このプロトコルは、天然の海水接種物と自動閉ループ呼吸測定システムを使用して、好気性条件下で合成および天然の両方の潜在的に生分解性の材料をテストするための標準操作手順を説明しています。
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この記事について
サマリー
要約
生分解性材料の適切な評価は、標準的な試験方法の広範な採用にかかっています。このような方法は存在しますが、新しい研究所を設立するためのコストと立ち上げ時間によって制約され、検査能力は依然として限られています。この修正されたスクリーニングプロトコルは、ASTM International D6691-24a、定義された微生物コンソーシアムまたは天然海水接種物によって海洋環境におけるプラスチック材料の好気性生分解を決定するための標準試験方法に基づいています。海洋環境における材料の生分解を評価し、結果をポジティブおよびネガティブコントロールと比較し、アンモニウムとリン酸塩を添加した天然海水接種物を使用して栄養制限を防ぎます。材料は、この栄養豊富な海水にさらされ、30°Cでインキュベートされます。 Micro-Oxymax呼吸計は、バイオガス(二酸化炭素、CO2)の生成を経時的に測定します。鉱化(生分解)の程度は、バイオガス-炭素に変換された材料由来の炭素の割合を計算することによって決定されます。CO2生成率は、測定された炭素含有量または理論上の炭素含有量の割合として表され、時間の関数として報告されます。閉ループ呼吸測定システムは、材料ごとに3回に分けて調製されたさまざまな反応器容器、ネガティブコントロール(海水接種のみ)、およびポジティブコントロール(薄層クロマトグラフィーセルロース)に対応します。この方法は、海洋環境における物質を評価するために重要であり、地球規模の汚染防止に取り組んでいます。
概要
プラスチック廃棄物は海洋生態系と人間の健康に脅威をもたらします1.海洋中のあらゆる物質からの海洋ごみとともに、プラスチック汚染に対する懸念の高まりは、使用済み廃棄物管理の改善や海洋環境で容易に生分解される生分解性材料など、持続可能なソリューションの必要性を強調しています。数十年から何世紀にもわたって存続し、食物網に蓄積するマイクロプラスチックを生成する従来の合成プラスチックとは異なり2,3,4、炭素の有機成分である生分解性材料は、CO2およびメタン(CH4)に代謝されるか、微生物バイオマスに同化される可能性があります5。したがって、海水中の物質の生分解を理解することは、海洋ごみの環境への影響を定量化し、軽減するための鍵となります。
海洋環境における生分解は、光と栄養素の利用可能性、圧力、温度、微生物種の組成、ポリマーの物理化学的性質と構造などの時空間変数の相互作用によって制御され、これらはすべて分解の速度、程度、およびメカニズムを決定します6。これらの変数は、海洋環境をシミュレートする実験室ベースの生分解研究にとって大きな課題となります。この標準操作手順 (SOP) は、天然の海水を接種物として使用し、存在する その場の 微生物群集を捕捉し、海水溶解栄養素、粒子状炭素と窒素、クロロフィル、塩分濃度、pH、温度などの関連変数を記録します。この制御された実験室ベースのアプローチは、石灰化を促進するための条件を最適化し、 その場では実行不可能な直接の生分解測定を可能にします。ASTM International D6691-24a、定義された微生物コンソーシアムまたは天然海水接種物による海洋環境におけるプラスチック材料の好気性生分解を決定するための標準試験方法 (以下、ASTM D6691)、およびこの SOP は、材料の生分解性を評価するための迅速で信頼性の高いスクリーニング ツールとして開発されました7、8、9、10。
固有のポリマー生分解性のスクリーニング試験であるASTM D6691に準拠したこのプロトコルは、最適な条件、30°C、粉砕されたサンプルの最大表面積、および過剰な無機栄養素(窒素、130 mg/L、リン、23 mg/L)9 の下で材料の生分解性を評価し、無機化を促進し、栄養素の制限を防ぎます。スクリーニングテストは貴重な初期洞察を提供しますが、自然の海洋条件下での包括的な評価には、時間の関数として体重減少を測定する沿岸および深海の係留などのさらなるテストが必要になる場合があります。これらの沿岸および深海係留試験は、時間10,11の関数としての体重減少に基づいて生分解を推定するため、研究者は、より高価なその場沿岸および深海係留実験に行く前に、まず微生物の代謝を直接測定するこのスクリーニング試験を実行する必要があります。
ASTM D6691 標準試験方法は、海洋環境における非浮遊プラスチック材料の好気性生分解を評価するための手順を概説しています。この規格は、ASTM D7081 (海洋環境における非浮遊生分解性プラスチックの標準仕様、現在 ASTM から脱退し、再投票中) などの仕様規格とともに、実験用ポリマーを海洋生分解性として認証するためのフレームワークを提供します 9,12.一般に、仕様は、材料、製品、またはシステムが満たさなければならない要件を設定する ASTM International のコンセンサス規格です。これにより、海洋環境で生分解するように設計された材料が許容可能な期間内に生分解され、染料や可塑剤などの潜在的に有毒な添加剤が放出されないことが保証されます。
ASTM D6691に基づいて構築されたこのプロトコルは、天然海水中の材料(実験基質)の好気性生分解の速度と程度を定量化し、歴史的に海洋環境で生分解性であることが示されているポジティブ材料コントロール(すなわち、セルロース、クラフト紙、キチン/キトサン)を拡張します7,9,10.この方法の目的は、最適化された条件下で材料をスクリーニングして、材料が海洋環境で生分解されるかどうかを確認することです。接種物は、ASTM で概説されている特定のガイドラインに従って収集された海水中に存在する天然の微生物群集を活用します。これらのガイドラインでは、下水、化学物質の投棄、油流出などの汚染物質のない場所から収集された塩分濃度約 32 の海水を使用することが強調されています。この試験では、30°Cに維持された250 mLの反応器容器を備えた自動閉ループ呼吸計を使用し、それぞれに75 mLの海水と~20 mgの実験基質または対照基質8が含まれています。無機化作用(生分解)は、最初に添加された炭素量に対する生成された正味炭素バイオガス(CO2-C)の割合として表されます。この方法は、微生物バイオマスへの炭素同化を考慮していません。
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プロトコル
1. 海水の収集と特性評価
- 廃水、化学物質、油膜、または強い淡水の影響を受けない海水収集場所を特定します。
- 採取場所では、出所(場所、緯度と経度、採取の深さ、総深さ、温度)、サンプル採取の日付、および観察された水の状態を記録します。
- 複数の深さ、場所、サンプリングイベントから海水サンプルを収集して組み合わせ、多様な微生物群集の構成を促進します。
- 20 Lの酸浸出カーボイで、大きなNiskinボトルを使用して10 Lから20 Lの海水を集め、実験室に戻します。
- カーボイから、1 Lの全海水サブサンプルを酸浸出した1 Lの琥珀色の高密度ポリエチレン(HDPE)ボトルに移し、初期海水条件の粒子状炭素と窒素の実験室分析を行います。1 Lサンプルからろ過(0.2 μm、低窒素酢酸セルロース)し、60 mLのサブサンプルを酸浸出ポリエチレンボトルに回収し、溶存無機窒素および有機窒素(N)およびリン(P)成分を分析します。
- サブサンプルにプロジェクト名、サンプル ID、日付のラベルを付けます。インドフェノール法(4500-NH3)13,14を使用してNH4+濃度を測定し、単液法(4500-P E)13,15を使用してPO43-レベルを測定します。元素分析法16を用いて粒子状窒素と炭素を定量化する。Parsons et al.17(10150 A、10150 C)13 によって概説されたプロトコルに従ってクロロフィル a 濃度を測定します。
注:栄養素関連の水質分析はオプションです。このプロトコルは、分析が外部の研究所によって実施されることを前提としています。 - 好気性状態を維持するためにカーボイの開口部をゆるく覆い、海水を暗所で30°Cで最大7日間保管します。
注意: 海水は、エアポンプとバブラーシステムを使用して曝気することもできます。
2. 実験基板の調製
- ペレット、断片、および成形片の形をしている可能性のある10〜15 gの実験基質(すなわち、天然多糖類、木材、繊維板、ポリマー)を、20 mmの鋼球を含む50 mLのステンレス鋼製製粉砕ジャーに加えます。試験開始前に、実験基板を均一な粒子サイズ(0.10〜0.25 mm)に粉砕します。
- 粉砕ジャーを液体窒素に浸し、液体窒素の沸騰が止まるまで15分間脆化させます。
注意: 液体窒素は、火傷、怪我、凍傷を引き起こす可能性のある極低温液体です。使用前に、すべての安全データシートを読み、それに従ってください。適切な個人用保護具を着用してください。 - ミリングジャーをボールミルアタッチメントに固定し、機器パラメータを30Hzおよび2:30分に設定して、 開始を押します。試験の合間に液体窒素中で30秒冷却して4回繰り返します。材料がガラス転移温度が低いポリマーである場合は、必要に応じて追加の粉砕サイクルを実行して、均一な粒度分布を生成します。
- ASTM D1921-9618 に記載されているように、ふるい分析によってサイズの均一性を検証し、粒度分布を特徴付けます。予想される粒子サイズ範囲にまたがる標準的なふるいを組み立て、最小のメッシュサイズを底に配置します。粉砕したサンプルを上部のふるいに置き、ふるいスタックを機械式シェーカーに固定します。パーティクルがメッシュを通過するまで撹拌します。各ふるいから保持された材料を収集して計量し、粒度分布を計算します。比較可能性を維持するために、処理全体で同じふるいセットを使用します。データシートに分布を記録します。
- 元素分析により、粉砕された実験基板のサブサンプル乾燥重量あたりの炭素含有量を決定します16。
注:このプロトコルは、元素分析が外部の研究所によって実施されることを前提としています。
3. 海水のための追加の栄養素の調製
- 2 Lまたは4 Lのメスフラスコに海水を半分まで入れます。必要な総量は、実験で使用する反応器容器の数によって異なります。各原子炉容器には75mLの海水が入っています。海水源に高濃度の粒子状有機物が含まれている場合は、20μmのメッシュを通して海水をふるいにかけ、大きな粒子による不均一な汚染を排除します。
- 感度が0.001 gの精密天びんを使用して、計量パンを風袋引きし、2 Lまたは4 Lの海水に基づいて0.5 g/Lの塩化アンモニウム(NH4Cl)を計量し、次に0.1 g/Lのリン酸カリウム(KH2PO4)を計量します。
注意: 塩化アンモニウムは目の損傷や炎症を引き起こす可能性があります。使用前にすべての安全データシートを読んで従い、適切な個人用保護具を着用してください。
注: 塩化アンモニウムとリン酸カリウムの一塩基性廃棄物は、制度上の手順と地域の規制に従って、専用の有害廃棄物容器に廃棄してください。少量の希釈 (<1%) NH4Cl および KH2PO4 溶液は、施設および地元の廃水当局によって許可されている場合、大量の水で希釈した後、排水管処分の対象となる場合があります。 - 無機栄養素を2Lまたは4Lのメスフラスコに加え、海水でボリュームにし、撹拌バーを加え、すべての塩が溶けるまで撹拌プレートで撹拌します。溶液は透明で、目に見える微粒子がない必要があります。
- pHと塩分濃度を測定するために、栄養を補給した海水20〜30 mLをサブサンプルします。ステップ1.5の標準的な方法に従って、0.2 μmの低窒素酢酸セルロースフィルターを介して、さらに60 mLを酸浸出ポリエチレンボトルにろ過し、溶解した無機NおよびP分析を行います。
- 製造元の指示に従って、卓上メーターで pH と塩分濃度を測定します。栄養補助食品の酸性度により、フルストレングスの海水では約1単位のpH低下が予想されます。
4. 原子炉容器のインキュベーションの準備
- サンプル用の250 mL反応器容器と75 mLの容積ピペットを含むすべてのガラス器具を10%塩酸(HCl)で24時間酸浸出し、脱イオン水で3回すすいでください。
注意: HClは重度の火傷や目の損傷を引き起こす可能性があります。使用前に、すべての安全データシートを読み、それに従ってください。適切な個人用保護具を着用してください。
注:10%HCl廃棄物は、重炭酸ナトリウムで中和して、廃棄前に中性溶液を形成できます。施設の有害廃棄物手順および適用される地域の規制に従って中和を実行します。 - 酸浸出した250 mLの空の反応器容器、ポート付き蓋、シリコンシールOリング、スクリューキャップをオートクレーブで121°Cの実験日の15分間オートクレーブにオートクレーブします。
- サンプルバイアルに、サンプルまたは対照材料を受け取る容器に対応するチャネル番号/IDでラベルを付けます。
- 分析天びんを使用して、バイアル(キャップ付き)を風袋引きし、実験用または対照薬を20 mg(± 0.1 mg)計量し、完全な読み出し重量を記録して取っておきます。すべての実験と対照の反復について繰り返します。
注意: 重量が正確であることを確認してください。すべての基材を同じ日に同じ人で計量することをお勧めします。 - 容器を追加する前日にインキュベーターの電源を入れ、温度を30°Cに設定します。 製造元の指示に基づいて、システム診断とセンサーの校正を実行する少なくとも2時間前に、呼吸計の電源を入れてください。
注:インキュベーター温度が30±2°Cに達し、維持されると、反応器容器の準備を続行できます。 - サンプルID/反復と対応するチャンネル番号を記録して、データシートを準備します。反応器容器とキャップアセンブリ(ポート付き蓋/Oリング)をチャネル番号/IDの順に整理します(各容器に明確なラベルが貼られていることを確認してください)。O リングと蓋/ポートをチェックして、清潔で乾燥しており、無傷であることを確認してください。
5. 原子炉容器のセットアップ
- 酸浸出75 mL容積ピペットと電動ピペットコントローラーを使用して、75 mLの栄養補給海水を各リアクター容器に分注します。
- 各容器から使い捨てピペット1本分の海水(~3 mL)を取り出し、その隣の清潔な面に置きます。この海水は、粉砕された実験基質と対照基質を風袋バイアルからすすぐために使用されます(図1)。
- 基板を適切な容器に移します。
- 反応器容器の縁にOリングを置き、Oリングの上に2ポートの蓋を直接置きます。Oリングと蓋をネジキャップで所定の位置に固定します。
- 反応器容器を対応するガス/凝縮ラインに合わせます。ガスラインを容器の蓋の適切な入口/出口ポートにしっかりと挿入します。
- シェーカープラットフォームを0.05 x g (連続モード)にオンにします。目視検査を実施してすべての容器が安全であることを確認してから、インキュベーターのドアを閉めます。
- 気圧計を使用して、インキュベーターの温度(読み出しとサーミスタプローブ)と大気圧を記録します。
図1:容器のセットアップと準備。(A) 海水を加え、 (B) 試料を入れ、 (C) Oリング、金属蓋、スクリューキャップを投入します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
6.呼吸測定システムの起動
- 接続されたコンピューターでソフトウェアを起動します。システムが RS-232 接続を介してハードウェアを検出することを確認します。ハードウェアが見つからない場合は、デバイスが接続されていないことを示す通知が表示されるため、プログラムを再起動する必要があります。
- ソフトウェアのメインメニューで、[ ツール]>[診断]>[基本操作]を選択します。 [ログ ファイルの保存] をクリックします。 [バルブとセンサー]をクリックします。ソフトウェアは、各テストで PASS または FAIL を示します。両方のテストに合格した場合にのみ、CO2 センサーの2点校正に進みます。
7. CO2 センサーの校正
- ソーダ石灰カラムをサンプルポンプの背面パネルの窒素ポートに接続して、周囲のCO2 を除去してゼロ校正します。ソーダ石灰が白亜質で変色していないことを確認します (ピンクや紫など)。
- [ ツール]>[キャリブレーション]を選択します。右下隅にある [キャリブレーションの開始 ] をクリックします。プロンプトが表示されたら、フロントパネルのサンプルポンプコントロールを使用してサンプル流量を0.5 L/minに調整します。[ OK] をクリックします。
- タイマーがゼロになったら、CO2センサーの上下オフセットボタンを押して、画面上の読み取り値を0.000(またはできるだけ近い)に調整します。値は、許容範囲内にあると緑色に変わります。[次のガス] をクリックします。
- プロンプトが表示されたら、校正ガスボンベをサンプルポンプの背面パネルの校正ポートに接続します。校正ガス出口圧力を5 PSIGに調整します。OK をクリックする前に、ユーザーがフィッティングの近くでガスを聞いて感じることができるように、余分なガスがTフィッティングを通って流れることを確認します。
- タイマーがゼロになったら、CO2センサーの上下スパンボタンを押して、画面上の読み取り値を2.700(またはできるだけ近い)に調整します。値は、許容範囲内にあると緑色に変わります。[次のガス]をクリックして、キャリブレーションを完了します。
注: スパンガス濃度は、サプライヤーの分析証明書に記載されているように、認定された一次標準ガス混合物によって決定されます。
8. ソフトウェアでの実験セットアップ
- [ 実験] > [設定] を選択します。占有チャンネルに基づいて、ドロップダウンメニューから開始チャンネル番号と終了チャンネル番号を入力します。
- [更新しきい値 (%)] を 0.50 に設定し、[更新間隔] を [N.A.] に、[ウィンドウの更新 (秒)] を [自動] に設定します。
- [その他の設定] で、[センサーのパージ] チェックボックスをオンにします。自動体積測定、O2 消費正、およびオープンフローモードを有効にするが選択されていないことを確認します。
- サンプル間隔(時間)を8.00に設定し、実験期間(時間)をN.A.に設定します。必要に応じて、ガスと時間の単位を設定します。
- インキュベーション温度補正に一次温度プローブを使用する場合は、Manually Enter Chamber Tempsが選択されていないことを確認してください。[Venting Mode]のチェックボックスをオンにし、[Drain Mode]が選択されていないことを確認します。
- 嫌気性ベントモードが選択されていないことを確認してください。
- チャン バー設定を選択します。わかりやすいチャンネルラベル(例:NegCtrl_1、PosCtrl_2、Test_PHA_3)を入力します。
- [ユーティリティ] をクリックします。EN列のセルをクリックすると、占有チャネルのみが表示されます。[制限] をクリックします。ソフトウェアは、各チャネルのPASSまたはFAILを示します。すべての制限テストに合格した場合にのみ続行します。
- [ ボリューム] をクリックして、ヘッドスペース ボリュームを測定します。
注:ヘッドスペースの体積は、サンプルリアクター容器と閉ループチューブ内の空気の体積に等しくなります。容器のサイズとチューブの長さに対して容量が妥当であることを確認します。 - [漏れ] をクリックします。ソフトウェアは、ヘッドスペース・ボリュームに基づいて各チャネルのPASSまたはFAILを示します。チャネルに障害が発生した場合は、次の手順を実行します。
- O リングが清潔で粒子や繊維がなく、容器の縁と金属製の蓋の間に適切に装着されていることを確認してください。
- スクリューキャップを締めます。IN/OUT ポートと継手の接続とチューブを確認してください。摩耗または変形したチューブの端を鋭利な刃でトリミングし、きれいでまっすぐな切断を確保します。
- チャネルの故障が続く場合は、O リングをメーカーが指定した新しい互換性のあるものと交換してください。
- [ ボリューム] をクリックして、ヘッドスペース ボリュームを再測定します。[ 終了] をクリックします。[Chamber Setup]タブの[Volume]列が、占有されているすべてのチャンネルに対して入力されていることを確認します。
- メインメニューで、[ ツール]> [サービスメニュー]を選択します。インキュベーター温度を測定する一次温度プローブが30°C±2°Cで安定していることを確認します。
- [実行] をクリックします。日付を含むわかりやすい名前を使用してファイルを保存します (例: 030325PositiveControlValidation)。データシートにファイル名を記録します。
- [ 実験] > [表示] > [グラフ化] を選択して、リアルタイム プロットを表示します。バイオガス生産は、正の CO2 生産率として現れます。ネガティブコントロールはゼロ前後で変動する可能性があります。ただし、平均率はゼロまたは正である必要があります。
- システムに凝縮式エアドライヤーが含まれている場合は、チューブ内の目に見える結露の毎日のログを維持してください。必要に応じて、チューブを軽くかき混ぜて詰まりを解消し、排水を可能にします。
- 各サンプリング間隔の終了時にデータファイル(ASCIIテキストファイル)を更新します。温度、ガス%(ガス組成)、速度、蓄積などのデータは、実験中または最後に他のさまざまなソフトウェアパッケージにダウンロードできます。
- スプレッドシートで.datファイルを開くには、Excel を起動し、[ファイル] > [開く] を選択します。.dat ファイルを含むフォルダーに移動します。ファイルの種類ドロップダウンメニューで、[ すべてのファイル] を選択し、目的のファイルを選択します。
- テキストインポートウィザードのプロンプトが表示されたら、ファイルタイプとして「 区切り」 を選択し、「 次へ」をクリックします。
- [区切り文字] で、[カンマ] のチェックボックスをオンにします。他の区切り文字が選択されていないことを確認します。プレビューウィンドウには、データが列に区切られている必要があります。[完了] をクリックして、データをスプレッドシートに読み込みます。
- ファイルを.xlsx形式または.csv形式で保存して、さらに分析およびアーカイブします。
- 定期的にデータを分析して、治療の反復が一貫していることを確認します。治療反復の標準誤差は、平均累積 CO2 産生量の 5% 未満である必要があります。このしきい値に失敗するテストを繰り返します。
- インキュベーションが完了したら 、停止をクリックします 。
- インキュベーションは10〜90日続くことがあります。試験材料が生分解性が高い場合は、累積 CO2 生成が頭打ちになったらインキュベーションを終了するか、90 日経っても劣化が観察されない場合は延長します。
- 対照容器と試験容器の両方で少なくとも 5 日間正味ガス生成が観察されない場合は、実験を終了します。正味生産量は、5日間の生分解率の変化が1%未満であると定義されます。
- システムをシャットダウンするか、次の実験の準備をします。
9. 実験の分解
- インキュベーター温度を記録します(サーミスタプローブとインキュベーターの読み出し)。チューブを反応器容器から呼吸計から外し、精密天秤を使用して各サンプル反応器容器の重量を量ります。体重を記録して、潜伏期間中に体重/水分の損失が発生したかどうかを判断します。
- 各反応器容器から20〜30 mLの海水をサブサンプリングしてpHと塩分濃度を測定し、これらの値をステップ3.4で記録された値と比較して、インキュベーション中の安定性を検証します。ステップ1.5の標準的な方法に従って、0.2 μmの低窒素酢酸セルロースフィルターを介して、さらに60 mLを酸浸出ポリエチレンボトルにろ過し、溶解無機NおよびP分析を行います。
注:残留海水サンプルは、ろ過して残りのプラスチックを除去し、希釈して栄養塩濃度を下げ、機関および地域の規制に従って排水排水によって廃棄することができます。 - 容器、Oリング、金属製の蓋、スクリューキャップを水道水ですすいでください。ガラス器具を10%HCl酸浴に少なくとも24時間入れます。オートクレーブし、次のインキュベーションのためにアルミホイルで覆って保管します
10. 生分解率の計算
- 実験/対照基質中の全炭素を次のように計算します。
ここで、% C (炭素含有量) は元素分析によって決定されます。
注:実験基質および対照基質中の全炭素は、好気性インキュベーション中に以下の生化学的変換を受ける可能性があります。
C + O2 → CO2
実験/対照基質からの有機炭素の各ミモール(12 mg)は、1ミリモルのガス状CO2に変換できます。生成される1mmoleのガスは、標準温度および圧力(STP)で22.4mLを占めます。 - 生分解率を次のように計算します。
ここで、 Cg = 実験/対照基質およびネガティブコントロール(海水接種のみ)から生成される気体炭素の量、ミモール、 およびCi = 添加された実験基質中の炭素の量、ミロール。 - 生分解率の標準誤差 se を次のように計算します。
ここで、 n1 と n2 = それぞれ実験/対照基質とネガティブコントロール反応器容器の繰り返し数、 s = 生成される総ガス状炭素の標準偏差。 - 95%信頼限界(CL)を次のように計算します。
ここで、t = (n1 + n2 − 2)自由度を持つ95%の確率のt分布値、したがってn = 3 + 3 − 2 = 4です。
11. プロトコルの終了
- 計算とデータ分析が完了したら、プロジェクトまたは機関のデータ管理計画に従って、結果を最終レポートにまとめるか、共有データベースに入力します。すべての材料が施設の有害廃棄物ガイドラインに従って廃棄され、すべての機器が清掃および保管されていることを確認してください。
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結果
海洋生分解試験の結果を紹介します。二酸化炭素に変換された炭素の割合を測定することにより、各サンプルの生分解性を評価しました。累積、速度、およびパーセントの生分解プロットは、通常、ラグ期、その後に成長期、そして最終的にプラトーを示します。これらの段階のタイミングと大きさは、サンプル材料、実験条件、および海水接種物の組成によって異なります。
温帯湾から年間を通じて採取された海水は、水質成分にばらつきを示します。たとえば、微生物群集の多様性と存在量は、日々の季節の時間スケールで変化します19,20。さらに、海水接種物に不安定な有機炭素が存在すると、複製間で二酸化炭素生成の不均一性が生じる可能性があります。有機炭素、特に分解の遅い粒子状有機炭素は、微生物群集への炭素の利用可能性に影響を与える可能性があります21。この不均一性は生分解の程度には影響しない可能性が...
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ディスカッション
ポジティブコントロールのパフォーマンスは、テストの妥当性を決定します。理論上の最大ガス収率に基づいて、容易に海洋で生分解性のあるポジティブコントロール基質(分析グレードのセルロース、クラフト紙など)の最低70%の生分解が必要です。このベンチマークは、インキュベーション中の天然海水の良好な条件と十分な微生物活性を検証します。このしきい値を満たさない場合は、複製の準備、海水接種物の取り扱い(つまり、微生物群集の死滅)、または呼吸測定システムの機能に潜在的な問題があることを示しており、テストの無効化が必要です。
反復調製に関連するばらつきを最小限に抑えるために、すべてのサンプル材料は、平均粒子サイズが0.25 mm未満で、同じ物理的形状である必要があります。物理的形態の違い、つまり微生物の攻撃に利用できる表面積の変動は、石灰化の程度と速度に影響を与える可能性があります。基材を極低温粉砕する場合、粒度分布は一定であり、ふるい分け装置または粒度分析装置を使用して検証する必要があります。同等の物理的特性を持つ材料を標準化された...
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開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
著者らは、コロンバス・インストゥルメンツとマサチューセッツ大学ダートマス校海洋科学技術学部の生分解性研究所の技術サポートと施設へのアクセスに感謝しています。コロンバス・インスツルメンツのマイクロオキシマックス呼吸測定システムと研究所の立ち上げのための資金は、プリマロフトとマサチューセッツ・テクノロジー・コラボレーティブによって提供されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.2 & micro;M、47mmセルロースアセテートフィルター | 地盤工学ジオフィルター | 83100056 | ろ過海水 |
| 100 mL ボリュームピペット | サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、フィッシャーブランド | 13-650-2U | クラスA;酸を溶出させ、脱イオン水で洗い流す |
| 100-600 mL ガラスビーカー | サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、フィッシャーブランド | 50-194-5690 | クラスA;酸を溶出させ、脱イオン水で洗い流す |
| 20mmミリングボール | レッチ | 53680062 | ステンレス製です。低温製粉用のミリングジャーと組み合わせて使用されます |
| 50 mL ミリングジャー | レッチ | 14620216 | ステンレス製です。ミキサーミル400および20mmのミリングボールと組み合わせて、ポリマーの低温粉砕に使用されます |
| 75 mL ボリュームピペット | サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、フィッシャーブランド | 13-650-2T | クラスA;酸を溶出させ、脱イオン水で洗い流す |
| エアポンプとバブラーシステム | テトラ | 77846 | 抱卵前の平衡期における海水のエアレーション |
| アルミホイル | フィッシャーブランド | 01-213-100 | オートクレーブとクリーン保管用のカバー |
| 塩化アンモニウム(NH4Cl) | サーモフィッシャーサイエンティフィック、フィッシャーケミカル | A661-500 | 海水栄養素の急増 |
| 分析的均衡 | メトラー | AT201 | 実験基質と対照基質の計量 |
| オートクレーブ | トゥットナウアー | MFI-TTN-3870EA | 容器や蓋の組織を滅菌するために |
| ベース マイクロオキシマックス 120VAC シングルチャネル | コロンバス・インスツルメンツ | 0135-8000 | 陽性対照やポリマーの保存に使用されます |
| 校正ガス | エアガス | X03NI92P3000001 | 一次標準ガス混合気;2.7%の二酸化炭素、4.5%のメタン、バランスの窒素 |
| コンピューターモニター | デル | 210-BMKK | Dell Pro 24 Plus USB-Cハブモニター。コンピュータと併用してMicro-Oxymaxソフトウェアを動かす |
| 低温手袋 | サーモフィッシャーサイエンティフィック、テンシールド、クライオグローブ | 11-394-306 | 液体窒素の取り扱いに使用されます |
| ダイヤル温度計 | サーモフィッシャーサイエンティフィック、H-B計器デュラック | 13-201-433 | 収集時の海水温度に合わせて校正された温度計 |
| 使い捨てピペット | サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、フィッシャーブランド | 13-711-7M | 容器の側面をすすぎて材料を解放します |
| ENC52 温度・光制御エンクロージャー | コロンバス・インスツルメンツ | 4740-4054 | 温度と光の条件を維持してください |
| フラスコ・トング | サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、フィッシャーブランド | S07387 | 液体窒素で製粉用の瓶を扱うために使われます |
| フラスコ、250 mL | DWKライフサイエンス | 14395-250 | 試料リアクター容器 |
| プラグ式クロージャー付きのガラスシェルバイアル | サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、フィッシャーブランド | 03-339-26D | サンプル保存 |
| H22PX携帯型深度測定器 | ウェスト・マリーン、ノークロス・マリーン | 6849368 | 海水収集サイトの深さを決定 |
| 携帯型GPS 73 | ガーミン | 10-01504-00 | 海水収集場所の特定に用いられます |
| HDPEパン | サーモ・サイエンティフィック、ナルゲン | 13-359-26 | ガラス器具を酸性で溶出させるために使われました。10%塩酸溶液で |
| 塩酸(酸性水溶液) | サーモフィッシャーサイエンティフィック、フィッシャーケミカル | A144-212 | 認定ACS Plus、36.5%から38.0%。CO2センサーの点検と酸浸出ガラス器具 |
| 層流フード | 航空科学 | フロー-48-A | 試料準備中の空気中の汚染物質を最小限に抑える |
| ラージ・ニスキン;ベータプラスボトルのみ - 8.2L横型、PVC | サイエンス・ファースト | 3-1980-H65 | 桟橋や船からの海水収集用 |
| 液体窒素パン | サーモフィッシャーサイエンティフィック、ベルアート マジックタッチ2 | 11-999-063 | 液体窒素を保持し、nbsp; |
| 液体窒素輸送容器、10リットル | サーモ・サイエンティフィック | TY509X2 | 液体窒素の保存と供給 クリオミル |
| 液体窒素、工業用グレード、22 PSI | エアガス | NI 180LT22 | ポリマーの脆化やミルに使われました |
| 機械式ふるいシェーカー | ハンボルト、グレンジャー | 5DPL6 | 粒子サイズ分布のためのふるい解析 |
| マイクロオキシマックス | コロンバス・インストゥルメンツ | 7395-113-D64 | シリコンシールされたOリング、金属製ポート(3つの継手付き)、GL45スクリューキャップ |
| マイクロオキシマックス 10チャネル拡張インターフェース | コロンバス・インスツルメンツ | 0135-8101 | 呼吸計システムコンポーネント |
| マイクロオキシマックス呼吸計(3% CO2センサー) | コロンバス・インスツルメンツ | 0135-8403 | 非分散赤外線 |
| ミキサーミル400 | レッチ | 207450001 | ミキサーミル400。高分子の低温粉砕に使用 |
| モーター式ピペットコントローラー | エッペンドルフ | 4430000018 | サンプル原子炉容器への海水移送 |
| ナローマウスアンバー HDPE ラボ品質ボトル、1リットル | サーモ・サイエンティフィック、ナルゲン | 02-923-5 | 離散的な全水海水サンプル |
| ナイロンメッシュ 20ミクロン | ELKOフィルタリング社 | 41718 | 生の海水をふるいにかけて、より大きな異質粒子を除去するために使用されます |
| 屋外軌道シェーカー | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | SK4000 | インキュベーション中は原子炉容器の軌道運動を維持する |
| OptiPlex 5090 小型フォームファクターコンピュータ | デル | C0SL03 | DesktomコンピュータはかつてMicro-Oxymaxソフトウェアを実行していました。 |
| pH/耐久度計 | メットラー・トレド、セブンエクセレンス S470-ベーシック | 30046252 | ベンチトップpH/導電率計で初期および最終海水接種物を測定 |
| ポリエチレンボトル、60 mL | コルパック | PLC-03564 | 離散的なろ過海水サンプル |
| リン酸カリウム一塩性(KH2(PO4)) | サーモフィッシャーサイエンティフィック、フィッシャーバイオリエージェント | BP362-500 | 海水栄養素の急増 |
| 精密バランス | サルトリウス | Practum2102-1S | 容器の空頭と全重を計量するために |
| ラウンドカーボイ、20L | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 02961A | 海水貯蔵のための酸浸出 |
| 安全ゴーグル | サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、フィッシャーブランド | 19-181-513 | |
| スクープラ | サーモフィッシャーサイエンティフィック、フィッシャーブランド、スクープラ | 01-257-567 | ステンレス製のラボスクープラ |
| ふるい | アドバンテック、グレンジャー | 40PR18-40PR55 | ステンレス製の篩です。篩の数やサイズは、試験対象の材料によって異なります。 |
| シグマセルセルロース、タイプ101 | シグマ・オルドリッチ | 435236-250G | 粉末、ポジティブコントロール基質 |
| 炭酸水素ナトリウム | サーモフィッシャーサイエンティフィック、フィッシャーケミカル | S233-500 | CO2センサーの点検 |
| 硫酸ナトリウム、無水、98% | サーモフィッシャーサイエンティフィック、サーモサイエンティフィックケミカルズ | AAA1793336 | CO2センサーの点検 |
| 温度計/サーミスタプローブ | フィッシャーブランド | 15-079-700 | インキュベーター温度を確認してください |
| 追跡可能な精密ダイヤル気圧計 | フィッシャーブランド | 14-648-51 | 実験開始時の大気圧を記録する |
| ビクター中型水素、メタン2段レギュレーター、CGA - 350 | エアガス | VIC0781-3559 | 校正ガスレギュレーター |
| ボリュームフラスコ、2リットル | サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、フィッシャーブランド | FB4002000 | クラスA;酸を浸出させ、脱イオン水で洗い流します。栄養塩を噴射した海水の準備に使われます。 |
| 計量パン | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 02-202-101 | ポリエチレン |
参考文献
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