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方法論記事

無細胞カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスによる De Novo 溶解性感染の確立と定量化

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DOI:

10.3791/68959

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2025年8月15日

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1Program in Molecular and Cellular Oncogenesis, The Wistar Institute, 2Section of Infection and Immunity, Herman Ostrow School of Dentistry, University of Southern California

この記事について

サマリー

このプロトコルは、BAC16由来のビリオンを使用して、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスのde novo溶解感染をモデル化するin vitroシステムについて説明しています。この方法により、ウイルスの早期複製と播種の調査が可能になります。感染性ウイルスの産生は、GFPベースの感染単位アッセイとカプセル化されたウイルスゲノムのリアルタイムPCRによって定量化されます。

要約

カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス (KSHV) は、複数のヒト悪性腫瘍に関与するガンマヘルペスウイルスであり、ウイルスの播種、免疫回避、および疾患の病因に寄与するプロセスである一次感染中に溶解複製を受ける可能性があります。しかし、de novo 溶解感染のための堅牢な in vitro システムが不足しているため、初期の感染イベントに関する洞察は限られています。ここでは、KSHV細菌人工染色体16(BAC16)再活性化iSLK生産細胞に由来する無細胞ビリオンによる感染の標的としてヒト結腸直腸癌HCT116細胞を使用する扱いやすいプロトコルを提示します。このモデルは、ウイルス侵入、ゲノム送達、溶解遺伝子発現、子孫生産など、一次感染における重要なステップを要約しています。感染は脊髄眼科を介して同期され、一時的に監視されます。ウイルス産生は、緑色蛍光タンパク質(GFP)ベースの感染単位(IU)アッセイとカプセル化されたウイルスDNAのqPCRからなるデュアル読み出しシステムを使用して定量化されます。これらのアプローチにより、ウイルス複製速度論の詳細な分析が可能になります。現在のプロトコルは後期イベントの検出に焦点を当てていますが、このシステムは、修正されたサンプリング時点を通じて感染の初期段階を研究するために適応できます。このシステムは、生産的なde novo感染のための再現性がありスケーラブルなプラットフォームを提供することで、KSHV研究における方法論的ギャップに対処し、ヘルペスウイルスと宿主の相互作用と抗ウイルス戦略の機構研究をサポートします。

概要

カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス (KSHV) は、カポジ肉腫 (KS)、原発性滲出性リンパ腫 (PEL)、多中心性キャッスルマン病 (MCD)、および KSHV 炎症性サイトカイン症候群に病因学的に関連しているヒト ガンマヘルペスウイルスです 1,2。すべてのヘルペスウイルスと同様に、KSHVは潜伏期と溶解期を交互に繰り返す宿主に生涯にわたる持続性を確立します。ほとんどの感染細胞では潜伏が優勢ですが、サブセットは、一次(de novo)感染中または潜伏期からの再活性化によって溶解サイクルに入る可能性があります3。溶解複製には、ウイルス遺伝子発現の秩序あるカスケードが含まれ、ゲノム複製、ビリオン集合、および子孫の放出で最高潮に達します。このプロセスは、ウイルスの拡散と疾患の進行にとって重要です4,5。KSHV溶解複製の初期の研究は、異種系における個々のウイルス遺伝子の異所性発現に依存することがよくありました。有益ではありますが、これらのアプローチは、本物の感染中に存在する調整された遺伝子調節とウイルスと宿主の相互作用を捉えていませんでした。完全長KSHVゲノムを保有する組換え細菌人工染色体(BAC)であるBAC-16の開発により、複製および感染性ビリオン産生の能力を保持する遺伝子操作可能なウイルスの生産が可能になりました6。このシステムは、完全なゲノムのコンテキスト内でのウイルス遺伝子の標的変異誘発と機能解析を容易にします。それ以来、BAC-16またはKSHVで潜伏感染したiSLKまたはBCBL-1細胞を使用する再活性化モデルは、KSHV溶解複製を研究するための標準となっています。これらのシステムは、ドキシサイクリン (Dox) や酪酸ナトリウム 7,8 などの薬剤を使用して、溶解サイクルの同期誘導を可能にします。しかし、再活性化モデルは、ウイルスの侵入、細胞内輸送、潜伏期と溶解複製の間の初期決定など、初期の感染ステップを回避するため、一次感染のダイナミクスを完全に要約することはできません。

De novo 感染モデルは、これらのギャップに対処するための補完的なフレームワークを提供します。ヒト内皮細胞や歯肉上皮細胞などのいくつかの初代細胞モデルは、KSHV de novo感染後の溶解複製をサポートすることが示されています3,9,10,11。しかし、寿命が限られ、コストが高く、遺伝子操作への適合性が低いため、機構研究の再現性と拡張性が制限されます。このプロトコルでは、HCT 116ヒト結腸直腸癌細胞株を使用したKSHVのde novo溶解感染の扱いやすくスケーラブルなモデルについて説明します。HCT116 細胞は KSHV の自然な標的ではありませんが、感染に対する強力な耐性を示し、機構研究やハイスループット アプリケーションに適した安定したコスト効率の高いプラットフォームを提供します。KSHVの培養におけるプラーク形成能力が限られているため、GFPレポーターを組み込んだBAC16システムを利用して、感染用の無細胞ウイルスを生成します。これにより、感染細胞の直接視覚化と、GFPベースの感染単位(IU)アッセイによる感染力価の定量化が可能になります12。これを補完するために、ビリオン関連 DNA は DNase 処理後の定量的リアルタイム PCR (qPCR) によって測定され、カプセル化されたウイルスゲノムを検出するための高感度な方法を提供します。これらのアッセイを組み合わせることで、一次感染中の溶解複製ダイナミクスの時間的に分解された定量的分析が可能になります。

このプロトコルは、KSHV de novo 溶解感染を in vitro でモデル化するための信頼性と柔軟性のあるプラットフォームを提供し、ウイルスのライフサイクルにおける初期イベントの解剖を促進し、遺伝子機能と抗ウイルス活性の評価を可能にします。

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プロトコル

KSHV は、バイオセーフティ レベル 2 (BSL-2) のヒト病原体として分類されています。感染性物質を含むすべての手順は、認定されたBSL-2バイオセーフティキャビネットで実行します。各手順の前後に70%エタノールで作業面を除染します。すべての廃棄物は、施設のバイオセーフティ規制および WHO BSL-2 ガイドラインに従って処分してください。完全なワークフローの概略図を 図 1 に示します。この手順には、再活性化された iSLK 細胞からの無細胞 BAC16 由来 KSHV の生成、HCT 116 細胞の de novo 感染、感染単位 (IU) アッセイによるウイルス力価の定量、およびビリオン関連ウイルス DNA の qPCR 分析が含まれます。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1. 無細胞BAC16由来KSHVの製造

  1. ワイドタイプ(WT)KSHV BAC 16(iSLK-BAC16)を約80%のコンフルエントで保有するDox誘導性iSLK細胞の5つのT75フラスコを播種します。加湿した5%CO 2 インキュベーターで37°Cで24時間インキュベートします。
  2. 各フラスコに1 μg/mL Doxおよび1 mM酪酸ナトリウムを添加することにより、溶解再活性化を誘導します。72〜96時間インキュベーションを続けます。
  3. 位相差顕微鏡で細胞を毎日監視します。細胞の>90%が丸み、フラスコ表面からの剥離、および/または目に見える溶解を示すと、強力な溶解反応を示す細胞変性効果(CPE)の特徴を示したら、上清を採取します。上清採取後、10%漂白剤を使用して溶解誘導されたiSLK-BAC16細胞を除染し、廃棄します。
  4. 収集した上清を1,500 x g で4°Cで10分間遠心分離し、破片を除去します。ペレットを乱すことなく、0.45 μmのポリエーテルスルホン(PES)メンブレンフィルターを通して清澄化した上清をろ過します。
  5. ろ過した上清を超遠心チューブに移します。SW28ローターを使用して、25,000 x g で4°Cで3時間遠心分離することにより、ウイルス粒子をペレット化します。
  6. 上清を10%漂白剤に慎重に捨てます。ウイルスペレットを1 mLの無血清ダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)に再懸濁します。
  7. 再懸濁したウイルスを滅菌スクリューキャップ1.5 mL微量遠心チューブに分注します。アリコートは使用まで-80°Cで保管してください。SLK細胞におけるGFPベースの感染単位(IU)アッセイを使用して、ウイルスストックの感染力価を決定します(ステップ3を参照)。

2. HCT116細胞の De novo 感染

注:de novo KSHV感染後のHCT116細胞で溶解複製を効率的に開始するには、感染の多重度(MOI)が重要です。この条件により、外因性刺激を必要とせずに、堅牢なウイルス遺伝子発現と生産的な複製が可能になります。ビリオン産生に対するMOI依存性効果を示す代表的な結果が、 補足図1Aに示されている。

  1. 12ウェル組織培養プレートに1ウェルあたり1 x 105 個のHCT116細胞を播種します。加湿した5%CO 2 インキュベーターで37°Cで24時間インキュベートします。
  2. 濃縮ウイルスストックを予熱した無血清DMEMで最終容量250 μLに希釈し、感染多重度(MOI)を10にします。
  3. 各ウェルから培地を吸引します。250 μLの希釈ウイルスを細胞に直接加えます。
  4. プレートを1,500 x g で30°Cで1時間遠心分離して、感染を同期させます(脊髄眼科)。すぐにプレートを37°Cのインキュベーターに移し、さらに1時間インキュベーションを続けます。
  5. 接種物を吸引し、予熱したPBSで細胞を3回洗浄して、残留ウイルスを除去します。各ウェルに1 mLの完全DMEMを加えます。
  6. 感染後36時間、60時間、および96時間に蛍光顕微鏡で感染細胞におけるGFP発現を監視します。各時点で、各ウェルから1 mLの培養上清を収集します。
    注:上清採取後、KSHVに感染したHCT116細胞は、実験目的に基づいて、RNA抽出、タンパク質分析、免疫蛍光、フローサイトメトリーなどの下流アプリケーションのために保持できます。
  7. 収集した上清を1,500 x g で4°Cで10分間遠心分離し、細胞破片を除去します。清澄化した上清を新鮮なチューブに移します。液体窒素でスナップフリーズし、-80°Cで保存してさらに分析します。

3. 感染単位アッセイ(IUアッセイ)

注:SLK細胞はKSHVの侵入を許容し、早期の溶解遺伝子発現をサポートします。このアッセイは、連続希釈されたウイルス含有上清への曝露後の感染SLK細胞におけるGFP発現に基づいて感染単位を定量化します。

  1. 感染の24時間前に、96ウェルプレートに1 x 104 個のSLK細胞を1ウェルに播種します。細胞が均一に分布し、感染当日に~60%〜70%の合流に達するようにします。
  2. 連続二重希釈用の 9 本の 1.5 mL マイクロ遠心チューブにラベルを付けます: チューブ 1 (原液、1:1)、チューブ 2 (1:2)、チューブ 3 (1:4)、チューブ 4 (1:8)、チューブ 5 (1:16)、チューブ 6 (1:32)、チューブ 7 (1:64)、チューブ 8 (1:128)、チューブ 9 (1:256)。
  3. 200 μLのウイルス上清をチューブ1に加えます。100 μLの予熱した無血清DMEMをチューブ2から9の各チューブに加えます。希釈シリーズを開始するには、チューブ1からチューブ2に100 μLを移し、上下にピペッティングして完全に混合します。次に、100 μLをチューブ2からチューブ3に移し、チューブ9でこのプロセスを順番に繰り返し、各ステップで完全に混合します。
    注:各チューブには100 μLの最終容量が含まれている必要があります。すべての希釈を3回に分けて実行します。
  4. SLK細胞から培地を吸引します。各ウイルス希釈液100 μLを指定されたウェルに加えます。合計 27 ウェルを使用します (1:1 から 1:256 までの希釈ごとに 3 ウェル)。
  5. 96ウェルプレートを1,500 x g で30°Cで1時間遠心分離し、バイアルの吸着を促進します。プレートを37°CのCO 2 インキュベーターにさらに1時間移します。
  6. 接種物を取り除き、100 μLの完全DMEMを各ウェルにそっと加えます。プレートを37°Cで24時間インキュベートします。
  7. 細胞を採取し、フローサイトメトリーでGFP発現を解析します。ウェルあたりのGFP陽性細胞の数を記録します。
  8. 次の式13を使用して、mLあたりの感染単位(IU / mL)を計算します。
    IU/mL = [(ウェルあたりの GFP 陽性細胞の数)/ 接種量 (mL)] x 希釈係数。検出可能なGFP陽性細胞で最後の希釈液を使用して最終的なウイルス力価を決定します

4. qPCRによるカプセル化されたウイルスゲノムの定量化

  1. DNase Iを最終濃度100 U/mLの400 μLの清澄化上清に添加します(上清の清澄化と破片の除去については、ステップ1を参照)。37°Cで15分間インキュベートして、カプセル化されていないウイルスおよび細胞DNAを消化します。DNase処理の特異性と有効性を示す代表的な結果を補 足図1Bに示します。
  2. EDTAを最終濃度50 mMまで添加して、DNase反応を停止します。75°Cで15分間インキュベートして、DNase Iを不活性化します。
  3. メーカーのプロトコルに従って、DNA Mini Kitを使用してDNase処理された上清からウイルスDNAを抽出します。
  4. ウイルスDNAを30 μLの溶出バッファーで溶出します。各qPCR反応に5 μLの溶出DNAを使用します。
  5. 以下のプライマーを用いて、KSHVオープンリーディングフレーム73(ORF73)を増幅する:フォワード:5'-CCGAGGACGAAATGGAAGTG-3';リバース:5'-GGTGATGTTCTGAGTACATAGCGG-3。
  6. SYBR Green Master SuperMixを使用してqPCR反応を3回調製します。サイクル条件を次のように設定します。初期変性:95°Cで3分間。増幅:95°Cで10秒、52°Cで30秒、72°Cで30秒の40サイクル。融解曲線解析 アンプリコン特異性の標準ランプ
  7. BAC-16由来のウイルスDNAを10倍に連続希釈して、反応ごとに109 から101 コピーの範囲の標準曲線を生成します。入力コピー数の対数10に対してCt値をプロットし、アッセイの直線性を評価します。代表的な標準曲線を 補足図1Cに示します。
  8. Ct値を標準曲線と比較することにより、ウイルスゲノムコピー数を決定します。結果を正規化し、上清 mL あたりのウイルス DNA コピーとして報告します。

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結果

感染性ウイルスの力価を定量化するために、iSLK-BAC16細胞の溶解再活性化から72時間後に採取した上清を2倍に連続希釈し、SLK細胞に感染させました。各希釈でのGFP陽性SLK細胞の数を 図2Aに示し、対応する感染単位(IU)/mLを計算して 図2Bに示しました。 de novo 溶解複製の効率を評価するために、HCT 116細胞を10のMOIでiSLK-BAC16由来のビリオンに感染させました(図2C)。感染後36、60、および96時間で上清を収集し、SLK細胞に適用して感染性ウイルスの産生を評価しました。GFP蛍光イメージング(図2D)およびフローサイトメトリー(図2E)は、感染性の時...

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ディスカッション

KSHVのde novo溶解感染のモデル化は、ほとんどの寛容細胞型で潜伏期を確立するウイルスの強い傾向によって長い間妨げられてきました。内皮細胞や口腔上皮細胞などの特定の初代細胞は、de novo感染後の溶解複製をサポートすることが示されていますが9,10、それらの寿命の制限、高コスト、および培養維持の技術的困難により、再現性と拡張性が低下します。最近の研究では、一次 KSHV 感染の結果が細胞および環境的状況に大きく依存することがさらに示されています。たとえば、低酸素症は内皮細胞におけるHIF-1αの蓄積を介して溶解性感染を促進しますが、FOXQ1発現などの上皮転写因子は口腔上皮細胞における溶解性遺伝子発現を引き起こす可能性があります10,15。これらの発見は、感染の運命を調節する上...

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開示事項

利益相反は宣言されていません。

謝辞

著者らは、組換えKSHVを産生するiSLK-BAC16細胞株を共有してくださったJae U. Jung博士(クリーブランドクリニック)に感謝したいと思います。グラフィックデザインは、著者がライセンスを所有している BioRender.com を使用して作成されました。この研究は、NIHがC. Liang(PI)にR21 DE028256、R01 CA140964、およびR01 CA262631を、Q. ZhuにWistar Science Accelerator Postdoctoral Awardを授与しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.45 & マイクロ;m ポリエーテルスルホン (PES) フィルター  VWRの76479-020
バイオレンダーバイオレンダー該当なしグラフィックデザインは
BioRender.com で作成され、著者はライセンスを取得しています
CFX Opus 96 リアルタイムPCRシステムバイオラッド184-5072
DMEMの完了ダルベッコの改良イーグル培地(DMEM;Sigma-Aldrich) に 10%(v/v) ウシ胎児血清 (FBS;Gibco)、2 mM L-グルタミン (Gibco)、および 100U/ml ペニシリン-ストレプトマイシン (Pen-Strep;GenClone)を呼び出します。
DNase IニューイングランドバイオラボM0303S
ドキシサイクリンシグマ・アルドリッチD9891
LSR II 18フローサイトメーターBDバイオサイエンス該当なし
PerfeCTa SYBR グリーン マスター スーパーミックスクアンタビオ95054-02K
QIAamp DNAミニキットキアゲン56304
酪酸ナトリウム(NaB)シグマ・アルドリッチB5887
ウルトラピュア 0.5M EDTA、pH 8.0サーモフィッシャー15575020

参考文献

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