜抵抗を監視します。膜抵抗または膜電位が大きく変化する場合は、セルを廃棄します。
  17. セルが負の値に保持されたときの 電圧クランプ (VC)モードでの最初の記録。安定した記録を確立した後、必要に応じて 電流クランプ (IC)モードに切り替えます。
    注:ギガシールは破裂直後に安定しない可能性があるため、実験の開始時にVCモードでセルを-60 mVで数分間クランプすると、より良いセル状態を提供できます。
  18. 実験完了後、MATLABを使用して電気生理学的データの解析とスパイク検出をオフラインで処理します。
  19. 実験後、1.5%次亜塩素酸ナトリウム(NaClO)を使用して幼魚を安楽死させ、施設の動物管理プロトコルに従って処分します。

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結果

この原稿では、特にヒポクレチン(Hcrt)ニューロンに焦点を当てて、無傷のゼブラフィッシュの視床下部ニューロンを調査するための改良された in vivo 全細胞パッチクランプ記録技術を紹介します。

図1に示すように、私たちの方法論は、無傷の動物の脳の奥深くにあるこれらのニューロンからの直接電気生理学的記録を可能にし(図1A)、従来のin vitroスライスまたは解剖された脳製剤の制限を克服します。Hcrtニューロンは腹側間脳の奥深くに位置し、前脳、中脳、および後脳に広範な軸索突起があります(図1B)。in vivoサンプルを使用して、最初にHcrtニューロンのいくつかの電気生理学的パラメーターを測定しました(5つのニューロンの平均±SEM、静止膜電位:-53.26 ± 3.64 mV、膜抵抗:2.67 ± 0.22 GΩ、活動電位のベースライン周波数:...

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ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、幼虫ゼブラフィッシュ視床下部のペプチダー作動性ニューロンのパッチクランプ記録を可能にします。この調製には固有の困難さがあるため、パッチクランプ記録を成功させるには、ピペットの品質、アプローチ技術、溶液の純度、組織の健全性など、いくつかの重要なパラメーターに細心の注意を払う必要があります。これらの要因が総合的に、安定したギガシール記録を達成および維持する可能性を決定します。まず、標的細胞とピペットチップを明確に視覚化することは、ピペットセルの接触とギガシールの形成を成功させるために重要です。そのためには、コンデンサー、絞り、視野絞りを調整して顕微鏡の光路を細かく校正する必要があります。

ゼブラフィッシュの調製では、解剖部位と視床下部標的ニューロンの間の距離が長いため、ピペットの前進中に最適な陽圧を適用することで、空気と溶液の界面から破片を吹き飛ばすだけでなく、接触前に標的細胞表面を洗浄することもできます。体系的な最適化により、標的ニューロンを移動させることなく効果的な洗浄のバランスをとる1...

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開示事項

著者は利益相反がなく、開示するものは何もないと宣言しています。

謝辞

光遺伝学的実験用のデバイスの設計に協力してくださったダニエル・ワゲナール博士に感謝したいと思います。この研究は、国立衛生研究所からDAPへの助成金R35 NS122172とR34 NS126800、およびR.Z.への上海海外人材紹介プログラムによって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
増幅器軸索700B型
ホウケイ酸ガラス毛細管サッターBF100-58-10
CCDカメラダゲMTIIR-1000
電気生理学的記録用コンピュータ谷間プレシジョン3660
デジデータ軸索1440A型
ファラデーケージオーダーメイド
鉗子F.S.T.さんデュモン #5
孵卵器ロンロイGZP-150B型
メンブレンフィルターミリポアシグマSLGV004SL
マイクロナイフF.S.T.さん10318-14
目的オリンポスMplan 5X/0.1;UMPlanFI/IR 60倍/0.9W
蠕動ポンプ長いBT100-1L
ピペットホルダー成重H-7解剖用
引き手サッター機器P-97
蛍光スクリーニングおよび解剖用実体顕微鏡オリンポスSZX16
刺激A.M.P.I.(英語)マスター8
三次元マイクロマニピュレーターサッター機器MPC-325
直立赤外DIC顕微鏡オリンポスBX51WI型
防振テーブルTMCの61-541-06
ビデオモニターサンスポSP-717
ウォーターバスイーヘンHWS-12
X-Yトランスレータオーダーメイド

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